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1、10申请公布号CN104152540A43申请公布日20141119CN104152540A21申请号201410095698X22申请日20140313C12Q1/6820060171申请人中国农业科学院特产研究所地址130112吉林省长春市聚业大街4899号72发明人魏海军陈秀敏杨镒峰鞠妍赵伟刚崔学哲薛海龙徐超宋兴超赵蒙李丹丽安培培曹新燕54发明名称检测梅花鹿皮肤松弛症相关基因FIBULIN5的601CG突变的试剂盒57摘要本发明涉及一种检测梅花鹿FIBULIN5基因突变的试剂盒，该试剂盒包括扩增FIBULIN5基因的试剂盒检测FIBULIN5基因突变的试剂。所属扩增FIBULIN5基因的。
2、试剂包括扩增FIBULIN5基因的PCR引物及相应的PCR反应试剂，其中所述扩增FIBULIN5基因的PCR引物是针对梅花鹿FIBULIN5基因第601位核苷酸，检测其是否存在CG突变。所述PCR引物序列包括F3825CTCTCTGTCTTCCAAGTCCCG3，R8005ACAGGTGTAGCCTCCTTCGGT3。本发明研究发现，后颈部皮肤松弛梅花鹿FIBULIN5基因第601位核苷酸发生CG突变。本发明所述引物、方法和试剂盒具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度高、准确性高等优点。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要。
3、求书1页说明书3页序列表3页附图2页10申请公布号CN104152540ACN104152540A1/1页21检测梅花鹿皮肤松弛相关基因FIBULIN5基因突变的试剂盒，其特征在于，包括（）PCR扩增反应试剂；（）用于扩增样本CDNA中FIBULIN5基因突变位点601CG的PCR引物上游引物F3825CTCTCTGTCTTCCAAGTCCCG3，下游引物R8005ACAGGTGTAGCCTCCTTCGGT3。2如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤（）采集梅花鹿皮肤进行成纤维细胞培养后，提取总RNA，反转录为CDNA；（）以该CDNA为模板，用所述用于扩增样本。
4、CDNA中FIBULIN5基因的PCR引物进行PCR扩增，PCR反应按以下条件进行扩增，得到PCR反应产物；（）对PCR反应产物测序，与FIBULIN5正常基因序列进行比较，确定是否存在第601位核苷酸发生CG突变位点。3如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤（）的PCR反应按以下条件进行扩增94C5MIN；94C3OS,58C30S,72C1MIN、30个循环；72C7MIN。权利要求书CN104152540A1/3页3检测梅花鹿皮肤松弛症相关基因FIBULIN5的601CG突变的试剂盒技术领域0001本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种梅花鹿皮肤松弛相关基因FIBULIN5基因C6。
5、01CG突变的PCR检测试剂盒。背景技术0002人类皮肤松弛症是世界罕见疾病之一，是一种获得性和遗传性结缔组织异质性疾病，其特征是松散、多余的皮肤皱褶、下垂和弹性下降等。皮肤松弛症的患者皮肤容易松弛有褶皱，看起来未老先衰。皮肤松弛病征包括X连锁、常染色体显性和隐性形式。而梅花鹿皮肤松弛症更加罕见。且这种梅花鹿产茸量极高，常常被用来作为种公鹿，但是在发情季节后颈部皮肤松弛更加严重，下垂很明显。一般认为，皮肤松弛症与遗传物质的改变有关。0003FIBULIN5FBLN5亦称为DANCEDEVELOPINGARTERIESANDNEURALCRESTEGFLIKE或EVECEMBRYONICVASC。
6、ULAREGFLIKEREPEATCONTAININGPROTEIN，是FIBULIN家族中的最新成员，是一个66万道尔顿的分子，是钙依赖性弹性蛋白结合蛋白，位于弹性蛋白微纤维表面。在弹性纤维形成过程中发挥决定性作用。FBLN5基因，定位于人染色体14Q31，广泛分布于富含弹性蛋白的组织里，属于整合糖蛋白，是一种细胞外基质蛋白，由448个氨基酸组成，有5个潜在的钙结合性表皮生长因子（EGF）样结构域。与V3和V5整合蛋白相互作用的特定细胞附着序列RGD（精氨酸甘氨酸天冬氨酸ARGINYLGLYCYLASPARTICACID）位点，位于N末端不规则EGF域，将原弹性蛋白锚定于细胞表面，这对形成弹。
7、性纤维十分关键。FIBULIN5是弹性纤维发育过程中不可缺少的基因，在弹性蛋白聚合过程中，FIBULIN5作为弹性蛋白交联排列的支架，促进弹性蛋白交联形成弹性纤维。弹性纤维90组分为原弹性蛋白，FIBULIN5能直接与原弹性蛋白结合，而原弹性蛋白还能促进FIBULIN5的表达。0004FIBULIN5基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传皮肤松弛症。如人类皮肤松弛症患者FIBULIN5基因外显子7的纯合子N679TC的突变，在BULIN5蛋白第四个EGF样结构域产生一种丝氨酸和脯氨酸代替物（PS227P）；外显子9的N945TC（RS2430347），改变了异亮氨酸315的编码，从ATT到A。
8、TC。发明内容0005本发明的目的在于，提供一种检测梅花鹿皮肤松弛症相关基因FIBULIN5基因C601CG突变的试剂盒，可用于检测FIBULIN5基因突变位点。0006检测梅花鹿皮肤松弛相关基因FIBULIN5基因C601CG突变的试剂盒，其特征在于，包括（1）PCR扩增反应试剂包括DNTP、10PCR缓冲液、MG2、DDH2O、PFU酶等；（2）用于扩增样本CDNA中FIBULIN5基因突变位点601CG的PCR引物上游引物F3825CTCTCTGTCTTCCAAGTCCCG3，下游引物R8005ACAGGTGTAGCCTCCTTCGGT3。0007进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步。
9、骤（1）采集梅花鹿皮肤进行成纤说明书CN104152540A2/3页4维细胞培养后，提取总RNA，反转录为CDNA；（2）以该CDNA为模板，用所述用于扩增样本CDNA中FIBULIN5基因的PCR引物进行PCR扩增，PCR反应按以下条件进行扩增94C5MIN；94C3OS,58C30S,72C1MIN、30个循环；72C7MIN。得到PCR反应产物；（3）对PCR反应产物测序，与FIBULIN5正常基因序列进行比较，确定是否存在第601位核苷酸发生CG突变。0008本发明试剂盒中用于扩增FIBULIN5基因的PCR引物，其中正向引物FIBULIN5的3末端位于如序列SEQIDNO1所示的FI。
10、BULIN5基因编码区上游382BP处，反向引物FIBULIN5的3端位于该编码区的下游约800BP处，正反相引物大小分别为21BP，21BP，并能扩增梅花鹿FIBULIN5基因编码区385BP。0009上述引物通过如下的方案进行设计使用PRIMER5软件协助设计引物，通过PCR扩增，将FIBULIN5编码区385BP扩增，然后进行直接测序，通过测序检测601CG位点是否发生突变。0010利用直接测序的方法，对梅花鹿FIBULIN5基因进行C601CG突变检测，突变序列如SEQIDNO2所示，对照组序列如SEQIDNO3所示。可以了解梅花鹿皮肤松弛症的致病机理，为世界罕见病皮肤松弛症的研究提供。
11、动物模型。附图说明0011图1是FIBULIN5基因用引物F382/R800扩增后，经1琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。如图所示，目的片段约为400BP。其中，从左至右泳道泳道1为TAKARA2000的MARKER，2为对照样本，3为皮肤松弛梅花鹿样本。0012图2是皮肤松弛梅花鹿样本经FIBULIN5F382/R800引物扩增后，第601碱基的测序结果。由图可知，发现皮肤松弛梅花鹿样本存在第601碱基CG突变（因为是分段设计引物，图中显示188处突变位点即是FIBULIN5基因全长中第601位点）。0013图3是正常梅花鹿样本经FIBULIN5F382/R800引物扩增后，第601碱基的测序结果。。
12、由图可知，未发现正常样本第601碱基CG突变。具体实施方式0014下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法。0015实施例I检测梅花鹿皮肤松弛症相关基因FIBULIN5的C601CG突变的试剂盒，包括（1）PCR扩增反应试剂包括DNTP、10PCR缓冲液、MG2、DDH2O、PFU酶等；（2）用于扩增样本CDNA中FIBULIN5基因C601CG突变的PCR引物F3825CTCTCTGTCTTCCAAGTCCCG3R8005ACAGGTGTAGCCTCCTTCGGT3。0016所述试剂盒的使用方法包括如下步骤（1）。
13、采集梅花鹿皮肤进行成纤维细胞培养后，提取总RNA，反转录为CDNA；（2）以该CDNA为模板，用所述用于扩增样本CDNA中FIBULIN5基因的PCR引物进行PCR扩增，PCR反应按以下条件进行扩增94C5MIN；94C3OS,58C30S,72C1MIN、30说明书CN104152540A3/3页5个循环；72C7MIN。得到PCR反应产物；反应液组成见表1表1反应液组成10PCR缓冲液5LMG21LDNTP4LPFU酶04LF382引物1LR800引物1LDDH2O376L总体积50L（3）对PCR反应产物测序，与FIBULIN5正常基因序列进行比较，确定是否存在第601位核苷酸发生CG突。
14、变。0017通过2例极少见的梅花鹿后颈部皮肤松弛症样本用所设计的FIBULIN5基因第601位核苷酸的PCR引物对FIBUIN5基因进行扩增，测序结果有C601CG突变。发现该引物具有较高的扩增稳定性、特异性。说明书CN104152540A1/3页6SEQUENCELISTING中国农业科学院特产研究所检测梅花鹿皮肤松弛症相关基因FIBULIN5的601CG突变的试剂盒33PATENTINVERSION3311337DNACERVUSNIPPONTEMMINCK（梅花鹿）1AACTTTTGGGAGTGGGTATTTTATAAGACAGTTTCAGAAGCCAGCATCCGACAGAGGACG6。
15、0GCAAAAATCTCAGAGCTTGGTTTTCCCCTTGCTTTTCCGAAAGGGCCGCAGATTTGTGTG120CCACATTTTTCTTTTCTTTTTTTAATTTAAAAAAAGAAAAAAAATTTTTTTCTTAATTTG180AGAGATCCGTTACTAGTTCGCTAGCAATTATTTTGCTGCATCGGCTGTTGGACCAGCGAA240CAAGCTAGCTGCACCTCCCGGGGCTGGATTTGCTCTATGTCTGTGTGGGATTCACAAAGG300GCATGCGACCCAGAAGTCTCGAGCCAATGAAAACTGGGGACTGCAGA。
16、CAGAAACGCATGA360TACTCACCGTGACCATACTGGCTCTCTGTCTTCCAAGTCCCGGGAATGCACAGCAACAAT420GTACTAATGGCTTTGACCTGGACCGCTCGTCAGGACAGTGTTTAGATGTTGATGAGTGCC480GGACCATCCCTGAGGCCTGCCGAGGAGACATGATGTGTGTCAACCAAAACGGCGGGTATT540TGTGCATCCCCCGAACGAACCCCGTGTACCGAGGGCCCTACTCCAACCCCTACTCGAACC600序列表CN104152540A2/3页7CCTACTCAGGTT。
17、CTTACCCAGCAGCTGCACCCCCGCTGTCCGCTCCAAACTACCCCACCG660TCTCCAGGCCTCTCATATGCCGCTTTGGATACCAAATGGATGAAAGCAACCAGTGTGTGG720ATGTGGATGAGTGTGCAACGGATTCCCACCAGTGCAACCCTACCCAGATTTGCATCAACA780CCGAAGGAGGCTACACCTGTTCCTGCACGGATGGCTACTGGCTACTCGAAGGCCAGTGCT840TAGACATTGATGAATGTCGTTATGGCTACTGCCAGCAGCTGTGCGCGAATGTTCCCGGAT。
18、900CTTATTCCTGTACATGCAACCCTGGTTTTACCCTCAACGAGGATGGAAGGTCTTGCCAAG960ATGTGAATGAGTGTGCAACTGAGAATCCCTGCGTGCAAACCTGCGTCAACACCTATGGCT1020CTTTCATCTGCCGCTGCGACCCAGGATATGAACTTGAGGATGATGGCGTTCATTGCAGTG1080ACATGGACGAATGCAGCTTCTCTGAATTCCTCTGCCAACATGAGTGTGTGAACCAGCCGG1140GCACGTACTTCTGCTCCTGCCCAGCCGGCTACATCCTGCTGG。
19、ACGACAACAGGAGCTGCC1200AGGACATCAACGAGTGTGAGCACAGAAACCACACGTGCATCCTGCAGCAGACCTGCTACA1260ATCTGCAAGGGGGCTTCAAGTGCATCGACCCCATCCGCTGTGAGGAGCCTTATCTGCGGA1320TCAGTGATAACCGCTGT13372379DNACERVUSNIPPONTEMMINCK（梅花鹿）2ACACATGTACTAATGGCTTTGACCTGGACCGCTCGTCAGGACAGTGTTTAGATGTTGATG60AGTGCCGGACCATCCCTGAGGCCTGCCGAGGAGA。
20、CATGATGTGTGTCAACCAAAACGGCG120GGTATTTGTGCATCCCCCGAACGAACCCCGTGTACCGAGGGCCCTACTCCAACCCCTACT180序列表CN104152540A3/3页8CGAACCCGTACTCAGGTTCTTACCCAGCAGCTGCACCCCCGCTGTCCGCTCCAAACTACC240CCACCATCTCCAGGCCTCTCATATGCCGCTTTGGATACCAGATGGATGAAAGCAACCAGT300GTGTGGATGTGGATGAGTGTGCAACGGATTCCCACCAGTGCAACCCTACCCAGATTTGCA36。
21、0TCAACACCGAAGGAGCTAA3793359DNACERVUSNIPPONTEMMINCK（梅花鹿）3AACTCGTCAGGACAGTGTTTAGATGTTGATGAGTGCCGGACCATCCCTGAGGCCTGCCGA60GGAGACATGATGTGTGTCAACCAAAACGGCGGGTATTTGTGCATCCCCCGAACGAACCCC120GTGTACCGAGGGCCCTACTCCAACCCCTACTCGAACCCCTACTCAGGTTCTTACCCAGCA180GCTGCACCCCCGCTGTCCGCTCCAAACTACCCCACCATCTCCAGGCCTCTCATATGCCGC240TTTGGATACCAGATGGATGAAAGCAACCAGTGTGTGGATGTGGATGAGTGTGCAACGGAT300TCCCACCAGTGCAACCCTACCCAGATTTGCATCAACACCGAAGGAGGTTACACCTGATA359序列表CN104152540A1/2页9图1图2说明书附图CN104152540A2/2页10图3说明书附图CN104152540A10。