说明书一种双功能探针及其制备方法和在检测正平行构象G-四链体中的应用
技术领域
本发明属于生物探针技术领域。更具体地，涉及一种双功能探针及其制备方法和在检测正平行构象G-四链体中的应用。
背景技术
G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的核酸二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、KRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。
G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。
目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前能够对G-四链体构象进行鉴定的探针非常少，体外实验中检测G-四链体构象主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。
近年来，香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等 领域。其苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而申请人实验室前期的工作中合成了一系列的多芳基取代咪唑类的化合物，其对正平行构象的G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将香豆素结构融合到四芳基取代咪唑结构当中，得到了新型的G-四链体探针，该探针具备高选择性识别正平行构象的G-四链体。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中G-四链体探针技术的不足，提供一种双功能探针。
本发明的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述探针在检测正平行构象的G-四链体核酸二级结构中的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种双功能探针，其结构式为：
式中R1为F或N-甲基哌嗪基，R2为F或N-甲基哌嗪基，且R1和R2不同时为氟，R3为甲氧基、二乙胺基、二甲氨基、N-甲基哌嗪基、F或H；
本发明同时提供了上述探针的制备方法，表示如下：
具体步骤为：先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物再将在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体将溶于DMSO中，加入的N-甲基哌嗪和K2CO3，反应生成将与醛基香豆素中间体及4-取代苯胺反应，得到最终产物探针。
本发明还提供了上述探针在检测正平行构象的G-四链体结构中的应用。
在上述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构：
1)将待测核酸溶于pH值7.2-7.4的缓冲液，得到溶液A；将所述探针溶解，再用pH值7.2-7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；
2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测核酸与探针的摩尔比为1～10，混合后对混合液进行紫外光谱及荧光光谱分析，或者通过酶标仪进行测试，也可以在日光下或者在紫外灯下进行肉眼观察，判断方法如下：
(a)对混合液进行紫外以及荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的紫外光谱506nm处有较强的新峰出现或者荧光发射强度增强，则待测核酸为正平行构象的G-四链体结构。
(b)用酶标仪同时检测混合溶液506nm和416nm处吸光值的比值以及525nm处的荧光强度值，若满足其中任一项数值大于某一固定值，则待测核酸为正平行构象的G-四链体结构。
(c)在日光下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在日光下有明显的颜色变化，由淡黄色变为橙色，即可判断待测核酸为正平行构象G-四链体结构；若混合液的颜色与溶液B的颜色一样或者只有非常微弱的变化，既可以判断待测核酸为非正平行G-四链体结构；在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到有明显的荧光增强，即可判断待测核酸为正平行G-四链体结构；若混合液的荧光强度与溶液B的荧光强度一样或者只有非常微弱的变化，既可以判断待测核酸为非正平行G-四链体结构；
优选地，上述判断方法(a)中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强范围为20～200倍，则待测核酸为正平行构象的G-四链体结构。
优选地，上述判断方法(b)中，若混合液的A506nm：A416nm>0.6或者FI/FI0>13，则待测核酸为正平行构象的G-四链体结构。
优选地，在上述应用中，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液；所述探针用二甲基亚砜溶解；待测核酸与探针的混合反应时间为1分钟。
本发明提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，与G-四链体结构发生特异性的作用后，紫外光谱中的最大吸收峰明显红移，产生肉眼可见的颜色变化。并且，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与某种大分子相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结 构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G四分体的平面上，进而与正平行构象的G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的核酸作用较弱。所以，将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该核酸为正平行构象的G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生紫外以及荧光光谱的改变。当核酸的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的探针制备简单，原料易得，并且结构稳定，便于储存；并且可以特异性地检测识别正平行构象的G-四链体结构，实现了正平行构象G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的紫外可见吸收光谱、荧光光谱或者酶标仪，甚至无需任何仪器，在日光下肉眼观察就可以识别出核酸样品的二级结构，检测快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。
附图说明
图1为探针6a滴定正平行构象G-四链体核酸(Pu27)的紫外光谱。
图2为探针6a滴定反平行构象G-四链体核酸(HRAS)的紫外光谱。
图3为探针6a滴定正平行构象G-四链体核酸(Pu27)的荧光光谱。
图4为探针6a滴定反平行构象G-四链体核酸(HRAS)的荧光光谱。
图5为探针6a对不同结构的DNA的紫外(A506nm：A416nm)滴定曲线图。
图6为探针6a对不同结构的DNA的荧光(FI525nm)滴定曲线图。
图7为利用酶标仪测试探针6a对200个核酸序列的紫外响应点状图。
图8为利用酶标仪测试探针6a对200个核酸序列的荧光响应点状图。
图9为探针6a Tris-HCl缓冲溶液中滴加不同二级结构的核酸样品，在肉眼观察下的颜色变化，探针浓度为5μM，待测样品为10μM。
图10为探针6a Tris-HCl缓冲溶液中滴加不同二级结构的核酸样品，在紫外灯下的荧光变化，探针浓度为1μM，待测样品为10μM。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
当本发明提供的探针分子与正平行构象的G-四链体相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子平面性增加，导致了紫外光谱和荧光光谱的显著变化。同时，该类探针的分子结构比较大，使其可以比较容易堆积在正平行构象G-四链体的G-四分体的平面上，进而与正平行构象的G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的核酸作用较弱，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同二级结构的核酸混合时，当该核酸为正平行构象的G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生紫外和荧光光谱的改变。当核酸的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。
以其中化合物6a为例来说明本发明的双功能探针在比色法以及荧光法检测正平行构象G-四链体核酸二级结构的应用。
实施例1：化合物2的合成
将2.0g 4-二乙胺基水杨醛溶于30mL无水乙醇，加入3.20g丙二酸二乙酯和1mL哌啶，80℃下反应6h。然后蒸出溶剂，加入20mL乙酸和20mL浓盐酸，继续回流反应6h，冷至室温后将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调pH至5，析出大量沉淀，减压抽滤干燥得粗品。以石油醚/乙酸乙酯(体积比1/10)作为洗脱剂通过硅胶层析纯化，得到0.81g纯品2，产率37.3％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(d,J＝9.3Hz,1H),7.24(d,J＝8.8Hz,1H),6.56(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),6.49(d,J＝1.6Hz,1H),6.03(d,J＝9.3Hz,1H),3.41(q,J＝7.1Hz,4H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H).ESI-MS m/z:218.1[M+H]+。
实施例2：化合物3的合成
在氮气保护下将1.5mL POCl3滴加到1mL DMF中，室温搅拌20min。然后将0.77g 2溶于4mL DMF滴加入到上述混合液中，60℃下反应10h，冷至室温后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调pH至中性，减压抽滤，用水和乙醇多次冲洗，真空干燥得橙黄色固体30.50g，产率58.3％:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.13(s,1H),8.26(s,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),6.64(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),3.48(q,J＝7.1Hz,4H),1.26(t,J＝7.1Hz,6H).ESI-MS m/z:246.1[M+H]+。
实施例3：化合物5a的合成
将4,4’-二氟苯偶酰溶于DMSO中(约0.15M)，加入3倍摩尔量的N-甲基哌嗪和K2CO3，在油浴90℃下加热反应20h后，加入适量乙醚，用水洗去 DMSO，用无水Na2SO4干燥，蒸出溶剂真空干燥得到黄色固体,收率为95％；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(d,J＝9.0Hz,4H),6.85(d,J＝9.1Hz,4H),3.41(t,J＝5.0Hz,2H),2.53(t,J＝5.0Hz,2H),2.34(s,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ193.59,154.84,132.14,123.32,113.21,54.58,46.84,46.05.MS(ESI+)m/z 407[M+H]+.
实施例4：化合物6a的合成
将2.5mmol化合物3、2mmol化合物5a、20mmol NH4OAc以及10mmol对甲氧基苯胺溶于5mL冰醋酸中，加热至114℃，反应20h；冷至室温后，用3mol/L的NaOH调节pH值至8，用CH2Cl2萃取(20mL×5)，合并有机层，用无水Na2SO4干燥。蒸出溶剂，得粗产物，经柱层析(CHCl3/CH3OH＝30/1)分离纯化，得到橙黄色固体，收率22％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(s,1H),7.47(d,J＝8.7Hz,2H),7.26(d,J＝6.8Hz,1H),7.01(dd,J＝16.1,8.7Hz,4H),6.81(d,J＝8.8Hz,2H),6.72(dd,J＝16.4,8.8Hz,4H),6.55(d,J＝6.6Hz,1H),6.39(s,1H),3.72(s,3H),3.39(q,J＝13.9,7.0Hz,4H),3.20(m,8H),2.57(m,8H),2.35(s,6H),1.19(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.02,158.70,156.97,151.02,150.13,149.47,145.41,142.80,137.68,131.78,130.03,129.93,129.45,128.95,128.08,126.42,121.46,115.58,115.18,113.69,112.59,108.90,108.37,97.10,55.21,55.10,55.06,48.85,48.29,46.05,44.81,12.44.Purity:98.6％by HPLC.HRMS(ESI)m/z:calcd for C45H51N7O3:369.7099[M+2H]2+,found 369.7082[M+2H]2+.
实施例5：核酸样品的检测
1.制备样品：
核酸样品：核酸样品购自英骏生物技术有限公司。将核酸适量溶于Tris-HCl的缓冲液中(pH 7.4，100mM Tris，100mM KCl)，超微量紫外测定浓度，在95℃下加热5min后缓慢冷却退火到室温作为储存液，4℃储存。
测试的核酸样品代表性序列包括：
pu27 TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG
kras AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGG
c-kit1 AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG
c-kit2 GGGCGGGCGCGAGGGAGGGG
bcl-2 GGGCGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG
htg21 GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
htg22 AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
HRAS TCGGGTTGCGGGCGCAGGGCACGGGCG
TBA GGTTGGTGTGGTTGG
G3T3 GGGTTTGGGTTTGGGTTTGGG
CGG12 CGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG
ds26 CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG
dT21 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
pu27m TGAGGAGAGTGGAGAGAGTGGAGAAGA
pu22C TTACCCACCCTACCCACCCTCA
c-kit2C ACCCTCCCTCGCGCCCGCCCG
检测G-四链体结构：
探针溶液：以化合物6a为例，先用二甲基亚砜将化合物6a配成10mM的储存液，再用Tris-HCl缓冲液(pH 7.4，100mM Tris，100mM KCl)中分别稀释成1μM或者5μM的探针溶液用于测试。
2.检测：
2.1)紫外光谱和荧光光谱检测
紫外光谱检测时，探针6a的浓度为5μM，往探针溶液中滴加不同的待测样品溶液，吹匀后，稳定1分钟，用紫外分光光度计测其紫外吸收光谱图。如果测试样品在506nm处有强的吸收峰生成，且416nm处吸收峰减色明显，则可判断待测序列形成了正平行构象的G-四链体结构，如果体系只有微弱荧光增强，则可判断待测样品为非G-四链体结构。结果如图1、2、5所示，根据上述判断标准从图中可以看出，图1为正平行构象的G-四链体结构，而图2为非正平行构象的G-四链体结构的核酸，图5中前6个序列为正平行序列，其他为非正平行构象的G-四链体。
用荧光分光光度计测定体系的荧光发射，将450nm设定为激发波长。如果体系的荧光强度急剧增强，增强范围为20～200倍，则可判断待测序列形成了正平行构象的G-四链体结构，如果体系只有微弱荧光增强，则可判断待测样品为非G-四链体结构。结果如图3、4、6所示，根据上述判断标准从图中可以看出， 图3为正平行构象的G-四链体结构，而图4为非正平行构象的G-四链体结构的核酸，图6中前6个序列为正平行序列，其他为非正平行构象的G-四链体。
待测核酸样品也可以通过酶标仪进行快速检测。用酶标仪同时检测混合溶液506nm和416nm处吸光值的比值以及525nm处的荧光强度值，若满足其中任一项数值大于某一固定值，则待测核酸为正平行构象的G-四链体结构。
上述判断方法(b)中，若混合液的A506nm：A416nm>0.6或者FI/FI0>13，则待测核酸为正平行构象的G-四链体结构。其中，FI/FI0为定义525nm处，加待测核酸样品后的荧光发射强度与没加待测核酸样品的荧光发射强度的比值，根据上述判断方法判断结果如图7、8所示。
2.2)肉眼检测
将待测样品(6a的浓度为5μM，待测样品为10μM)放在可见光下，若可以观察到样品颜色从淡黄色变成橙色，则可以判断该序列为正平行G-四链体。结果如图9所示，图中6a与Pu27、KRAS、VEGF的混合物变为橙色，从而可以判断，Pu27、KRAS、VEGF为正平行构象的G-四链体结构，而htg22、HRAS、ds26为非正平行G-四链体结构。
将待测样品(6a的浓度为1μM，待测样品为10μM)放在紫外灯下，肉眼观察。如果体系发射很强的绿色荧光，则可判断待测样品为正平行构象的G-四链体结构，如果没有明显荧光增强，则为非正平行构象的G-四链体结构。结果如图10所示，图中6a与Pu27、KRAS、VEGF的混合物存在绿色荧光，从而可以判断，Pu27、KRAS、VEGF为正平行构象的G-四链体结构，而htg22、HRAS、ds26为非正平行G-四链体结构。