取代酞菁配合物与低密度脂蛋白的复合物及其制备方法 技术领域：
本发明涉及一类取代酞菁配合物与低密度脂蛋白(Low densityLipoprotein，简写为LDL)的复合物，及其制备方法和在光动力治疗癌症中的应用。
背景技术：
利用抗癌光敏剂治疗癌症的方法称为光动力治疗。其作用过程是，先将光敏剂通过静脉注入病人体中，过一段时间后(这段等待时间是让药物在癌组织上相对富集)，用特定波长的光照射癌组织(对体腔内肿瘤可借助光纤等介入技术导入光源)，富集在癌组织中的光敏剂在光激发下，产生一系列光物理光化学反应，从而杀死癌细胞。
与传统的疗法，如外科手术、化疗、放射治疗相比，光动力学治疗最大的优点是可对癌组织进行选择性破坏而不必施行外科手术，且副作用小，因而备受瞩目。
光动力治疗的关键在于光敏剂。至今，获准在临床上正式使用的光敏剂主要为血卟啉衍生物。在美国、加拿大、德国、日本等国，使用的是Photofrin(美国FDA于1995年正式批准Photofrin用于临床治疗癌症)，它是从母牛血液中提取的并进行化学改性的血卟啉低聚物的混合物。在国内，北京医药工业研究所试生产的血卟啉注射液于1998年获卫生部批准临床试用。以上临床使用的光敏剂显示了一定地疗效，但也暴露了严重缺点，例如，最大吸收波长(380-420nm)不在对人体组织透过率较佳的红光区(650-800nm)，皮肤光毒性大，是混合物、组成不稳定等，因而临床应用受到限制，所以开发第二代抗癌光敏剂一直是国际上的研究热点。
在研究中的光敏剂中，酞菁配合物受到很大的重视。从文献检索可知：中国专利ZL961171 37.5介绍了一种取代酞菁锌配合物，二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌，具有高于血卟啉衍生物的性能。但和其它酞菁类配合物一样，其癌细胞的选择性摄取率有待进一步提高。《英国癌症杂志》(Br.J.Cancer)1990年第61卷第407-411页，E.Reddi等提出：用低密度脂蛋白作为无取代酞菁锌的药剂形式，可提高酞菁锌的癌细胞的选择性摄取率。但由于无取代酞菁锌的脂溶性太强，因而在体内滞留时间太长，会引起其它副作用。同时，该文方法给出是酞菁锌和低密度脂蛋白的混合物，而不是组成明确的酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，这对新药开发是不利的。
发明内容：
本发明的目的在于提供一类取代酞菁配合物与低密度脂蛋白的复合物，可用于光动力治疗的具有靶向功能的复合物型光敏剂。
本发明的任务是以具有光敏活性的取代酞菁配合物为基，复合上具有受体介导靶向癌细胞功能的低密度脂蛋白，形成组成比确定的取代酞菁配合物与低密度脂蛋白的复合物，可通过调整反应物的投料比，来调控复合物的组成比，在复合物中，取代酞菁配合物与低密度脂蛋白的摩尔比为150∶1至2∶1之间。
本发明的另一个目的在于提供一类取代酞菁配合物与低密度脂蛋白的复合物的制备方法。
本发明复合物型光敏剂的制备方法，包括以下主要步骤：(a)将取代酞菁配合物溶解在合适的溶剂中，配制成一定浓度的取代酞菁配合物溶液，将低密度脂蛋白溶解在缓冲溶液中，配制成一定浓度的低密度脂蛋白溶液；(b)按一定的投料比，将取代酞菁配合物溶液逐渐滴加到低密度脂蛋白溶液中，形成一反应混合物；(c)将上述反应混合物置于25-37℃下振荡或搅拌3-48小时，使取代酞菁配合物通过分子间作用力和/或键合作用与低密度脂蛋白结合成复合物，得到一混合溶液，混合溶液中包含复合物和游离的取代酞菁配合物；(d)通过凝胶渗透色谱，以缓冲溶液作为洗脱剂分离上述溶液；(e)将含复合物的洗脱组分，再经过凝胶渗透色谱，以水为流动相，脱除其中的缓冲盐；(f)将除盐后的复合物水溶液，通过真空冷冻干燥，除去水分。
步骤(d)(e)也可通过膜透析法来进行。
本发明能提供一类光敏剂，用于光动力治疗癌症。它的特别之处是：通过使具有光敏活性的酞菁配合物与受体介导靶向癌细胞特性的LDL形成复合物，将LDL通过受体介导靶向癌细胞的功能转移到取代酞菁配合物上，使取代酞菁配合物的癌细胞选择性得以提高，进而提高生物活性，其光动力生物活性高于单纯的取代酞菁配合物。
本发明所指的光动力治疗，或称光化学治疗、光动力学治疗，在体光动力治疗癌症的主要步骤是：先将光敏剂通过静脉注入病人体中，过一段时间后(这段等待时间是让药物在癌组织上相对富集)，用特定波长的光照射癌组织(对体腔内肿瘤可借助光纤等介入技术导入光源)，富集在癌组织中的光敏剂在光激发下，产生一系列光物理光化学反应，从而杀死癌细胞。本发明所指的光动力治疗还包括利用光敏剂的光动力原理治疗癌症的各种技术，本发明可作为利用光动力原理治疗癌症的各种技术中的光敏剂。
本发明所指的取代酞菁配合物包括具有以下特征的酞菁配合物：中心离子为Si4+、Zn2+、Al3+、Ga3+、Mg2+，至少具有一种取代基，该取代基可以在酞菁环平面，当中心离子为Si4+、Al3+、Ga3+时，取代基也可在轴向，所具有的取代基含有以下任何一种或多种官能团：羟基、羧基、脂基、磺基、亚磺基、巯基、氨基、亚胺基、铵基、硝基、乙氧基、葡氧基、烷基。
本发明所指的取代酞菁配合物包括二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌，2、3、9、10-四羧基酞菁锌，四羧基八氯酞菁锌，不包括酞菁锌，四磺酸基酞菁铝，磺酸基十二烷磺胺基的酞菁铝。
本发明所指的低密度脂蛋白是指人血清低密度脂蛋白，其密度处于1.006-1.063g/ml之间，分子量处于2-10×105范围内。
本发明所指的复合物包括：摩尔比为38∶1的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为15∶1的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为5∶1的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为7∶1的2、3、9、10-四羧基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为21∶1的四羧基八氯酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为9∶1的四羧基八氯酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物。
本发明溶解取代酞菁配合物的溶剂，针对具体的取代酞菁配合物可以是水、有机溶剂(乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃等)，表面活性剂水溶液，或者以上溶剂的混合溶液。溶解LDL的缓冲溶液，pH应该在7.4左右，可以是三羟甲基胺盐酸溶液(Tris-HCl缓冲液)，也可以是磷酸盐溶液，或其它缓冲体系。
本发明用于凝胶色谱分离用的凝胶，必须具备二个特征：(1)在缓冲液中稳定；(2)有合适的分子量分离范围，能将分子量为600-5000之间的取代酞菁配合物和分子量在2-10×105的复合物分离。本发明推荐使用葡聚糖凝胶(即交聚葡聚糖)或琼脂糖凝胶，例如CL-2B、Sephadex G-100、Sephadex G-50。
反应物中取代酞菁配合物与LDL的投料摩尔比，是一个关键因素。通过控制反应物中取代酞菁配合物与LDL的投料摩尔比，可以分离得到不同摩尔比的复合物。为了保证不存在游离的LDL，反应物中取代酞菁配合物/LDL的投料摩尔比应大于2。
本发明的复合物中取代酞菁与LDL之间通过分子间作用力和/或键合作用相互结合，它们之间的这种结合既能基本保持取代酞菁配合物的光敏能力，又能基本保持LDL的受体介导靶向癌细胞的功能。
具体实施方式：
以下将结合附图通过实例详述本发明
图1为本发明的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌结构示意图
图2为本发明的2、3、9、10-四羧基酞菁锌结构示意图
图3为本发明的四羧基八氯酞菁锌结构示意图
摩尔比为38∶1的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为15∶1的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为5∶1的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为7∶1的2、3、9、10-四羧基酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为9∶1的四羧基八氯酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物，摩尔比为21∶1的四羧基八氯酞菁锌与低密度脂蛋白的复合物。
实施例1
准确称取一定量的二磺基二邻苯二甲酰亚胺甲基酞菁锌(简写为ZnPcS2P2，它的结构特征见说明书附图1)溶于2％(v/v)蓖麻油衍生物Cremophor EL，20％(v/v)1.2-丙二醇，0.9％NaCl(Wt％)的水溶液。将LDL用Tris-HCl缓冲溶液配制成稀溶液。Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4，内含0.1mol/L的NaCl以维持离子强度。将含ZnPcS2P2的溶液逐渐滴加到LDL溶液中，使二者的摩尔比为180∶1。
将上述混合液置于试管，37℃振荡5小时。
将直径1.5cm长度30cm的玻璃层析柱，垂直放置，缓慢加入已充分溶胀的琼脂糖凝胶CL-2B(凝胶长度为25cm)，以pH7.4的Tri-HCl缓冲液作为洗脱剂，分离上述混合溶液，混合物被分离为两个兰色组分，收集第一组分即含复合物的洗脱组分。
为除去洗脱组分中的缓冲盐，将收集的组分再经过上述凝胶柱，用纯水为洗脱剂。使用之前，凝胶柱必须用纯水充分平衡。
除盐后的复合物经冷冻干燥2天后除去水分，得到兰色粉末。
通过蛋白染色法和紫外可见光谱法确定复合物的组成是：ZnPcS2P2/LDL的摩尔比为38∶1。
实施例2
重复实例1的过程，只是改变反应物中ZnPcS2P2投料量。减少ZnPcS2P2的加入量，使反应物中ZnPcS2P2/LDL的投料摩尔比为70∶1。最终得到的复合物的组成是：ZnPcS2P2/LDL的摩尔比为15∶1。
实施例3
重复实例1的过程，只是改变反应物中ZnPcS2P2投料量。减少ZnPcS2P2的加入量，使反应物中ZnPcS2P2/LDL的投料摩尔比为20∶1。最终得到的复合物的组成是：ZnPcS2P2/LDL的摩尔比为5∶1。
实施例4
重复实例3的过程，只是将ZnPcS2P2改为2、3、9、10-四羧基酞菁锌(它的结构特征见说明书附图2)，最终得到的复合物的组成是：2、3、9、10-四羧基酞菁锌/LDL的摩尔比为7∶1
实施例5
重复实例3的过程，只是将ZnPcS2P2改为四羧基八氯酞菁锌(它的结构特征见说明书附图3)，最终得到的复合物的组成是：四羧基八氯酞菁锌/LDL的摩尔比为9∶1
实施例6
重复实例5的过程，只是改变反应物中四羧基八氯酞菁锌的投料量，使反应物中四羧基八氯酞菁锌/LDL的投料摩尔比为35∶1，最终得到的复合物的组成是：四羧基八氯酞菁锌/LDL的摩尔比为21∶1
实施例7
实施例1制备的复合物ZnPcS2P2-LDL(摩尔比38∶1)和ZnPcS2P2，在U14宫颈癌荷瘤鼠上进行肿瘤的摄取率和光动力活性的对比试验。结果表明，U14宫颈癌组织对ZnPcS2P2-LDL复合物的摄取率是ZnPcS2P2的1.6倍。同样的测试条件下(药剂量为每Kg小鼠4.4×10-4mol，光剂量为15J/cm2，激光波长为670nm)，ZnPcS2P2-LDL复合物的抑瘤率为ZnPcS2P2的1.2倍。