真菌油孢子混剂 技术领域
本发明属于一种真菌生物农药制剂。
现有技术
真菌致病机制十分复杂，有害生物难以产生抗药性，在病虫草害控制中具有巨大潜力。真菌生防制剂是以有害生物的病原真菌为有效成分研制的生物农药，具有安全、不杀伤非目标生物等优点以及触杀性和流行性等突出特点，主要包括真菌杀虫剂、真菌除草剂、真菌杀菌剂和真菌杀线虫剂等。近年来，国际上对真菌生防制剂的研究已超过细菌类生防制剂，成为生物农药研究的热点。近10年来，国外对真菌生防制剂的研制明显加速，已注册登记100多个品种，绝大多数为真菌杀虫剂，仅绿僵菌和白僵菌制剂国际上已登记的产品有20多个，真菌除草剂和真菌杀菌剂也在逐年增加；真菌生防制剂生产技术日趋成熟。目前，由于制剂贮存稳定性较差、田间防效不稳定或成本较高限制其商品化和市场化。
粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂和乳剂是真菌生防制剂常用的剂型。真菌类农药利用活体真菌防治有害生物，作为真菌农药使用的活体真菌包括菌丝、孢子两大类，粉剂是将真菌菌丝、孢子与填充剂(如：硅藻土、淀粉、滑石粉、轻质碳酸钙、高岭土等)、抗紫外线辐射剂等添加物混合加工而成。粉剂直接喷粉后，孢子或菌丝段依靠从环境中吸收水分而萌发或重新生长。由于真菌孢子萌发或重新生长要求高湿度条件，受环境中湿度变化的影响大。因此，杀虫真菌粉剂存在难以在干燥地区和干燥的季节使用、田间应用的稳定性较差等缺陷；可湿性粉剂、乳剂、颗粒中需要添加一些表面活性剂(如拉开粉等)，高浓度表面活性剂与真菌孢子长时间接触，往往影响真菌孢子活力，使得这几种制剂贮存稳定性差、货架期短。与粉剂一样，它们对环境湿度要求高，田间防效不稳定。这些缺陷长期制约真菌农药应用。
近10多年真菌孢子油悬浮剂已发展成为一种真菌杀虫剂的新剂型：将真菌孢子分散在各种油(植物油、矿物油或复合油)中制成油悬浮剂。油能在疏水的昆虫表面展开，破坏昆虫体表蜡质层结构，使昆虫体内水分蒸发，为孢子萌发提供水分，降低孢子对环境湿度的依赖性。油悬浮剂成功地克服了真菌孢子难以在干燥环境中使用、杀虫效果受环境中湿度影响的缺陷，但油悬浮剂的成本较高，更为重要的是，油悬浮剂需要超低容量机动喷雾机进行超低容量喷雾施药，不适合绝大多数农户的常量喷雾施药习惯。
发明内容
本发明的目的是提供一种真菌油孢子混剂，在于解决目前真菌制剂中粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂和乳剂对环境湿度要求高、田间防效不稳定和贮存稳定性较差以及油剂只适合用超低容量机动喷雾机施药，对喷药器械要求较高、难以为多数农户接受等问题。
本发明的“真菌油孢子混剂”适用于通过固体发酵或液体发酵获得的真菌孢子。
本发明地具体方案是：一种真菌油孢子混剂，其特征在于它由真菌油孢子粉和分散剂组成，它以“真菌油孢子粉”与“分散剂”形式分别贮存，使用时真菌油孢子粉与分散剂混合后，直接超低容量喷雾或兑水常量喷雾、兑水超低容量喷雾，其中：
A.“真菌油孢子粉”是将含1-20％凡士林和0.01-1.0％抗氧化剂的油，按油∶真菌干孢子粉＝1∶3-100的比例采用高压超细喷雾技术或搅拌混合技术均匀地附着在真菌孢子表面，形成一薄层油膜；
B.“分散剂”是将20-85％油、75-10％水、1-10％乳化剂混合后，加工而成的乳剂。
本发明在制作“真菌油孢子粉”时，较佳方案是：将含1-20％凡士林和0.01-1.0％抗氧化剂的油，按油∶真菌干孢子粉＝1∶4-50的比例采用超细喷雾技术或搅拌混合技术均匀地附着在真菌孢子表面上，形成一薄层油膜。
本发明所述“真菌油孢子粉”是将真菌孢子粉加工成为油孢子粉，以油孢子粉的形式贮存和运输，能有效延长真菌孢子贮存时间。真菌孢子表面的油膜起到保护膜的作用，并维持孢子低的含水量，减少真菌孢子与环境中氧气的接触，油膜中含有的抗氧化剂进一步降低孢子与氧的作用，使真菌孢子代谢处于低的水平。施用后，油能有效阻挡紫外线，降低紫外线对真菌孢子的损伤，有效提高田间防效稳定性。
本发明所述“分散剂”中含有20-85％油，与油孢子粉混合加水后，油包裹真菌孢子均匀分散在水中，在施药后，可直接提供孢子萌发所需要的水分，混剂中的油还可以破坏寄主表皮脂类结构，增加表皮水分蒸发，提高真菌孢子周围环境湿度，为孢子萌发持续提供水分，从而降低孢子对环境湿度的依赖性；真菌孢子活力兼容的表面活性剂(吐温、司班等)一方面具有稳定分散剂作用，另一方面便于超低容量喷雾和常量喷雾器，既适合大面积机械施药，又适合农民一家一户小面积使用。
本发明使用时，按真菌油孢子粉与分散剂的比例为1∶1-100进行混合；优选配比是1∶2-50。
将真菌油孢子粉与分散剂混合后，直接超低容量喷雾或兑水常量喷雾、兑水超低容量喷雾。
本发明经实验获得显著成功，它具有良好的稳定性、耐热性、耐干燥性能，贮存时间延长，施药方便，既可用超低容量喷雾，也可采用常量喷雾。
实验数据一、真菌油孢子粉的热稳定性
按1∶10的比例将植物油喷到绿僵菌菌株MA102干孢子粉制成油孢子粉，5g油孢子粉和干孢子粉装入2个50ml的烧杯中分别放置在温度为26±1℃，湿度为95％、75％、55％、35％的环境放置10天后，每个样品分别混匀后，分别取出0.1g放入1.5ml的离心管，在高温(55℃)恒温水浴锅处理4小时后用0.05％吐温-80灭菌水配成3×107spores/ml浓度的孢子悬浮液，用移液枪取100ul均匀涂布在放有直径为9mm玻璃纸圆片的1/4SDA平板上，26±1℃恒温培养，设未经高温处理为对照，24小时取玻璃纸圆片用棉蓝染色后镜检，计数200-300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率，每一处理三个重复。
表1环境湿度对菌株CQMA102油孢子粉与干孢子粉热稳定性影响 环境湿度 (％) 油孢子粉萌发率(％) 干孢子粉萌发率(％) 55℃处理 对照 55℃处理 对照 95 67.1±5.9 95.4±2.1 42.4±5.2 91.2±3.6 75 80.6±3.2 94.6±1.9 65.5±3.1 95.3±2.4 55 83.4±2.4 97.3±0.8 78.7±5.2 94.6±2.1 35 86.1±5.1 96.7±2.1 84.6±3.5 95.9±1.8 未贮存 85.7±5.3 96.1±1.4 86.4±5.7 96.5±1.5
从表1可以看出：未贮存的CQMA102油孢子粉与干孢子粉热稳定性无明显差异，而油孢子粉在相对湿度≥55％环境中贮存一段时间后，其耐热性明显高于干孢子粉。如：在75％、95％的环境湿度常温贮存10天后，经过55℃恒温处理4小时，油孢子粉的萌发率分别为80.6％、67.1％，显著高于干孢子粉65.5％、42.4％的萌发率水平，孢子的热稳定性与孢子的贮存时间呈正相关，说明油孢子粉耐贮性优于干孢子粉。
实验数据二、“真菌油孢子混剂”耐紫外线特性
将7g含有10％植物油的绿僵菌油孢子粉与100ml分散剂混合后，加水稀释300倍，再用移液枪取100ul均匀涂抹在放有直径为9mm玻璃纸圆片的1/4SDAY平板上，在干燥器中干燥至表面无水膜后置于距30w的紫外灯35cm的地方垂直照射60S后，取出放入26℃恒温箱内进行培养，以孢子浓度为3×107个/ml的绿僵菌油悬浮剂、水剂和干孢子粉为对照。不同时间取出玻璃纸圆片经棉蓝染色后镜检，计数200-300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率，第一次6h检测，以后每隔3h分别检查一次萌发率。
从图1可以看出：真菌油孢子混剂耐紫外线能力接近绿僵菌油悬浮剂，经紫外线处理60s后，它们的36h的萌发率分别为82.0％和93.3％，显著高于绿僵菌水剂和干孢子粉，紫外线处理绿僵菌水剂和干孢子粉60s，培养36h后的萌发率分别为为42.1％与28.3％。
实验数据三、“真菌油孢子混剂”耐干燥特性
将7g含有10％植物油的绿僵菌油孢子粉与100ml分散剂混合后，加水稀释300倍后喷雾于东亚飞蝗翅膜上，分别放在温度为26℃、湿度为100％、92％、83％、75％的容器中，设干孢子粉与孢子浓度为3×107个/ml水剂作对照，36h后用经棉蓝染色后镜检，计数200-300个孢子，记录萌发的孢子数，计算萌发率。重复3次。
表2不同剂型绿僵菌孢子在不同湿度条件下的萌发率(％)
从表2可以看出：环境湿度为92％时，真菌油孢子混剂的萌发率分别为56.2％，显著高于绿僵菌干孢子粉和水剂在相同湿度环境中的的萌发率，干孢子粉和水剂在环境湿度为92％的萌发率分别为19.4％、23.7％，在环境湿度为83％时，干孢子粉与水剂不萌发，真菌油孢子混剂的萌发率为19.5％，说明真菌油孢子混剂的耐旱能力高于绿僵菌水剂及干孢子粉。
附图说明
图1是紫外线对不同剂型绿僵菌孢子萌发的影响图。
具体实施例
实施例1：
A.制备真菌油孢子粉：将在60L色拉油加入2.5Kg凡士林，再加入抗氧化剂(0.2Kg的抗坏血酸)搅拌混匀，加色拉油定容至100L搅拌混匀后备用。将100Kg绿僵菌CQMA102灰绿色的干孢子粉装入喷雾塔，用高压喷雾器喷入5L的备用油，形成表面颜色深绿、尘扬性低的油孢子粉。
B.制备分散剂：分别将50L色拉油、3L吐温-80、3L曲拉通、6L司班和38L水，倒入乳化机中，乳化30分钟，形成稳定的乳白色分散剂。
C.使将真菌油孢子粉与分散剂按1∶10混合后，进行超低容量喷雾。
实施例2：
A.制备真菌油孢子粉：将在60L矿物油加入10Kg凡士林，再加入抗氧化剂(0.04Kg的BHA和0.2Kg的微生E)搅拌混匀，加矿物油定容至100L搅拌混匀后备用。将100Kg白僵菌干孢子粉装入喷雾塔，用高压喷雾器喷入20L的备用油，形成尘扬性低白僵菌的油孢子粉。
B.制备分散剂：分别将20L矿物油、1.5L吐温-80、1.5羧甲基纤维素钠、2L司班和75L水，倒入乳化机中，乳化30分钟，形成稳定的乳白色分散剂。
C.使将真菌油孢子粉与分散剂按1∶20混合，加水稀释300-500倍后进行常量喷雾。
实施例3：
A.制备真菌油孢子粉：将在6.0L矿物油加入1.5Kg熔化后的凡士林，再加入抗氧化剂(0.01Kg愈疮木胶和0.01Kg磷脂)搅拌混匀，加定色拉油容至10.0L搅拌混匀后备用。将1.0K胶孢炭疽菌干孢子粉装入搅拌器中搅拌，搅拌时用喷雾器喷入0.3L的备用油，混合形成尘扬性低的胶孢炭疽菌油孢子粉。
B.制备分散剂：分别将6.0L色拉油、0.3L吐温-80、0.3L乳化剂OP、0.6L司班和2.8L水，倒入乳化机中，乳化30分钟，形成稳定的乳白色分散剂。
C.使将真菌油孢子粉与分散剂按1∶3混合，加水稀释1000-1500倍后进行常量喷雾。