抗人大肠癌单克隆抗体CAb-1轻、重链可变区基因及其应用 【技术领域】
本发明涉及一株抗人大肠癌单克隆抗体CAb-1的轻、重链可变区基因及其所编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗大肠癌的药物的应用。
背景技术
大肠癌是危害人群的常见恶性肿瘤。其发病率在欧美高居第二位，在我国排名第三，随着人们饮食结构的不断的调整，其发病率仍有上升趋势。因此研究大肠癌的诊断和治疗具有重要的意义。虽然目前核磁共振，内窥镜技术不断发展，早期大肠癌肿瘤的检出率有所提高，但临床实际检测仍存在假阳、假阴性现象，即敏感性和特异性不能让人满意。临床上大肠癌的确诊都为晚期，即使切除了原发病灶，2年的复发率仍在50％左右，可见早期的发现、诊断和治疗是关键。自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗体(McAb)相继出现，这些单克隆抗体不仅在疾病的基础研究方面发挥了积极的作用，同时也为多种难治性肿瘤的诊治带来了新地希望。目前，FdA批准用于肿瘤的治疗性抗体已有15种上市，其中针对大肠癌的单抗是靶向17-1A抗原的鼠源性单抗。该类产品进入临床试验均是应用放射性同位素直接标记鼠源性全抗或抗体的F(ab’)2片段。迄今为止，国内外用于大肠癌诊治研究的靶抗原有17-1A，TAG-72，CEA，A33等。在大肠癌单抗的制备方面，多采用传统免疫的方法来制备抗体，即以可溶性物质或培养的大肠癌细胞为免疫原。由于肿瘤抗原的变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的大肠癌单抗。我们经过长期的大量的克隆筛选，获得了一株对大肠癌呈现较好反应性和特异性的杂交瘤细胞株CAb-1，其具有较高的应用价值和开发前景。
【发明内容】
本发明的一个目的在于提供抗大肠癌的单克隆抗体CAb-1的重链可变区基因和轻链可变区基因及其编码的多肽，其重组后可表达出特异性识别和结合大肠癌相关抗原的抗体活性片段。
本发明的另一目的在于所述抗体CAb-1的基因或多肽在制备用于诊断和治疗大肠癌药物中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗大肠癌的单克隆抗体CAb-1的重链和轻链可变区基因。本发明所述的抗大肠癌单抗CAb-1重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性CAb-1单抗的杂交瘤细胞株CAb-1中克隆获的。本发明人利用设计的一套引物扩增出大肠癌单抗CAb-1的全长轻链及重链Fd基因，经过序列测定和在NCBI中BLAST比较分析后，确认所述的CAb-1重链可变区基因全长为351bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>2所示。所述的CAb-1轻链可变区基因全长为393bp，其核苷酸序列如序列表中<400>3所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，上述两个基因经重组后可表达出特异性识别和结合两株大肠癌细胞SW480，8693的抗体Fab活性片段。
对于本发明人成功克隆的大肠癌特异性单抗CAb-1抗体轻、重链可变区基因，分别应用因特网上专业性的已知抗体基因序列数据库(IMGT)和(NCBI)对所得序列进行同源性比较和其胚系基因来源分析表明，所获得的基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种抗体基因序列均不完全一致。所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。
根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述单克隆抗体CAb-1的基因及其编码的多肽在制备用于诊断和治疗大肠癌肿瘤药物中的应用。
本发明人应用一套设计的扩增引物成功地从培养的一株抗大肠癌特异性单抗CAb-1的杂交瘤细胞中克隆了其对应抗体轻、重链可变区基因。基于上述的单克隆抗体CAb-1的轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，如Fab抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白等，制备用于诊断和治疗大肠癌肿瘤的药物。基于上述CAb-1的轻、重链可变区基因所编码的多肽产物，可以交联上多种效应分子，制备用于诊断和治疗大肠癌肿瘤的药物。
【附图说明】
图1为RT-PCR扩增的抗人大肠癌单抗CAb-1轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为抗人大肠癌单抗CAb-1轻链可变区基因的测序图谱。
图3为抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区基因的测序图谱。
图4利用获得的CAb-1基因构建Fab抗体表达载体示意图。
图5由CAb-1基因构建Fab抗体的细胞(SW480)ELISA。
图6由CAb-1基因构建Fab抗体的细胞(SW480)免疫荧光。
【具体实施方式】
(一)抗人大肠癌单抗CAb-1轻、重链可变区基因的克隆
所用细胞株为本发明人以新鲜的大肠癌组织匀浆免疫小鼠，采用传统的融合方法而获得的一株高亲和力、高特异性的鼠源性抗人大肠细胞癌单抗CAb-1杂交瘤细胞株。其分泌的抗体不与CEA，17-1A，TAG-72，CEA，A33等肿瘤相关抗原结合，是针对一种分子量约为200KD左右的新肿瘤相关糖蛋白抗原。其分泌的抗体分子亚型为IgG1κ。
取处于对数生长期的CAb-1杂交瘤细胞(5×106)，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。随后以Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。然后，利用设计的一套引物分别进行扩增出该株大肠癌单抗CAb-1的全长轻链及重链Fd基因。将含有可变区基因(VH，VL)的扩增产物经1％低溶点琼脂糖凝胶电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(promegaInc)回收纯化后，凝胶电泳鉴定，参见附图1。需要说明的是，图1中所显示的扩增的大肠癌单抗CAb-1的重链FD基因是是从抗体的骨架区FR1获得的，因而其大小比含有信号肽的轻链基因要小。单抗CAb-1的轻链可变区基因是从信号肽位置处扩增的。之后，将目的片段克隆至T载体，测序分析，参见附图2，3。
Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物的反转录方案如下：20μL反应体系中依次加入1μg总RNA(2μL)，0.5ug随机引物Oligo(dT)15(1μL)，4ulMgCL2(25mM)2μL 5×dNTPs，2μL 10×缓冲液，0.5μL RNase抑制剂，加入反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用。
PCR扩增反应按常规方法进行：以上述产物为模板，分别用5对重链引物和6对轻链引物扩增大肠癌单抗CAb-1的全长轻链、重链Fd基因。反应体系为：模板cDNA 2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul，混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件：94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。
设计的CAb-1单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下：
小鼠重链V区5’端引物
VH1：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GG(AG)ATG (CG)AG CTG (TG)GT (CA)
AT(CG)CT CTT-3’
VH2：5’-GGG GAT ATC CAC CAT G(AG)A CTT CGG G(TC)T GAG CT(TG)
GGT TTT-3’
VH3：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT-3’
VH4：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GAT(AG)GT GTT(AG)AG TCT T(CT)T GT(AG)
CCT G3’
H-FR1：5′-AGG T(GC)(AC) A(GA)C T(GT)C TCG AGT C(AT)GG-3′；
小鼠重链V区3’端引物
Fd 3′：5′-AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3′；
小鼠轻链V区5’端引物
VL1：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA GAC AGA CAC ACT CCT GCT AT-3’
VL2：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA AGT GCA GAT TTT CAG-3’
VL3：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GGA G(AT)C ACA(GT)(AT)C TCG GGT
CTT T(GA)T A-3’
VL4：5’-GGG GAT ATC CAC CAT G(GT)C CCC(AT)(AG)C TCA G(CT)T C
(CT)C T(TG)G T-3’
VL5：5’-GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT G-3’
L-FR1：5′-GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC C-3′；
小鼠轻链轻链3′端引物：
Lc3′：5′-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A-3′；
假基因剔除引物
假基因5′端引物：5′-TCT GGC TAT AGT TAT ATG CAC-3′；
假基因3′端引物：5′-TGT AAG CTC CCT AAT GTG CTG-3′。
目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液5ul，混匀后4℃过夜，转化大肠杆菌JM109，筛选重组克隆三个，然后采用通用测序引物进行双向测序反应，测序结果见图2和图3。
进一步对所克隆的抗人大肠癌单抗CAb-1轻、重链可变区基因进行序列分析如下：
分别应用下列二个数据库：
http：//imgt.cines.fr：8104/cgi-bin/IMGTdnap.jv
http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，
对所得序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源，结果如下：
(1)CAb-1重链<400>1的胚系基因来源：
V-GENE：L14363 IGHV9S3*02。
D-GENE：M23243 IGHD-ST4*01。
J-GENE：V00770，IGHJ2*01。
通过FR-IMGT and CDR-IMGT分析显示：
CDR1：GGG TAT ACC TTC ACA GCC TAT GGA；
CDR2：ATA AAC ACC TAC ACT GGA GAA CCA；
CDR3：GCA AGA CGG GGG TAC GGC TAC TAC TTT GAC TAC
NCBI中同源性比较结果显示：
Request ID1067677802-5302-660581.BLASTQ3
Query＝Database：All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no
EST，STS，GSS，or phase 0，1 or 2 HTGS sequences)
Sequences producing significant alignments：(bits)
Value
gi|195813|gb|M60239.1|MUSIGHP139 Mouse rearranged anti-NP
a...452 e-124
gi|31322148|gb|AY169677.1|Mus musculus clone VG2J2.8
immun...446 e-122
gi|18307783|gb|AF393386.1|AF393386 Mus musculus clone C7
an...446 e-122
(2)CAb-1轻链<400>3胚系基因来源：
V-GENE：D00080 IGKV1-110*01。
J-GENE：V00777 IGKJ5*01。
通过FR-IMGT and CDR-IMGT分析显示：
CDR1：CAG AGC CTT GTA CAC AGT GAT GGA GAC ACC TAT
CDR2：AAA GTT TCC
CDR3：TCG CAA AGT GCA CAT GTT TCT CCC ACG
NCBI中同源性比较结果显示：
Query＝Database：All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no
EST，STS，GSS，or phase 0，1 or 2 HTGS sequences)
Sequences producing significant alignments：(bits)Value
gi|639654|gb|M32381.1|MUSIGK1025 Mus musculus(clone
10-25)...676 0.0
gi|18044163|gb|BC019760.1|Mus musculus immunoglobulin
kapp...662 0.0
gi|639660|gb|M32382.1|MUSIGK324A Mus musculus(clone
3-24)...638 e-180
上述分析结果表明：所获得的大肠癌单抗CAb-1基因序列的确来自小鼠胚系基因，和现有报道的各种其它已知抗体基因均不完全一致，是属于一种新的有功能的针对大肠癌的抗体基因。
(二)抗人大肠癌单抗CAb-1的FAb形式抗体的构建和表达
将噬粒表达载体pCOMB3中的GIII蛋白切除，与本发明所克隆的大肠癌单抗CAb-1的轻、重链可变区基因重组成可溶性FAb表达载体进行原核表达(见图4)。以人正常的大肠细胞为阴性对照，用ELISA检测表达产物-可溶性FAb的活性(见图5)，结果发现所表达的可溶性FAb小分子抗体，只特异性与大肠癌细胞结合而不与正常的大肠细胞结合。另外，以此表达的可溶性FAb小分子抗体结合上述两种细胞的免疫荧光实验(见图6)，表明所表达的可溶性FAb小分子抗体可特异性结合在大肠癌细胞的细胞膜上。
(三)抗人大肠癌单抗CAb-1轻、重链可变区基因及其编码的多肽产物在制备用于诊断或治疗大肠(结肠、直肠)癌药物中的应用。
(1)以本发明所述的轻、重链可变区基因出发，可以重构并表达成多种形式的蛋白药物，可直接用于大肠(结肠、直肠)癌的诊断及治疗。例如：(1-1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应，故在大肠癌的治疗中显示出良好的效果。(1-2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(1-3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体(见图4-6)、用一多肽(GLy4Ser)3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(1-4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)2、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)2、F(ab’)3、(ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透大肠癌组织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。(1-5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(1-6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(1-7)重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是高效，非特异毒性低，体内稳定性好，易穿透大肠癌肿瘤及体内使用较安全。(1-8)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的更高亲和力及更特异性的新抗体。
(2)以本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽及其衍生物出发，可以交联上细胞毒性药物、毒素、放射性核素、酶和生物反应调节剂等作为导向药物，也可用于大肠(结肠、直肠)癌的诊断及治疗。(2-1)抗体-核素偶联物。该偶联物可将核素有效地导向大肠癌及肠炎症组织局部，从而减少了因放疗外照射等引起的正常组织损伤及有关的不良反应，并可对大肠肿瘤进行定位诊断和导向治疗。这种方法即为放射免疫显像和放射免疫治疗。与单抗偶联的常用核素有125I，131I，111In，90Y，99Tcm，188Re和186Re等。(2-2)抗体-化疗药物偶联物。该偶联物能特异地导向大肠癌肿瘤，可减低对正常组织的损伤，减少化疗药物的毒副作用。常偶联的化疗药物如：烷化剂中的磷酸酰胺；抗代谢中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素类阿霉素、表阿霉素、柔红霉素；植物类长春新碱、丝裂霉素等。(2-3)抗体-毒素偶联物。该偶联物又称免疫毒素。其杀伤细胞作用强且不依赖于生物辅助机制。其杀伤大肠(结肠、直肠)癌肿瘤机制与放疗，化疗不同，所以一般放疗、化疗效果差的肿瘤可用，应用前景广阔。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、红豆毒素、肥皂草毒素、假单孢菌外毒素、链球菌溶血素、穿孔素等。(2-4)抗体-生物反应调节剂(BRM)偶联物。BRM单独调节机体的免疫能力和杀伤肿瘤细胞已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达大肠(结肠、直肠)癌肿瘤靶部位，其杀伤作用得不到充分发挥且有毒副作用。将BRM与单抗偶联，通过单抗携带其到达靶部位而发挥杀伤大肠癌的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。常用的BRM有INF和IL-2等。(2-5)抗体导向酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其在大肠癌肿瘤部位转化成高浓度抗癌活性药以杀伤肿瘤细胞。目前，可作为前药的有苯甲酸氢芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸丝裂霉素、葡糖苷酸柔红霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和头孢菌素氮芥等。活化酶有羧肽酶G2、碱性磷酸酶、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、β-葡糖苷酶和氨基肽酶等。(2-6)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可提高药物靶向性和疗效。
(3)另外，以本发明所述的大肠癌CAb-1单抗，还可以应用于大肠癌相关抗原的基础研究，或用于发现新的大肠癌肿瘤相关抗原或已知大肠癌肿瘤抗原的新表位。这些抗原均可进一步用于临床血清学检查，具有一定的临床诊断意义。