表达钴胺素结合蛋白的转基因植物 本发明一般涉及通过转基因植物来生产能与钴胺素(cobalamin)结合的重组蛋白，所述重组蛋白可用于1)预防和/或治疗钴胺素缺乏症，2)以及对其进行分析。
鉴定出两组蛋白具有可与维生素B12(钴胺素)特异性结合的特征，此后称之为钴胺素结合蛋白(CBP)。其中的一组由与钴胺素的同化作用相关的蛋白组成，另一组涉及与钴胺素代谢和利用相关的蛋白以及包括把钴胺素作为辅因子的酶类。人体从饮食中吸收钴胺素(Cbl)是一个复杂的过程，需要结合钴啉蛋白(HC)、内因子(IF)和钴胺传递蛋白(TC)三个连续Cbl转运因子共同参与(1-4)。这些蛋白与细菌合成的Cbl具有很强的结合能力。上述三种CBPs将自食物中吸收的Cbl提供给身体。IF是肠道中Cbl的主要结合因子，与肠道受体结合的IF-Cbl复合体导致了Cbl在血液中的内在化(3，4)。在血液中，在与Cbl相结合的组织中，TC-Cbl复合体把吸收的Cbl分配给存在于细胞膜上的一个或更多个特异性受体(2，4)。血液中与HC相结合的大量的Cbl处于循环状态(1，4)。HC的确切功能还未确定。与IF-和TC-缺乏症相比，遗传上HC缺乏并不能引起任何明显的病理学效果(6，7)。
哺乳动物中已经鉴别出两个Cbl依赖型地酶反应。将甲基丙二酰-CoA转换成琥珀酰-CoA时涉及腺苷-Cbl(Ado-Cbl)作为辅因子。甲基-Cbl是从高半胱氨酸合成甲硫氨酸时的辅因子。在本发明之前，仅仅分离出少量的CBP。由于Cbl结合因子以低浓度的形似存在于天然资源中，因此上述蛋白的纯化非常复杂(1-4)，例如分离1mg TC需要150-300升的人血浆(8，9)。可以从胃液中分离人体IF，含量为每升胃液含1mg IF。由于天然资源中存在有相对大量的HC，因此从上述资源中分离纯TC和IF也是非常复杂的。已经构建了从昆虫细胞中生产IF和TC的表达系统(10，11)，获得的重组蛋白在10-100μg的水平。我们已经在酵母中表达了人和牛的TC，在总量为1升的发酵培养基中获得了5-7mg的重组蛋白(12)。人IF已经在酵母中表达了，产量为每升发酵培养基可以获得1-4mg的IF。上述这些表达系统使用起来是非常昂贵的，并且它们提供的是CBP完整形式与脱辅基形式的混合物。上述这种混合物也恰恰是CBP在天然资源中的存在形式。完整形式是指CBP与Cbl相络合，而脱辅基形式则是指CBP不与Cbl相络合。为达到在诊断试剂盒和其它分析中使用的目的，获得纯化的CBP脱辅基形式或CBP完整形式是非常重要的。
在Schilling测试中，可以用从人胃液中分离的IF进行诊断，在上述过程中需要患者摄入分离的IF，因此存在有从IF供体向患者传播人类疾病的危险。与之相似，使用从猪中分离的IF或使用从酵母表达培养基中分离的重组人IF，由于上述培养基中含有肉类的酶水解产物，因此都存在有向患者传播动物疾病的危险。使用从植物表达系统中分离的重组人IF则可以避免了上述问题的发生。
植物体不含有Cbl或CBPs，因此含有插入基因即人IF的重组植物体仅仅表达脱辅基形式的IF，这使得植物体非常适合作为生产脱辅基形式CBPs的“工厂”，而且所生产的脱辅基形式CBPs中没有完整形式CBPs的污染。在其它真核表达系统中，重组CBP或多或少地会与Cbl进行饱和，从而产生CBP完整形式与脱辅基形式的混合物。在酶反应中，除植物以外的所有其它真核生物体都使用Cbl，因此上述真核生物体中都含有Cbl。与此相似，由于植物体天然不表达CBP，因此使用转基因植物产生的重组CBP中不会含有其它CBPs。由于两种CBPs存在于胃液中，因此从其它来源即胃液分离IF，往往在制品中含有一定的HC污染。
在植物体而非其它生物体中表达的CBPs仅仅以脱辅基的形式存在，因此植物表达系统提供了一种通过钴胺素柱进行亲和柱层析纯化CBP的机会。由于完整形式的CBP不与钴胺素柱结合，因此与其它生物体中表达的CBPs相比，植物体中表达的CBPs更加易于纯化。
植物体中表达的CBPs可以设计成含有或选择性地不含有与它们对应的天然蛋白质相同的氨基酸序列。重组蛋白中存在有转录后修饰作用，例如在半胱氨酸残基之间形成二硫键等。对于含有与天然CBPs相同氨基酸序列的CBPs而言，由于来源于植物体的CBPs能与Cbl相结合，因此预测其二硫键的定位也与之相同，重组CBPs的三级结构也与天然的CBPs相同。来源于植物体的络合有Cbl的重组人IF(rhIF)与肠受体cubilin的特异性结合支持了天然hIF与来源于植物体的rhIF具有相同的三级结构。由于糖基化作用具有细胞类型特异性，因此来源于植物体的重组CBPs的糖基化作用与其对应的天然CBPs的糖基化作用不同，来源于植物体的rhIF在糖链的糖类组成上也与天然的IF不同。
由于重组植物体的生长是低技术，而且可以通过简单地种植更多的土地来简单地大规模生产重组蛋白，因此植物表达系统对大规模生产CBP是非常有用的。植物表达系统提供了在治疗计划中大量使用重组CBP的机会，例如对吸收维生素B-12能力降低的老年人。此外，由于可用于转基因表达蛋白的许多植物种类也是人类的消费品，例如玉米、马铃薯、大麦、水稻、胡萝卜等，因此通过它们生产的CBP可以不经过或极少经过纯化即可使用。
需要寻找一条更好的途径来生产这些CBPs。
本发明提供一种转基因植物，其表达至少一种可与钴胺素和/或其类似物相结合的蛋白。“钴胺素”(Cbl)是指一种由咕啉环组成的分子，上述咕啉环含有四个吡咯单元，它们围绕并结合于必需的和中心的钴原子上。咕啉平面的下方是含有二甲基苯并咪唑碱的核苷酸衍生物，其也与钴原子相连。最后钴原子与定位于上述咕啉平面的第六个分子(例如-CH3，OH-，H2O，5’-脱氧腺苷，CN)结合。氰钴胺素是指维生素B12，但是其它钴胺素也具有相同的营养特性。不能通过动物和植物来合成钴胺素，仅仅能通过一些微生物尤其是厌氧细菌来进行钴胺素生产。“钴胺素类似物”是指其中例如核酸单元发生了改变或部分去除的钴胺素分子，例如钴啉醇酰胺(cobinamid)。钴胺素类似物也可以是与其它功能性分子例如细胞毒素相连接的钴胺素。“钴胺素结合蛋白”是能够与钴胺素结合的蛋白质，例如人类蛋白：内因子、钴胺传递蛋白、结合钴啉、甲基丙二酰-CoA变位酶和甲硫氨酸合成酶。“转基因植物”是指其中一些或所有细胞中都含有表达载体或表达载体片段的植物体。
在第一个优选实施方案中，能够与钴胺素或其类似物结合的蛋白可以是钴胺传递蛋白、内因子、结合钴啉蛋白、甲基丙二酰-CoA变位酶、甲硫氨酸合成酶中的任何一个，或者是与上述蛋白之一或其片段具有至少60％同一性的蛋白质。为了最适的比较目的可以通过序列对比(例如为最好地进行序列对比，可以在两个序列间引入间隙(gap))和在相应的位置进行氨基酸残基或核苷酸的比较以确定两个氨基酸序列或两个核酸序列同一性的百分率。“最好的序列对比”是指两个序列进行对比后可以获得最高的同一性百分率。同一性百分率也决定于进行对比的序列中相同氨基酸残基或核苷酸的数量(即：同一性％＝相同位置的数目/位置总数×100)。
可以通过使用本领域技术人员公知的数学算法确定两个序列之间的同一性百分率。比较两序列的数学算法的实例是Karlin和Altschul算法(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，Karlin和Altschul又进行了修改(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(1990)，J.Mol.Biol．215：403-410，合并了上述算法。可以采用NBLAST程序进行BLAST核酸搜索，得分＝100，字宽＝12，获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以采用XBLAST程序进行BLAST蛋白搜索，得分＝50，字宽＝3，获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为达到比较效果而获得间隙对比，可以采用Altschul等(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402描述的间隙BLAST。也可以选择使用PSI-Blast进行重复搜索，从而确定两个分子之间亲缘的远近关系(同前)。当使用BLAST、间隙BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数值，参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于序列对比的另一个数学算法的实例是Myers和Miller算法，CABIOS(1989)。作为CGC序列对比软件包一部分的序列对比程序(2.0版本)合并了上述算法。本领域已知的其它用于序列分析的算法包括了ADVANCE和ADAM，详细描述于Torellis和Robotti(1994)，Comput.Appl.Biosci.，10：3-5；以及FASTA，详细描述于Pearson和Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-8。在FASTA中，ktup为一个对照选项，用于设定搜索的灵敏度和速度。
然而，非常重要的因素在于与天然CBP具有类似序列同一性的蛋白在功能上也应该与CBP结合蛋白相同。换句话说，根据本发明所生产的蛋白能够与Cbl形成复合物，并且能够与相应的CBP受体相结合。
优选的植物体为“公认为是安全的”(GRAS)植物体。为防止与环境中具有遗传修饰物质的其它植物体发生交叉污染，可以采用仅在生命周期的第二年才产生花粉的植物体，例如胡萝卜等。
可以采用本领域已知的方法将转化的单植物细胞再生成完整植株。本发明还提供了包括细胞在内的繁殖材料或种子。本发明还涉及来源于本发明任一方面的任一植物体或其部分，其中包括了繁殖材料或种子。
本发明的第二方面提供了钴胺素结合蛋白，其是由转基因植株或转基因植株培养细胞表达。优选从植物材料中分离或纯化上述蛋白。上述蛋白可以是脱辅基形式(即不与钴胺素结合)，也可以是完整形式(即与钴胺素结合)。与通过人体或酵母等微生物体产生的相似蛋白相比，通过转基因植株产生的该蛋白具有不同的与分子附着的糖类部分。转基因植株产生的蛋白具有与人体或酵母产生的蛋白不同的表观分子量证实了上述两种蛋白在糖类含量上的差异。一旦去除蛋白的糖类基团，所有上述蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳下都具有相同的分子量。
本发明的第三方面提供了分离和/或纯化如上所述钴胺素结合蛋白或其功能片段的方法，包括下述步骤：
(a)将转基因植物材料制成匀浆；
(b)过滤将匀浆离心所形成的上清；
(c)采用钴胺素进行亲和柱层析；
(d)洗脱附着钴胺素的钴胺素结合蛋白；
(e)进行凝胶过滤；
任选地，还包括了下述步骤以生产脱辅基形式的钴胺素结合蛋白：
(f)用5M的盐酸胍(guanidine HCl)进行透析；
(g)用0.2M磷酸钠进行透析。
本发明的第四方面提供了包含本发明的钴胺素结合蛋白的组合物。钴胺素结合蛋白可以是充分纯化形式，或者通过转基因植物材料的形式提供上述钴胺素结合蛋白，其中摄入的转基因植物材料可以是原始的、未进行任何加工的，或也可以是或多或少进行过加工的，例如切片形式(chopped)、研磨形式、转基因植物材料的匀浆、液态转基因植物提取物以及部分或全部纯化的重组CBP等。
上述组合物优选药物组合物。本发明的组合物适合于任何适当的给药途径，例如口服给药途径(包括口腔或舌下给药)。可以采用药剂学上任何已知的方法制备上述配剂，例如将活性组分与载体或赋形剂相联合。
适于口服给药的药物制剂可以制成分离的单元，例如胶囊或药片；粉末或颗粒；水或非水液体的溶液或悬浮液；可食用的泡腾制剂或whips；水包油乳液或油包水乳液。
优选的单位剂量配方可以是日常剂量或亚剂量的如上面所描述的活性组分或其适当级分。
应当理解为除了上面提到的具体组分外，制剂中还应可包含，所述配剂类型相关的本领域其它常规试剂，例如适合口服给药的配剂中应当包含调味剂。重组植物CBP还可以采用与钴胺素或钴胺素类似物或含有示踪原子(或分子)的钴胺素等第二组分联合给予的形式。含有或不含有第二组分的重组植物CBP药片也可以设计成在肠道内释放CBP，从而避免了胃部的低pH值和胃蛋白酶的影响。
本发明的组合物优选口服使用的形式。
推荐的日常维生素B12剂量为2.5微克，相当于125微克的IF-Cbl或122.5微克的IF。
本发明的第五方面提供了含有本发明的转基因植物或来源于上述植物的植物材料的食品。
本发明的第六方面提供了治疗钴胺素缺乏症的方法，其包括了给与含有至少一种本发明的钴胺素结合蛋白的组合物。缺乏症可以通过给予额外数量的与维生素B12的吸收和运输相关的蛋白加以克服。这些蛋白优选钴胺传递蛋白、结合钴啉蛋白和内因子中的任意一个或多个。上述蛋白可以单独给药，也就是以脱辅基的形式，也可以与钴胺素或钴胺素类似物联合给药，也就是以完整的形式。钴胺素结合蛋白的“完整形式”是指钴胺素结合蛋白与例如钴胺素或其类似物的配体的复合体。钴胺素结合蛋白的“脱辅基形式”是指钴胺素结合蛋白即将与钴胺素或钴胺素类似物相结合的形式。
本发明的第七方面提供了本发明的CBP在诊断测试中的应用。在这种测试中，如Nexφ和Gimsing，1981，Scand.J.Clin.Lab.Invest.41：465-468，：“Insolubilized pure human intrinsic factor used for quantitation of cobalamins inserum”所描述，通过提取的生物样品与示踪的Cbl相竞争结合CBP的能力而检测例如血液中钴胺素的含量。在其它测试中，测试的目的是检测CBP，或其总量或完整形式和脱辅基形式的CBP含量。这种测试可以直接通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)来进行(Nexφ等，2000，Clinical Chemistry 46(10)：1643-1649)，也可以与去除脱辅基形式的样品预处理相结合来进行，其描述于Nexφ，1975，Biochim.Biophys.Acta，379：189-192。
本发明的另一方面提供了一种通过采用IF或其功能性片段的Schilling测验定量从肠道中吸收钴胺素的方法，其中所利用的IF或其功能性片段是从表达钴胺素结合蛋白或其功能性片段的转基因植物中分离的。例如可以采用如下方式进行“Schilling测验”：通过口服方式摄入一定剂量的具有放射性钴标记的Cbl，24小时后收集尿液，检测尿液中放射性标记Cbl级分的含量。如果在测验的第一个阶段，尿液中没有检测到放射性标记的Cbl，一周后进行第二次测验。在现在的测验中，通过口服方式一起摄入一定剂量的具有放射性钴标记的Cbl和IF，24小时后收集尿液，检测尿液中放射性标记Cbl级分的含量(Fairbanks，V.F.Test for pernicious anaemia：the“Schillingtest”Mayo Clin Proc.1983，58：541-544)。
本发明的另一方面提供了一种通过采用本发明的蛋白定量钴胺素或其类似物的方法。例如在使用标记的钴胺素或其类似物的竞争结合试验中，可以采用转基因植物产生的分离的CBP。
本发明的再一方面提供了一种采用本发明的蛋白定量CBP的方法。可以通过分离本发明的CBP，然后采用放射性标记标记与钴胺素或其类似物在竞争结合试验使用。
本发明的再一方面提供了一种采用本发明的蛋白定量钴胺素结合蛋白受体的方法。例如，rhIF可以与标记的钴胺素分子例如放射性钴胺素(cobalmin)相复合来确定肠道内IF-B12受体的数量或其结合能力。
本发明的另一方面提供了一种含有编码一个或更多个钴胺素结合蛋白的核酸的核酸构建体，其可操作地连接于一个或更多个可指导在植物体中表达的调控序列，上述调控序列例如可以是诸如35S CaMV等启动子。除诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的伸展蛋白信号肽的信号肽序列外，还可以采用Phalseolus vulgaris几丁质酶信号肽或者Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶。在优选的实施方案中核酸是指DNA序列。
本发明的再一方面提供了一种包含本发明核酸构建体的载体，其可以是质粒、粘粒或噬菌体。上述载体中通常都含有可用于选择已转染或已转化细胞的一个或更多个表达标记，优选的是用于选择包含整合有异源DNA载体的细胞。如果使用上述载体的目的是用于表达，则应包含用于驱动表达的足够的调控序列。本发明优选可以在植物细胞中表达的核酸和启动子序列。
本发明的另一方面还提供了一种含有本发明核酸序列和/或本发明载体的植物细胞。可以将上述细胞定义为“宿主”，它可用于对核酸序列进行操作，包括克隆。或者上述细胞是指其中可以表达核酸序列的细胞，最优选植物细胞。可以通过本领域已知的标准技术将核酸整合到细胞中。优选通过携带有双臂T质粒载体的农杆菌将核酸转化到植物细胞中，其是通过本领域已知的技术，例如在EP-A-0116718和EP-A-0270822中描述。或者通过放电装置或其它任何一种可以将核酸序列稳定整合到细胞中的方法将外源核酸序列直接导入到植物细胞中。本发明的核酸优选含有可用于对核酸序列进行鉴定的第二“标记”基因。这最常用于区别含有外源核酸的转化植物细胞与其它不含有外源核酸的植物细胞。上述标记基因的实例有抗生素抗性基因、除草剂抗性基因和葡萄糖醛酸苷酶(GUS)表达基因。可以通过第二启动子对标记基因的表达进行调控，其允许标记基因在所有细胞中进行表达。
优选仅仅将外源核酸引入到宿主细胞的线粒体和/或叶绿体中。核酸可以引入到细胞核或其它细胞器的基因组中，上述细胞器包括了线粒体或质体，例如原生质体、色质体和白色体。由于花粉中不含有质体或线粒体，因此仅仅将外源核酸序列引入到这些细胞器中可以阻止通过杂交授粉作用将转基因材料转移到周围环境的野生植物体中。
本发明的目的是在植物体中生产重组钴胺素结合蛋白(CBP)。由于植物体不含有或不使用钴胺素，因此植物体中表达的重组CBP全部是脱辅基形式的(不与钴胺素相络合)，而天然来源的CBP则是CBP完整形式和脱辅基形式的混合物。与利用转基因植物不同，从天然来源生产特定的CBP还需要从其它种类的CBPs中进一步纯化。此外与所有其它已知的蛋白来源相比，转基因植物还提供了一种廉价的大规模生产CBP的方法。
仅仅通过种植较大土地面积的可生产CBP的植物体，本发明即可非常简单地大规模生产大量的重组CBP。由于通过酵母或昆虫来生产CBP需要发酵罐和孵化器等高技术，因此这是一种相对廉价的方法。
使用天然来源分离CBP受到一些限制。由于血液和牛奶中TC的浓度相对较低，因此大规模分离这种蛋白是非常昂贵的。人们通常是大规模地从猪的胃液中分离IF，而较少程度地从鼠和人的胃液中进行IF分离。由于胃中还存在HC，因此当IF用于诊断试剂盒时，需要对这些CBP进行高度的纯化分离。例如在血浆的Cbl试验中，需要不与Cbl相结合的IF(FDA需求)用作结合蛋白。除上述这些问题外，采用天然资源还面临着将疾病传播给接受CBP的患者的严重危险。使用转基因植物体表达的重组CBP所生产的提取物中仅含有重组CBP，而没有其它种类的CBP。此外使用转基因植物生产的CBP也消除了将天然CBP资源中动物或人类疾病传播给患者的危险。植物表达系统还提供了将GRAS(公认为是安全的)生物体用作生产CBP的宿主的机会。
作为将转基因植物体当作表达系统生产CBPs的实例，我们已经在拟南芥中表达了人的IF和TC。我们按照(14)的描述对转基因植物体的钴胺素结合能力(CBC)进行了测试。
为了列举实例的需要本发明后面的描述将提及拟南芥。但是，应注意的是本发明所涉及的遗传转化植物并不仅限于诸如拟南芥。通过采用本领域已知的方法/技术，本发明的方法也同样能够应用于其它植物种类。
本发明的描述将参照以下实施例，但不应解释为以任何方式对本发明构成限制。
实施例具体参照以下附图：
附图1显示了编码伸展蛋白信号肽序列与成熟人内因子编码区和部分3’-非翻译区相融合的核苷酸序列。该核苷酸序列是将取自于GenBank登陆号no.AF104327的编码类似于拟南芥伸展蛋白信号肽的序列与氨基酸序列MASSSIALFLALNLLFFTTISA相融合的核苷酸序列(第7-119位)。以下划线的方式标注出该信号肽序列的甲硫氨酸起始密码子(ATG)。以粗体字母的形式显示出编码成熟人内因子的核苷酸序列(第120-1316位)，上述核酸序列取自于GenBank登陆号no.X76562。该序列之后是翻译终止密码子(TAA)和内因子mRNA的3’-非翻译区核酸序列，以下划线的方式对翻译终止密码子进行了标注。以下划线标注的限制性XbaI(第1-6位)和XmaI位点(第1425-1430位)的引入是为了便于对植物转化载体的克隆。
附图2显示了由附图1中粗体字母显示的第120-1316位核苷酸序列编码的成熟人内因子之氨基酸序列。
附图3显示了编码GenBank登陆号no.S43926的Phaseolus vulgarisCH5B-几丁质酶的第7-129位核苷酸序列，它编码具有MKKNRMMIMICSVGVVWMLLVGGSYG氨基酸序列的信号肽。上述核酸序列与附图1中粗体字母显示的编码成熟人内因子的核苷酸序列相融合。用于克隆的限制性XbaI位点以下划线的方式在位置1-6处标出，翻译起始密码子ATG以下划线的方式在位置52-54处标出。
附图4显示了编码GenBank登陆号no.M60402的Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶的第7-144位核苷酸序列，它编码具有MSTSHKHNTPQMAAITLLGLLLVASSIDIAGA氨基酸序列的信号肽序列。
上述核苷酸序列与附图1中粗体字母显示的编码成熟人内因子的核酸序列相融合。以下划线的方式标注出限制性XbaI位点(第1-6位)，和翻译起始密码子ATG以下划线的方式在位置49-51处标出。
附图5显示了编码伸展蛋白信号肽的序列与成熟人钴胺传递蛋白编码区相融合的核苷酸序列。该核苷酸序列是将取自于GenBank登陆号no.AF104327的编码类似于拟南芥伸展蛋白信号肽的序列与氨基酸序列MASSSIALFLALNLLFFTTISA相融合(第7-119位)。以下划线的方式标注出该信号肽序列的甲硫氨酸起始密码子(ATG)。以粗体字母的形式显示出编码成熟人钴胺传递蛋白的核苷酸序列(第120-1346位)，上述核苷酸序列采用GenBank登陆号no.NM 000355。该序列之后是第1347-1349位的翻译终止密码子(TAA)，将其以下划线的方式进行标注。以下划线标注的限制性XbaI(第1-6位)和XmaI位点(第1350-1355位)的引入是为了便于对植物转化载体的克隆。
附图6显示了由附图5中粗体字母显示的第120-1346位核苷酸序列编码的成熟人钴胺传递蛋白氨基酸序列。
附图7显示了人胃液中天然源内因子(o)与从转基因拟南芥植株中提取的重组人内因子(·)在结合钴胺素或钴啉醇酰胺能力上的对比。等量的上述两种蛋白分别加入到含有固定量钴(57Co)标记的钴胺素混合物中，增加非放射性标记标记的钴胺素或钴啉醇酰胺的含量，并且进行混合(X轴)。分离游离的和结合的配体，并采用gamma计数器测定附着蛋白的57Co量。计算57Co级分界限(fraction bound)相对于缺少未标记的钴胺素或钴啉醇酰胺的57Co数量界限(Y轴)。该图显示出重组IF具有与天然IF相一致的结合钴胺素的特异性，但与钴啉醇酰胺的结合并非如此。
附图8显示了如何通过在含有由SDS-PAGE分离的蛋白的Western印迹上使用抗人胃内因子的多克隆抗体和碱性磷酸酶络合的免疫球蛋白来显示内因子。收获表达重组人内因子的转基因拟南芥植株，并且在离心和对上清进行透析前采用在0.2M磷酸缓冲液中进行匀浆。为了比较，采用含有插入人内因子的转基因酵母(Pichia pastoris)来表达重组人内因子。在用20mM Tris pH8.0进行透析和分析之前，采用硫酸铵(80％w/v)对发酵培养基中形成的分泌蛋白进行沉淀。纯化的人胃内因子也用来比较。采用PNGaseF酶对每一样品的等分试样进行处理以从蛋白去除的碳水化合物。泳道：“植物IF”含有从植物体提取的蛋白；“植物IF+PNGaseF”含有用PNGaseF处理的从植物体提取的蛋白；“酵母IF”含有酵母蛋白；“酵母IF+PNGaseF”含有用PNGaseF处理的酵母蛋白；“人胃IF”含有纯化的人IF；“人胃IF+PNGaseF”含有用PNGaseF处理的纯化的人IF。箭头标示出用PNGaseF处理的三个样品去糖基化IF的45kDa条带。
印迹结果显示上述三个样品的IF糖基化形式在分子量上具有显著的区别，而去糖基化样品却含有相同分子量的成熟IF。
附图9对比了从各种来源制备的内因子在糖基化作用和分子量上的比较。PAS染色用于对糖蛋白进行显示。对自转基因植物(拟南芥)和转基因酵母(Pichia pastoris)的重组人内因子(rhIF)进行分离，并在钴胺素柱上进行亲和层析。纯化的人胃IF用来比较。将牛PAS-3进行高度糖基化并用作对PAS染色的对照。牛血清白蛋白(BSA)未进行糖基化作用，用作PAS染色的“阴性”对照。将样品进行SDS-PAGE双向(induplicate)凝胶电泳。第二块胶进行考马斯亮蓝染色。
凝胶结果显示由于转基因植物有大约50kDa的rhIF条带被PAS染色，因此重组植物体IF是经过糖基化的。
附图10显示了分离rhIF的纯化方法和用于N末端测序的蛋白片段印迹方法。将纯化的重组人内因子(rhIF)进行SDS-PAGE电泳，印迹到PVDF膜上，并且用考马斯亮蓝进行染色。通过氨基酸测序分析成熟的rhIF和被部分切割的rhIF片段(拟南芥中存在的蛋白酶酶切rhIF)。箭头标示的三个片段的N末端测序结果显示大约50kDa的片段与成熟的人胃内因子具有相同的N末端。较小的两个片段(30和20kDa)是成熟hIF在第285位氨基酸残基之前进行蛋白水解裂开的结果。
附图11显示了转基因植株对钴胺传递蛋白的表达。在含有由SDS-PAGE分离的蛋白的Western印迹上使用抗人钴胺传递蛋白(TC)的多克隆抗体和碱性磷酸酶结合的免疫球蛋白来显示TC。收获表达重组人TC的转基因拟南芥植株(9-11号)，并且在离心和对上清进行透析前采用0.2M磷酸缓冲液进行匀浆。
杂交结果显示上述三个植株中的每一个都含有预期分子量为45kDa的单一蛋白。
附图12显示了植物重组人钴胺传递蛋白(o)和植物重组人内因子(·)结合钴胺素或钴啉醇酰胺的能力。从转基因拟南芥植株中提取上述两种重组蛋白。等量的蛋白分别加入到含有固定量钴(57Co)标记的钴胺素混合物中，其混有增加非放射性标记标记的钴胺素或钴啉醇酰胺的含量(X轴)。分离游离的和结合的配体，并采用gamma计数器测定附着蛋白的57Co的含量。计算57Co级分界限相对于缺少未标记的钴胺素或钴啉醇酰胺的57Co数量界限(Y轴)。该图显示出重组人内因子和重组人钴胺传递蛋白都能够与钴胺素相结合，但不与钴啉醇酰胺相结合。
附图13显示了内因子与人肠受体蛋白cubilin的结合情况。采用仪器BIAcore 2000(Biacore AB，Uppsala，瑞典)对内因子与其受体的结合情况进行分析。Resp.Diff.的增加(Y轴)表明了内因子与cubilin之间的结合。在时间大约为100处，将含有内因子的溶液添加到固定化的cubilin中。分别从转基因植物、人胃液和猪胃中分离内因子。采用维生素B12饱和的内因子和维生素B12未饱和的内因子制品。在时间大约为600处，从溶液中去除内因子，随后进行cubilin和内因子之间的解离。结果表明与天然内因子相似，重组内因子仅在与维生素B12饱和时才与cubilin相结合，并且重组内因子的结合特性与天然内因子相似。
实施例1
如附图1所示，将编码拟南芥伸展蛋白信号肽的核苷酸序列与编码成熟人内因子的核苷酸序列(附图2)相融合。上述构建体插入到植物转化载体CRC-179中。
载体CRC-179的构建
采用EcoRI和KpnI对载体pPZP 211(Hajdukiewicz，P；Svab，Z； & Maliga，P.1994 Plant Mol.Biol.25，989-994)进行消化，采用同一套酶将pAnos序列从pGPTV KAN(Becker，D；Kemper，E；Schell，J & Masterson，R.1992 PlantMol.Biol.20，1195-1197)中释放出来并克隆到pPZP 211载体中。采用PstI和KpnI对所获得的载体进行消化并形成平端载体。将含有35S CaMV启动子的平端EcoRI和HindIII片段克隆到上述平端载体中，含有35S CaMV启动子的平端EcoRI和HindIII片段详细描述于Jefferson，RA；Kavanagh，TA &Bevan，MW.1987 EMBO J.6，3901-3907中。最终所获得的载体命名为CRC-179。
采用上述重组载体对细菌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行转化。
农杆菌的培养
采用的农杆菌株系为GV3101(pMP90)(Koncz and Schell，1986)，它携带有在XbaI-XmaI位点间克隆有编码CBP插入子的双元质粒CRC-179。插入序列显示于附图1、3、4和5中。在200ml添加有利福平(100mg/ml)、链霉素(100mg/ml)和庆大霉素(50mg/ml)的灭菌LB培养基中(每升水中含有10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠)，在28-30℃、250rpm下，将菌株培养到稳定期。按1∶200的比例对少量的过夜培养物进行稀释后继续培养16-18小时。在室温下以5500g的离心力离心10分钟来收获细菌细胞，用400ml接种培养基(10Mm MgCl2，5％w/v蔗糖和0.05％v/v Silwet L-77(LehleSeeds，Round Rock，TX，USA))悬浮沉淀细胞。
重组农杆菌用于转化拟南芥植株。
转化拟南芥植株
采用蘸花法(floral dip)(Clough and Bent，1998)转化拟南芥植株。
植株生长
在生长箱中，在白天20℃/夜晚18℃、每天保持LiCl光照18小时、湿度70％的条件下，将拟南芥植株(Col-0生态型)培养到开花阶段。在每64cm2的盆中种植20到25株植株，采用的土壤为湿土混合物，其中含有40kg soilorange和40kg soil green(Stenrφgel Mosebrug A/S Kjellerup，DK)、25升4-8mmFibroklinker(Optiroc，Randers，DK)、12升Vermiculite(Skamol，DK)和300g添加有NPK15-5-11，3-4个月的Osmocote(Scott’s，UK)。
每一植株为了获得更多的花芽，在多数植株形成第一花序原基(primarybolts)后，对花序进行修剪以减轻顶端优势从而促使多个第二花序原基同时出现。当多数第二花序原基生长到约7-13cm高时(修剪后7-9天)对植株进行蘸花(dip)处理。
将转基因农杆菌悬浮液加入到400ml烧杯中，将植株倒插到悬浮液中，以达到除莲座(rossete)外的所有地上组织都浸入为宜。轻柔搅动10-15秒后取出植株，在室温下，在密封的塑料袋中水平放置24小时。
24小时后将植株转移到生长箱中并去除塑料袋。植株生长到3-4周后，长角果变褐变干。收获种子并且使其在室温下干燥7天。
转化株的筛选
采用含有0.05％v/v Tween 20的0.5％的次氯酸钠对种子进行表面消毒处理7分钟，然后用70％酒精处理2分钟，随后用无菌水清洗3次。
为了筛选转化植株，将消毒的种子以大约每144cm22000粒的密度放置在含卡那霉素的选择平皿上，在21℃生长8-10天，每天给光16小时。选择平皿中含有1×MS培养基(Duchefa，Haarlem，NL#M 0222)、1％v/v蔗糖、0.9％w/v agar noble(Difco，Detroit，USA)和50mg/ml卡那霉素，pH值为5.7。经过筛选后，转化植株转移到生长箱中(参见植株生长)。
种植已转染植株的种子，通过western印迹分析鉴别重组植株。通过重组植株的种子所生产的新的重组植株称为IF-植株。
采用2升磷酸缓冲液对1kg 3周龄的IF-植株进行匀浆化，并且采用离心方法进行澄清。该提取物中含有100mg具有CBC的重组人IF。采用(15)描述的检测方法表明该IF具有与钴胺素结合的特异性，而其类似物钴啉醇酰胺不能通过IF相结合的特异性。附图7显示对于结合Cbl而言，来源于植物体的rhIF与天然人胃IF具有相同的特异性，但对于钴啉醇酰胺却并非如此。
采用(16)描述的方法对转基因植株进行分析，结果表明转基因植株中不含有钴胺素。上述结果表明了植物rhIF以脱辅基形式存在。对转基因植株的蛋白分析表明它们在Western印迹上被抗人IF抗体识别表达了大约50kDa的蛋白，(参见附图8、10)。对该50kDa蛋白N末端区域进行氨基酸测序表明相同序列也存在于成熟天然IF序列中(附图2)。因此从融合蛋白中进行翻译后切除伸展蛋白信号肽序列导致分泌具有正确N末端的重组IF。大约50kDa的分子量表明了上述蛋白为全长蛋白。成熟全长IF由399个氨基酸组成，预测分子量为43412 Da。对SDS-PAGE分离的印迹重组蛋白进行PAS染色表明了重组IF中含有一些糖类(参见附图9)。植物体rhIF的去糖基化作用导致了该蛋白具有大约相似的测定和预测分子量(附图8)。从Western印迹的结果可以估测出天然人IF的分子量大约比重组植株的IF大5kDa。由于糖类(carbohydrate)组合物具有组织特异性并且每一个体具有一定程度的独特性，因此天然人IF和重组植株IF之间在糖类组成上预计具有一些差异。天然和重组IF在分子量上的差别可能就是在不同糖类组成上具有差异的结果。从人胃IF、酵母表达的人IF和植物体表达的人IF中去除糖类证实了上述结果。上述3种IF蛋白的去糖基化形式具有相同的分子量(参见附图8)。
在含有纯化的来源于转基因拟南芥rhIF的Western印迹结果上，除具有成熟rhIF的50kDa条带外，还可以观察到两条较小的大约30和20kDa条带(附图10)。对上述两条带进行N末端测序的结果显示30kDa条带含有成熟人IF的N末端序列。20kDa条带含有成熟IF位于甘氨酸-285处的N末端序列。含有氨基酸残基1-284的片段的预测分子量为30612 Da，含有氨基酸残基285-399的片段的预测分子量为12817 Da。测定分子量20kDa与预测分子量12817 Da之间的不一致性很可能是由于含有285-399位氨基酸残基的片段在4个潜在N-联合糖基化作用位点一个或多个位点发生了糖基化作用的结果。PAS染色也识别出20kDa条带，表明在该片段中也存在一些糖基化作用。虽然在30kDa片段中也存在有一个潜在的N-联合糖基化作用位点，但在PAS染色中并未观察到该30kDa片段。这与含有氨基酸残基1-284的片段在测定和预测分子量之间无差异是相一致的。
附图13显示了与维生素B12相复合的植物rHIF与人肠受体蛋白cubulin相结合的情况。脱辅基形式的rHIF不与cubulin受体相结合。作为比较，结合形式的人胃IF和猪IF也都仅在完整形式时才能够与cubulin受体相结合。这些结果表明来源于植物体的重组人内因子在与受体结合方面具有与天然胃内因子相同的特性。
实施例2
构建含有编码自Phaseolus vulgaris几丁质酶CH5B信号肽苷核酸序列与编码成熟人内因子核苷酸序列相融合的载体构建体，并用上述载体构建体转化拟南芥(附图3)。该构建体用于生产转基因拟南芥植株。由于这些植株显示包含与多数伸展蛋白-IF植株相同水平的CBC，因此对于内因子表达的信号肽的选择并不仅仅局限于单一的序列。
实施例3
构建含有编码Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶信号肽核苷酸序列与编码成熟人内因子核苷酸序列相融合的载体构建体，并用上述载体构建体转化拟南芥(附图4)。该构建体用于生产转基因拟南芥植株。由于这些植株显示包含与多数伸展蛋白-IF植株相同水平的CBC，因此对于内因子表达过程的信号肽的选择并不仅仅局限于单一的序列。
从实施例1-3中IF-植株获得的结论
对我们已检测的来源于植物的重组人IF而言，含有成熟N端序列的天然人胃IF相同的性质，可为抗-IF抗体识别，可与钴胺素结合，不与钴啉醇酰胺结合，可与肠受体相结合，并且存在糖类成分。胃液中的IF与其它CBP、结合钴啉蛋白和从食物中获得的一些钴胺素一起存在，与此相比，转基因IF-植株中只含有IF而不含有钴胺素或其它CBP蛋白。来源于转基因植株的IF具有与人胃IF不同的糖基化作用。来源于人胃黏膜的IF与来源于植物体的IF相比，另一个差别在于来源于植物的IF以脱辅基的形式存在，而来源于人类的IF则是脱辅基形式和完整形式的混合物。
实施例4-TC-植物
1kg采用伸展蛋白-钴胺传递蛋白构建体转化的转基因拟南芥(TC-植物)提取物(附图5)中含有20mg具有CBC的重组人TC。Western印迹结果表明单一的大约45kDa的条带与抗人TC抗体发生反应(附图11)。具有409个氨基酸残基的成熟TC(附图6)的预测分子量为45536 Da，表明测定分子量和预测分子量相似。上述结果表明植物表达系统能够产生预期大小的重组人TC和具有CBC。
按照(16)描述的方法对转基因植株进行了分析，结果表明转基因植株中不含钴胺素。这也表明了重组人TC是以脱辅基(apo-form)的形式存在。与rhIF相似，从植物体获得的rhTC也能够与Cbl结合，而不与钴啉醇酰胺相结合(附图12)。N末端氨基酸测序结果表明自在天然人钴胺传递蛋白中发现的产生正常成熟N末端的分泌的rhTC去除伸展蛋白信号肽。
实施例5从植物体中纯化重组内因子
将1kg原始植物材料切碎并用2升、pH7.5的0.2M磷酸钠缓冲液制成匀浆。上述匀浆在4000rpm下离心10分钟，并在布氏漏斗上用Watman滤纸进行过滤。滤液可以在此阶段以冷冻的形式进行保存。按照前述的方法(Nexo，E.，1975 Biochim.Biophys.Acta 379，189-192)采用亲和基质从溶液中吸收内因子。从柱上进行洗脱后，将内因子(用钴胺素饱和＝完整形式)进行凝胶过滤，用水进行透析并冷冻干燥。制备未被钴胺素饱和的内因子(＝脱辅基形式)需要额外的步骤：用5M盐酸胍透析2天，随后用pH7.5，0.2M的磷酸钠缓冲液进行透析。
参考文献
1 Allen，R.H.(1975)Prog.Hematol.9，57-84.
2 Rothenberg，S.P.，and Quadros，E.V.(1995)Bailliere S Clin.Haematol.8，499-514.
3 Nicolas，J.P.，and Gueant，J.L.(1995)Bailliere S Clin.Haematol.8，515-531.
4 Nex，E.(1998)in Vitamin B12 and B12-Proteins(Krutler，B.，Angoni，D.，and Golding，B.T.，eds)pp.461-475，Wiley-VCH，Weinheim，Germany.
5 Hall，C.A.，and Begley，J.A.(1977)Am.J.Hum.Genet.29，619-626.
6 Katz，M.，Mehlman，C.S.，and Allen，R.H.(1974)J.Clin.Invest.53，1274-1283.
7 Li，N.，Rosenblatt，D.S.，Kamen，B.A.，Seetharam，S.，and Seetharam，B.(1994)Hum，Mol，Genet.3，1835-1840.
8 VanKapel，J.，Loef，B.G.，Lindemans，J.，and Abels，J.(1981)Biochim，Biophys.Acta 676，307-313.
9 Quadros，E.V.，Rothenberg，S.P.，Pan，Y.C.，and Stein，S.(1986)J.Biol.Chem.261，15455-15460.
10 Gordon，M.，Chokshi，H.，and Alpers，D.H.(1992)Biochim.Biophys.Acta l132，276-283.
11 Quadros，E.V.，Sai，P.，and Rothenberg，S.P.(1993)Blood 81，1239-1245.
12 Fedosov，S.N.，Berglund，L.，Next，E.，and Petersen，T.E.(1999)J.Biol.Chem.274，26015-26020.
13 Wen，J.，Kinnear，M.B.，Richardson，M.A.，Willetts，N.S.，Russell-Jones，G.J.，Gordon，M.M.，and Alpers，D.H.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1490，43-53.
14 Nex，E.and Andersen，J.(1977)Scand.J.Clin.Lab.Invest.37，723-728.
15 Stupperich，E.And Nex，E.(1991)Eur.J.Biochem.199，299-303.
16 Nex，E.And Gimsing，P.(1981)Scand.J.Clin.Lab.Invest.41，465-468.
17 Clough，S.J.，and Bent，A.F.(1998)Plant J.16，735-743.
18 Koncz，C.，and Schell，J.(1986)Mol.Gen.Genet.204，383-396.
19 Nex et a1.2000，Clinical Chemistry 46(10)：1643-1649.
20 Nex，1975，Biochim.Biophys.Acta，379：189-192.