一种链霉菌重组表达载体的构建及应用.pdf

本发明公开了一种链霉菌重组表达载体的构建及应用，属于基因工程领域。本发明提供的链霉菌表达载体，方便外源基因的插入及防止转录通读在载体上添加多克隆位点和终止子，且能够在三种链霉菌中大量分泌表达TGase。

1.  一种链霉菌重组分泌表达载体，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的载体pISG86为出发载体，在其上设计连接了序列如SEQ ID NO.1所示的启动子及信号肽、序列如SEQ ID NO.2所示的多克隆位点及终止子，构建了链霉菌高效分泌表达载体。

2.  一种构建权利要求1所述重组分泌表达载体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)扩增启动子及信号肽序列后通过KpnI、BglII双酶切处理，并连接至相同酶切处理后的载体pISG86，得到pISG86-1；
(2)以pISG86-1为模板，以序列如SEQ ID NO.6、7所示的引物对，通过重叠PCR将多克隆位点序列及终止子序列连接至pISG86-1的信号肽下游，获得载体pSG01；以pSG01为模板，分别以序列如SEQ ID NO.8、9所示的引物对，序列如SEQ ID NO10、11所示的引物对，进行PCR，对pSG01进行密码子优化得到链霉菌高效分泌表达载体pSG02。

3.  权利要求1所述重组分泌表达载体在以链霉菌为宿主进行重组表达中的应用。

4.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述链霉菌为Streptomyces lividans TK24，Streptomyces lividans 1326或Streptomyces griseus。

5.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组表达谷氨酰胺转胺酶。

6.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组表达苯丙氨酸脱氨酶。

7.  根据权利要求3所述的应用，其特征在于，重组表达氨肽酶。

一种链霉菌重组表达载体的构建及应用
技术领域
本发明涉及一种链霉菌重组表达载体的构建及应用，属于基因工程领域。
背景技术
链霉菌属革兰氏阳性细菌，作为基因工程受体菌有其自身的优越性：首先，利用链霉菌进行工业化规模生产抗生素的历史悠久，在工业规模发酵技术方面已积累了相当丰富的经验，因而可利用现有的技术及设备生产链霉菌表达的外源基因产物：其次，链霉菌相比于枯草芽孢杆菌产生的胞外酶较少，可防止外源蛋白被降解。胞外分泌系统发达，可用于外源基因的分泌表达，简化外源基因产物的分离和纯化；同时，对链霉菌的分子遗传学研究的长足进展，特别是有关链霉菌质粒的分子生物学、链霉菌启动子、链霉菌蛋白质分泌的信号序列等方面研究的综合进展。给外源基因在链霉菌中的表达提供了理论基础。在链霉菌中表达的蛋白质常常是可溶性的，因此就无需为了获得具有生物活性的蛋白质而使表达的蛋白重新溶解并折叠成正确的构型；最后，链霉菌作为基因表达的受体，其致病性小。链霉菌成为继大肠杆菌、枯草芽孢杆菌之后又一个有价值的基因表达的宿主菌。
已有大量有关真核基因及一些非链霉菌来源的原核基因在链霉菌中表达的报道。如人胰岛素Glucagon(Qi.et al.,J.Microbiol.Biotechnol，2008,1076–1080.)，曲霉木聚糖酶Xylanase(Díaz et al.，2004,Appl.Microbiol.Biotechnol.,401–406.)，链球菌溶栓酶streptokinase (Pimienta et al.，2007，Microb.Cell Fact.6,20.)。
虽然链霉菌的克隆体系已建立得较为完善，然而能与大肠杆菌操作中相比拟的用于基因表达的启动子和载体还很有限。因此，探索发现新型启动子并构建表达载体，对于拓展链霉菌表达系统很有意义。
本发明提供的链霉菌表达载体，方便外源基因的插入及防止转录通读在载体上添加多克隆位点和终止子，且能够在三种链霉菌中大量分泌表达TGase。
发明内容
本发明以载体pISG86(SEQ ID NO.3)为出发载体，在其上设计连接了序列如SEQ ID NO.1所示的启动子及信号肽、序列如SEQ ID NO.2所示的多克隆位点及终止子，构建了链霉菌高效分泌表达载体。
本发明还提供一种构建所述分泌表达载体的方法，主要包括以下步骤：
(1)扩增启动子及信号肽序列后通过KpnI、BglII双酶切处理，并连接至相同酶切处理后的载体pISG86，得到pISG86-1；
(2)以序列如SEQ ID NO.6、7所示的引物，以pISG86-1为模板，通过重叠PCR将多克隆位点序列及终止子序列连接至pISG86-1的信号肽下游，获得序列正确的载体pSG01；以pSG01为模板，分别以序列如SEQ ID NO.8、9所示的引物对，序列如SEQ ID NO10、11所示的引物对，进行PCR，对pSG01经密码子优化得到链霉菌高效分泌表达载体pSG02。
本发明提供的表达载体，在表达外源蛋白TGase时，与链霉菌内常用的强启动子红霉素启动子P_ermE*相比，表达量更高，说明该启动子可作为一种强启动子在链霉菌内表达其他外源蛋白。此外，本发明构建的载体可以在S.lividans TK24，S.lividans 1326及S.griseus内成功表达TGase，说明该表达载体具有在这三种链霉菌中表达其他外源蛋白的潜力。
附图说明
图1pSG02-TGase在链霉菌S.lividans 1326中表达的蛋白电泳图谱，(a)pSG02-TGase在链霉菌S.lividans 1326中表达的蛋白电泳图谱，(b)pSG03-TGase在链霉菌S.lividans 1326中表达的蛋白电泳图谱。
图2pSG02-TGase在三种链霉菌中的表达。
图3苯丙氨酸脱氨酶、氨肽酶通过pSG02在S.lividans TK24内表达的蛋白电泳图谱；(a)氨肽酶，(b)苯丙氨酸脱氨酶。
具体实施方式
以下实施例涉及的有关方法：
TGase酶活测定方法：比色法测定酶活。用α-N-CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟胺酸做标准曲线。1个单位TGase酶活定义为：37℃每分钟催化底物形成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟胺酸的酶量(U/mL)。酶活测定条件：37℃条件下反应10min。
苯丙氨酸脱氨酶(PAL)酶活测定方法：取适量发酵上清与225μL的Tris-HCL buffer(25mM，pH 8.0)、250μL底物L-苯丙氨酸混合，反应总体积为500μL。40度反应30min，加500μL甲醇终止反应。酶活单位定义：40℃每分钟生成1mM的反式肉桂酸需要的酶量为一个酶活单位。
氨肽酶(BSAP)酶活测定方法：取适量发酵上清与4mmol/L的底物aminoacyl-p-nitroanilines混合，37℃反应10min，405nm下测定吸光值，酶活单位定义：37度每分钟形成1μmol对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。
实施例1载体pSG02-TGase和pSG03-TGase的构建
设计引物(P1/P2)扩增启动子信号肽序列后酶切(KpnI/BglII)连接至载体pISG86；在 此基础上通过全质粒PCR的方法(P3/P4)将MCS和fd-ter插入到信号肽的下游。之后利用定点突变(P5/P6)将信号肽序列中的第7位的亮氨酸稀有密码子TTA突变为CTG，第21位氨基酸丝氨酸的编码基因AGC突变为GCC(P7/P8)，获得载体pSG02，大小为6.6kb。以S.hygroscopicus WSH03-13基因组为模板，设计引物获得TGase基因片段，通过酶切连接至pSG02，获得TGase表达载体pSG02-TGase。以载体pISG86为模板，通过PCR方法(P9/P10)获得P_ermE*启动子片段，通过全质粒PCR的方法以P_ermE*启动子替换pSG02的启动子，并连接TGase基因获得载体pSG03-TGase。
P1：5’-CGGGGTACCGCCAGGAGCAGGGGAACGC-3’
P2：5’-GAAGATCTGGCATGGCTGACCGACGGC-3’
P3：
5’-GGAGTCATGCCGTCGGTCAGCCATGCCATCGATTTTAAAGGATCCGTTAACAAGCTTCCCGGGTAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGTCACGCGCCCAACGGCGGCG-3’
P4：
5’-GGGCCCACGCCGCCGTTGGGCGCGTGACTCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGTATCGGTTTACCCGGGAAGCTTGTTAACGGATCCTTTAAAATCGATGGCATGGCTGACCGACGGC-3’
P5：5’-GGAGTCATGCCGTCGGTCGCCCATGCCATCGATTTTAAAGGATCC-3’
P6：5’-CCTTTAAAATCGATGGCATGGGCGACCGACGGCATGACTCCAGCGGTG-3’
P7：5’-ATGTACAAGCGTCGGAGTCTGCTCGCCTTCGCCACTGTGAG-3’
P8：5’-CAGTGGCGAAGGCGAGCAGACTCCGACGCTTGTACATGAAAATCG-3’
P9：5’-CCACAACAAGGGAGTCACCGATTTTCGGTACCAGCCCGACCCGAGC-3’
P10：5’-CGAGTAAACTCCGACGCTTGTACATAGATCTGCAGCCAAGCTTGC-3’
实施例2TGase的表达
将pSG02-TGase和pSG03-TGase分别转入S.lividans 1326内，获得重组菌S.lividans1326/pSG02-TGase和S.lividans 1326/pSG03-TGase。将重组菌在种子培养基中37℃、200rpm培养2天，以2％的接种量转至发酵培养基中37℃、200rpm培养6天，每隔6h取样，获得最大酶活。另外将pSG02-TGase转至S.lividans TK24及S.griseus中按相同的条件培养。
重组菌S.lividans 1326/pSG02-TGase在大约24h开始表达酶原proTGase，随着培养时间的延长，proTGase逐渐被活化为TGase，在84h时获得的TGase的量最大，对应酶活为9.62U/ml(图1a)；而S.lividans 1326/pSG03-TGase在84h时获得最大表达量，对应酶活为4.6U/ml(图1b)。通过比较两种重组菌中TGase的表达量可知：本发明提供的启动子在表达TGase时优于链霉菌中常用的红霉素启动子P_ermE*，可作为一种强启动子用于以链霉菌为宿主的重组 表达。另外，为了评估表达载体pSG02的宿主通用性，将pSG02-TGase分别转入链霉菌宿主S.lividans TK24及S.griseus中，TGase在上述两种宿主获得表达，对应酶活为7.6U/ml和6.84U/ml。该结果说明了重组载体pSG02-TGase能够应用于不同的链霉菌属宿主菌(图2)。
实施例3PAL与AP的表达
将来源于粘红酵母的编码苯丙氨酸脱氨酶的基因PAL、来源于枯草芽孢杆菌的编码氨肽酶的基因AP通过酶切连接的方式分别连接至载体pSG02，构建得到载体pSG02-PAL，pSG02-BSAP，分别转入S.lividans TK24内表达。培养条件与重组菌S.lividans1326/pSG02-TGase一致。培养84h获得2.82U/mL氨肽酶和20.6U/mL苯丙氨酸脱氨酶。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。