黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用技术领域
本发明涉及黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用，属于分子生物学技术
领域。
背景技术
黄瓜是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。利用雌性系育成的黄瓜杂交种具有早熟、丰
产的特点。另外，利用雌性系配制一代杂种，可大大降低制种成本，提高制种的纯度。但是，
由于我国缺乏相应的雌性系种质资源，利用常规育种手段把国外雌性源回交转育成国内密刺
黄瓜类型和华南型黄瓜类型的雌性系，育种周期长，费工费时。而且，黄瓜性型的表达还受
到环境条件的影响，依靠人工进行表型选择还存在不够准确的问题。这些问题的存在，使得
黄瓜雌性系的选育进展缓慢，影响了黄瓜雌性系育种的进程。而基于基因型选择的现代分子
标记辅助育种技术，可以大大提高性状选择的效率，加速育种进程。
近年来研究发现，乙烯合成基因是黄瓜性别决定的关键基因。黄瓜的乙烯合成酶基因
ACS1和ACS2分别是决定黄瓜性别分化的F基因和M基因。另外，研究还发现黄瓜性别表达
与乙烯信号应答基因如受体基因ETR1、EIN3等的表达相关。因此，从与黄瓜雌性表达相关
的关键基因入手，筛选用于黄瓜性型鉴别的分子标记，辅助黄瓜雌性系育种具有重要意义。
单核苷酸多态性(singlenulceotidepolymorphism,SNP)是继限制性片段长度多态性
RFLP、扩增片段长度多态性AFLP和微卫星标记SSR之后的新一代分子标记。它具有分布广、
密度高、多态性丰富等特点，而且能直接反应植物基因水平上的差异。InDel
(insertion-deletion)插入缺失标记，指的是两种亲本在全基因组中的差异，相对另一个
亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。本发明是在黄瓜雌性
系及其近等基因系重测序的基础上，开发用于黄瓜雌性系选择的SNP/InDel分子标记。前人
的研究认为，通过黄瓜基因组中ACS1拷贝数的分析，即可判断雌性与否，但也有研究结果
与此相悖。
因此，开发新的黄瓜雌性系分子标记，对于鉴定不同来源的雌性系材料和黄瓜雌性系的
辅助选择具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用。
本发明技术方案如下：
黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记，均位于6号染色体上编码黄瓜乙烯合成酶
基因ACS1/Csa6G496450的起始密码子上游800～1300bp区间内；
SNP1位于6号染色体的24216638bp位置，非雌性系材料为A，纯雌性材料为G；
SNP2位于6号染色体的24216699bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为T；
SNP3位于6号染色体的24216739bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；
SNP4位于6号染色体的24216776bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为A；
SNP5位于6号染色体的24216813bp位置，非雌性系材料为C，纯雌性材料为T；
SNP6位于6号染色体的24216843bp位置，非雌性系材料为CA，纯雌性材料为TG；
SNP7位于6号染色体的24216848bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为A；
SNP8位于6号染色体的24216875bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；
SNP9位于6号染色体的24216958bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；
InDel1位于6号染色体的24216613bp位置，非雌性系材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTTT
的缺失，纯雌性材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入；
InDel2位于6号染色体的24216849bp位置，非雌性系材料为GG的插入，纯雌性材料
为GG的缺失；
InDel3位于6号染色体的24216973bp位置，非雌性系材料为T的插入，纯雌性材料为
T的缺失；
InDel4位于6号染色体的24217018bp位置，非雌性系材料为TAATGG或者TGATGA的插
入，纯雌性材料为TAATGG或者TGATGA的缺失。
检测上述SNP标记与InDel标记的检测引物，检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如
SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
上述SNP标记与InDel标记在黄瓜雌性系品种鉴定中的应用。
上述应用，步骤如下：
(1)提取待测黄瓜基因组的DNA；
(2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用SNP标记与InDel标记的检测引物进行PCR
扩增反应；
(3)检测扩增产物，根据SNP标记或InDel标记判断待鉴定品种为纯雌性材料或非雌
性系材料。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体如下：
10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，
10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的扩增程序为：
先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循环降退火温度1℃，
45s，72℃延伸1min；
然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。
上述与黄瓜雌性相关的SNP标记与InDel标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。
有益效果
1、本发明首次发现位于编码黄瓜乙烯合成酶基因ACS1/Csa6G496450的起始密码子上
游800～1300b区间处存在9个与黄瓜雌性相关的SNP标记(SNP1～SNP9)和4个InDel标
记(InDel1～InDel4)，通过任一SNP标记或InDel标记均可以鉴别出黄瓜雌性与否。
2、本发明所述鉴定方法可替代传统的以表型观察判断的方法，可以在黄瓜苗期和室内
进行，比在田间开花坐果期人工观察便捷，可用于大规模筛选育种材料，节约土地和成本，
大大加速黄瓜育种进程，使结果更加准确可靠。
3、本发明通过基因组重测序分析，在黄瓜ACS1基因的上游序列中发现多个雌性相关
SNP和InDel位点，并通过一对引物的扩增就可得到这些变异位点的序列信息，而且通过验
证发现在不同雌性源材料中分析结果一致。因而，本发明能够很好的鉴定不同来源的雌性系
材料，能够用于不同来源的雌性系材料的辅助选择。
附图说明
图1黄瓜雌性和非雌性系基因组DNA电泳检测图；
图中：1，AZ-1；2，BB；3，X8-2；4，A10h；5，A86h；6，M16；7，YN；8，A72；9，
ZQ3；10，SJ11；11，MC8-3；12，Cuilong；13，BM28；14，DL102。
图2黄瓜雌性和非雌性系PCR产物电泳图：
图中：所用分子marker为DL2000,共有6个条带，大小依次为2000bp,1000bp,750bp,
500bp,250bp,100bp，扩增产物对应的条带为750bp。
图3实施例1中黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩增序列比对及SNP标记、InDel标记。
图中：M16、日本黄瓜类型的雌性源材料；BB、白黄瓜，华南类型非雌性系；AZ-1、华
北型非雌性系；X8-2为华北型的新泰密刺,非雌性系；MC8-3、X8-2回交转育的雌性系；A86h、
AZ-1回交转育的雌性系；A10h、BB回交转育的雌性系；A72、密刺类型的雌性系；SJ11、欧
美水果黄瓜类型的雌性系；ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系；YN、华南类型黄瓜雌性系；Cuilong、
华南类型黄瓜杂交种，为青岛农科院品种；DL102、华北类型杂交种，山东农科院品种；BM28、
华北类型杂交种，天津德瑞特种业有限公司。
图4实施例2中黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩增序列比对及SNP标记、InDel标记。
图中：Zhongnong26为华北类型杂交种；Qingyan2，华南型杂交种；Jinchun2，密刺类
型杂交种；Jinyou35，密刺类型杂交种。
图5实施例1所述为X8-2开花期照片，为田间观察结果；
照片显示雄花多于雌花，证明样品为非雌性材料；
图6实施例1所述为雌性源M16开花期照片，为田间观察结果；
照片显示该植株节节着生雌花，证明样品为纯雌性材料。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
检测品种来源：
M16、日本黄瓜类型的雌性源材料,来源于国家种质库；
BB、白黄瓜，华南类型，来源于山东海阳地方品种；
AZ-1、华北型，来源于山东地方品种；
X8-2、华北类型，来源于新泰密刺黄瓜；
MC8-3、X8-2回交转育的雌性系；
A86h、AZ-1回交转育的雌性系；
A10h、BB回交转育的雌性系；
A72、密刺类型的雌性系，来源于山东农科院蔬菜花卉研究所；
SJ11、欧美水果黄瓜类型的雌性系，来源于波兰农科院；
ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系，来源于德瑞特种业有限公司；
YN、华南类型黄瓜雌性系，来源于山东农科院蔬菜花卉研究所；
Cuilong、华南类型黄瓜杂交种，来源于青岛农科院；
DL102、华北类型杂交种，来源于山东农科院；
BM28、华北类型杂交种，来源于天津德瑞特种业有限公司；
Zhongnong26、华北类型杂交种，来源于中国农科院；
Qingyan2、华南型杂交种，来源于青岛农科院；
Jinchun2、天津黄瓜研究所密刺类型杂交种；
Jinyou35、天津黄瓜研究所密刺类型杂交种。
上述品种均为现有已知品种。
实施例1
2014、2015两年夏季分别种植纯雌系材料8个(A10h，A86h-1，M16，A72，ZQ3，SJ11，
MC8-3，YN)、非雌性材料3个(AZ-1，BB，X8-2)及杂交种3个(Cuilong，BM28，DL102)，
取性型稳定的纯雌性材料和非雌性材料及杂交种的幼嫩叶片进行DNA提取，然后进行PCR扩
增和分子标记检测分析。具体步骤如下：
DNA提取：使用天根生化科技(北京)有限公司生产的快捷型植物基因组DNA提取系统
(DP321)。
1.处理材料：
取黄瓜幼嫩叶片100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液FP1和6μl的RNase
A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。
2.加入130μl缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。
3.12,000rpm(13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。
4.可选步骤：将上清液再次12,000rpm(13,400×g)离心5min，将上清转移至新的
离心管中。
5.向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。(例
如500μl的上清液加350μl异丙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃上清，保
留沉淀。
6.加入600μl70％乙醇，涡旋振荡5sec，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃上
清。
7.重复步骤6。
8.开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇。
9.加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴10～60min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，
最终得到黄瓜样品DNA溶液。
DNA纯度和浓度检测
(1)将黄瓜样品DNA溶液稀释10倍后,取4μlDNA样品加入2μlLoadingBuffer后
混匀，上样于含有质量百分比浓度1％的gelred核酸染料的1％的琼脂糖凝胶，恒定电压135V
下电泳40min，使用凝胶成像系统观察结果并拍照存档，结果如图3所示。
(2)取2μlDNA样品原液，用TE溶液稀释至100μl，使用Ultrospec3300Pro型紫
外分光光度计测定DNA浓度及纯度。
PCR扩增
取上述制得的黄瓜样品DNA溶液，进行PCR扩增，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1
所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体
如下：
10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，
10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。
PCR扩增程序：先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循
环降退火温度1℃45s，72℃延伸1min；
然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。
PCR扩增后的额产物上样于含有质量百分比浓度1％的gelred核酸染料的1％的琼脂糖凝
胶，恒定电压135V下电泳40min，使用凝胶成像系统观察结果并拍照存档，结果如图4所
示。
PCR产物测序及分析
使用ABI公司3730XL测序仪和分析软件SequencingAnalysis5.2直接对PCR扩增后
的产物进行测序及分析，测序分析结果如图3所示。
品种BB核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；品种AZ-1核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
品种X8-2SEQIDNO.5所示；品种A10hSEQIDNO.6所示；品种A72SEQIDNO.7所示；
品种A86hSEQIDNO.8所示；品种M16SEQIDNO.9所示；品种MC8-3SEQIDNO.10所示；
品种SJ11SEQIDNO.11所示；品种YNSEQIDNO.12所示；品种ZQ3SEQIDNO.13所示；
品种CuilongSEQIDNO.14所示；品种DL102SEQIDNO.15所示；品种BM28SEQIDNO.16
所示。
由上述序列可以看出，纯雌系材料A10h，A86h-1，M16，A72，ZQ3，SJ11，MC8-3，YN
的SNP1均为G，SNP2均为T，SNP3均为C，SNP4均为A；SNP5均为T；SNP6均为TG；SNP7
均为A；SNP8均为C；SNP9均为C；InDel1均有TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入，InDel2
均有GG的缺失；InDel3均有T的缺失；InDel4均有TAATGG或者TGATGA的缺失。
非雌性材料AZ-1，BB，X8-2及杂交种Cuilong，BM28，DL102的SNP1均为A，SNP2均
为G，SNP3均为T，SNP4均为T；SNP5均为C；SNP6均为CA；SNP7均为G；SNP8均为T；
SNP9均为T；InDel1均有TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的缺失，InDel2均有GG的插入；InDel3
均有T的插入；InDel4均有TAATGG或者TGATGA的插入，其在黄瓜第六染色体的位置如表1
所示：
表1雌性相关SNP和Indel位点分布、序列和命名
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实施例2
为进一步验证上述方法的有效性，对Zhongnong26、Qingyan2、Jinchun2和Jinyou35
四个杂交品种采用上述方法进行检测。
黄瓜雌性系品种鉴定的方法，步骤如下：
(1)提取待测黄瓜基因组的DNA；
(2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用SNP标记与InDel标记的检测引物进行PCR
扩增反应；
PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体如下：
10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，
10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。
PCR扩增反应的扩增程序为：
先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循环降退火温度1℃，
45s，72℃延伸1min；
然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。
(3)检测扩增产物，根据SNP标记或InDel标记判断待鉴定品种为纯雌性材料或非雌
性系材料。
PCR产物测序及分析
使用ABI公司3730XL测序仪和分析软件SequencingAnalysis5.2直接对PCR扩增后
的产物进行测序及分析，测序分析结果如图4所示。品种Qingyan2的核苷酸序列如SEQID
NO.17所示，Zhongnong26如SEQIDNO.18所示，Jinchun2如SEQIDNO.19所示，Jinyou35
如SEQIDNO.20所示。结果与图3所示结果一致，说明此方法具有可靠性和广泛的适用性。
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