猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法及用途技术领域
本发明涉及一种猪PPARγ(pPPARγ)基因小干扰RNA(siRNA)表达载体的构建方法及
用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术
过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisomeproliferators-activetedreceptors,PPARs)属
于核激素受体超家族成员，是一类由配体激活的转录因子。近年来许多研究表明，PPARs在
脂肪细胞分化、脂肪代谢中具有重要的调节作用，同时可以影响一些脂肪因子的分泌。PPARs
有3种亚型，分别是PPARα(NR1C1)、PPARβ/δ(NRC2)和PPARγ(NRC3)。PPARγ主
要在脂肪组织、巨噬细胞、血管平滑肌中表达。PPARγ是脂肪细胞基因表达和胰岛素细胞间
信号转导的主要调节者，参与脂肪细胞分化和糖脂代谢的调节，与肥胖的发生、发展密切相
关。因此，开展PPARγ在动物脂肪代谢和肌肉发育中的功能研究具有重要的意义。
RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年迅速发展起来的一项基因阻断技术，它是
指由21～23碱基对的短双链RNA、即小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)在真核细
胞中引导序列特异性的内源或外源性靶mRNA降解，进而抑制相应基因表达的现象。siRNA
技术是目前简单而高效阻断哺乳动物细胞内特异基因表达的最有效方法，已广泛用于基因功
能、信号转导途径及肿瘤基因治疗等研究。由于干扰载体pSilencer4.1-CMVneo可以方便用
于目的基因siRNA表达载体的构建，从而可以特异性的使特定目的基因沉默，功能丧失，因
此干扰载体pSilencer4.1-CMVneo可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种pPPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，以及该
小干扰RNA表达载体的用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种pPPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法，包
括以下步骤：
1)、根据载体的信息和猪PPARγ序列(猪PPARγ全长基因序列)设计并合成4对含9个核
苷酸的loop环的siRNA引物，所述9个核苷酸为：TTCAAGAGA；
即，是根据载体的信息和靶序列设计并合成上述siRNA引物；
2)、RNAi表达载体的构建：双酶切的RNAi载体与siRNA引物退火后产物连接转化，得
到RNAi表达载体的重组质粒。
作为本发明的pPPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法的改进，步骤1)为：根据pPPARγ
全长基因序列，筛选并设计4对siRNA引物；该4对siRNA引物分别为：
引物Ⅰ：
S：5'-GATCCCTTTGGGATCAGCTCTGTGTTCAAGAGACACAGAGCTGATCCCAAAGTTA-3'
AS：5'-AGCTTAACTTTGGGATCAGCTCTGTGTCTCTTGAACACAGAGCTGATCCCAAAGG-3'，
引物Ⅱ：
S：5'-GATCCCAAACCTCACGAAGAGCCTTTCAAGAGAAGGCTCTTCGTGAGGTTTGTTA-3'
AS：5'-AGCTTAACAAACCTCACGAAGAGCCTTCTCTTGAAAGGCTCTTCGTGAGGTTTGG-3'，
引物Ⅲ：
S：5'-GATCCAGTCCTTCCCGCTGACCAATTCAAGAGATTGGTCAGCGGGAAGGACTTTA-3'
AS：5'-AGCTTAAAGTCCTTCCCGCTGACCAATCTCTTGAATTGGTCAGCGGGAAGGACTG-3'，
引物Ⅳ：
S：5'-GATCCGGGAGTTTCTCAAGAGCCTTTCAAGAGAAGGCTCTTGAGAAACTCCCTTA-3'
AS：5'-AGCTTAAGGGAGTTTCTCAAGAGCCTTCTCTTGAAAGGCTCTTGAGAAACTCCCG-3'。
作为本发明的pPPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，步骤2)为：将
pSilencer4.1-CMVneo质粒进行BamHI和HindIII双酶切后，与siRNA引物退火后得到的
DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌；得到RNAi表达载体的重组质粒。
作为本发明的pPPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法的进一步改进，将步骤2)所得
的RNAi表达载体进行鉴定：
通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定；PCR反应的引物为特异性上游引物
(即，上述引物Ⅰ～引物Ⅳ中的上游引物)和RNAi干扰载体的本身引物：
5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′；测序引物为：5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′。
本发明还同时提供了按照上述方法所得的pPPARγ小干扰RNA表达载体的用途：用于抑
制猪PPARγ基因的表达。具体为：用于研究pPPARγ基因对猪脂肪代谢及关键基因ATGL等
产生的影响。
作为本发明的猪PPARγ小干扰RNA表达载体的用途的改进，包括以下步骤：
(1)、将含pPPARγ的siRNA表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯转染级质粒；
(2)、将含pPPARγ的siRNA表达载体的高纯转染级质粒转染猪脂肪细胞等细胞，37℃，
5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基；
(3)、转染48h后，分析siRNA表达载体对pPPARγ及脂肪代谢关键功能基因ATGL、
HSL、PPARγ等表达的影响，研究pPPARγ的功能。
本发明的pPPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法及其用途，具有以下有益效果：
本发明根据pSilencer4.1-CMVneo载体信息和靶序列设计并合成了4对siRNA引物，
siRNA引物经退火后与双酶切的pSilencer4.1-CMVneo载体连接转化大肠杆菌DH5α，构建
得到RNAi表达载体的重组质粒，经筛选和条件优化后，构建好的RNAi表达载体对pPPARγ
具有较好的干扰效果。本发明是利用RNAi技术，开拓了目前研究猪脂肪代谢调控和基因功
能研究的新思路。此法所用的RNAi表达载体pSilencer4.1-CMVneovector方便易得，载体
构建方法简单、可行，同时构建的RNAi表达载体能够特异、高效地抑制pPPARγ基因的表
达，是研究pPPARγ功能的一种强有力的研究技术，为开展pPPARγ在猪脂肪代谢和肌肉发
育中的功能研究具有重要的意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是siRNA引物退火后电泳检测图；
图中：1---RS1，2---RS2，3---RS3，4---RS4，5---Control；
图2是BamHI/HindIII消化pSilencer4.1-CMV后的电泳检测图；
图中：M---DNAmarker，1---质粒，2---双酶切质粒；
图3是PCR产物检电泳捡测图；
图中：M---DNAmarker；RS1～RS4---阳性克隆PCR产物电泳结果；
图4是质粒EcoRⅠ和SamⅠ双酶切产物凝胶电泳检测图；
图中：M---DNAmarker；1～4---阳性克隆双酶切产物电泳结果；
图5是PPARγ-siRNA1测序及BLAST结果；
图6是PPARγ-siRNA2测序及BLAST结果；
图7是PPARγ-siRNA3测序及BLAST结果；
图8是PPARγ-siRNA4测序及BLAST结果；
图9是各干扰载体对pPPARγmRNA表达的影响(*P<0.05；**P<0.01)；
图10是pPPARγ-siRNA1对pPPARγmRNA表达的影响图(**P<0.01)；
图11是pPPARγ-siRNA1对ATGL表达的影响图(**P<0.01)；
图12是pPPARγ-siRNA1对HSL表达的影响图(**P<0.01)；
图13是RES和pPPARγ-siRNA1对pPPARγ基因表达的影响图(*P<0.05；**P<0.01)；
图14是RES和pPPARγ-siRNA1对pPPARγ基因表达的影响图(*P<0.05；**P<0.01)；
图15是NAM和pPPARγ-siRNA1对pPPARγ表达的影响图(*P<0.05；**P<0.01)；
图16是NAM和pPPARγ-siRNA1对ATGL表达的影响图(*P<0.05；**P<0.01)。
具体实施方式
(一)、pPPARγ的siRNA表达载体的构建与鉴定
1、靶序列选择：根据pPPARγ全长基因序列，遵循Tuschl规则和Cenix规则设计并筛选
pPPARγ的siRNA靶序列：
PPARγ-siRNA1：5'-AACTTTGGGATCAGCTCTGTG-3'
PPARγ-siRNA2：5'-AACAAACCTCACGAAGAGCCT-3'
PPARγ-siRNA3：5'-AAAGTCCTTCCCGCTGACCAA-3'
PPARγ-siRNA4：5'-AAGGGAGTTTCTCAAGAGCCT-3'
选择9个核苷酸的loop环“TTCAAGAGA”，根据载体的信息和靶序列设计并合成siRNA
引物。合成引物的结构顺序为：
![]()
所得的4对shRNA引物分别为：
引物Ⅰ
S：5'-GATCCCTTTGGGATCAGCTCTGTGTTCAAGAGACACAGAGCTGATCCCAAAGTTA-3'
AS：5'-AGCTTAACTTTGGGATCAGCTCTGTGTCTCTTGAACACAGAGCTGATCCCAAAGG-3'
引物Ⅱ
S：5'-GATCCCAAACCTCACGAAGAGCCTTTCAAGAGAAGGCTCTTCGTGAGGTTTGTTA-3'
AS：5'-AGCTTAACAAACCTCACGAAGAGCCTTCTCTTGAAAGGCTCTTCGTGAGGTTTGG-3'
引物Ⅲ
S：5'-GATCCAGTCCTTCCCGCTGACCAATTCAAGAGATTGGTCAGCGGGAAGGACTTTA-3'
AS：5'-AGCTTAAAGTCCTTCCCGCTGACCAATCTCTTGAATTGGTCAGCGGGAAGGACTG-3'
引物Ⅳ
S：5'-GATCCGGGAGTTTCTCAAGAGCCTTTCAAGAGAAGGCTCTTGAGAAACTCCCTTA-3'
AS：5'-AGCTTAAGGGAGTTTCTCAAGAGCCTTCTCTTGAAAGGCTCTTGAGAAACTCCCG-3'
2、引物退火：将合成好的引物稀释后，按下列反应体系进行退火：
![]()
![]()
备注说明：10×AnnealingBuffer即为10XAnnealingbuffer(10mMTRIS,pH7.5-8.0,50
mMNaCl,1mMEDTA)。
退火条件为：水浴锅中煮沸20min后，自然冷却至室温，然后琼脂糖凝胶电泳检测退火
反应结果。
上述4种引物的退火后电泳检测图如图1所述，因此证明：4种引物均退火成功。
3、将含有pSilencer4.1-CMV质粒的大肠杆菌接种到LB培养基中，培养过夜，然后利
用小批量质粒提取试剂盒提取质粒，再将质粒进行BamHI和HindIII双酶切，酶切的反应体
系为：
![]()
反应条件为：37℃水浴16h或酶切过夜，然后琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并割胶
回收线性化的载体。质粒提取及双酶切结果如图2所示，表明双酶切成功。
将步骤2所得的每一种退火产物分别进行以下步骤4和步骤5：
4、插入片段(步骤2所得的退火产物)和载体片段(步骤3双酶切后的载体)用T4DNA
连接酶4℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。从而得到相应的4
种RNAi表达载体的重组质粒。
5、经AMP抗性初步筛选后，挑取白色单菌落接种于3ml液体LB培养基中(含Amp100
ng/ml)，37℃振荡培养12h，得菌液；以CMV-F(5′-AGGCGATTAAGTTGGGTA-3′)和相
对应的特异性上游引物(上述步骤1所述)进行PCR鉴定。PCR反应体系如下表1所示：
表1、PCR反应体系
10×PCR扩增缓冲液
2.5μl
MgCl2(25mM)
2.0μl
dNTP(10mM)
1.0μl
特异性引物(10μM)
0.5μl
载体引物CMV-F(10μM)
0.5μl
菌液
2.0μl
Taq酶(2U/μl)
0.5μl
无酶水
16μl
Total
25μl
PCR反应条件为：
(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性45sec，58℃45sec，72℃55sec，共35个循
环；(3)72℃7min，4℃保存。
阳性克隆菌液PCR鉴定结果表明，用鉴定引物CMV-F(序列同上)和特异性pPPARγ
引物(上述步骤1所述)PCR扩增的片段大小为187bp，与本实验预期结果相符，确定为阳
性克隆(图3)。CMV-F是RNA干扰载体pSilencer4.1-CMV中的鉴定引物，是根据载体序列
设计合成的。
提取PCR鉴定为阳性克隆菌的质粒，进行EcoRⅠ/SamⅠ双酶切鉴定(图4)。并将双酶
切鉴定为阳性克隆菌进一步进行测序鉴定插入片段的正确性，测序引物为CMV-F。阳性克隆
测序及序列比对鉴定结果表明，与插入的序列完全一致(图5-图8)，证明pPPARγ的siRNA
表达质粒构建成功。这为进一步研究pPPARγ基因的功能及调控脂肪代谢的作用途径打下基
础，也为通过RNAi技术研究动物脂肪沉积奠定基础。
(二)、有效siRNA筛选
1、利用LipofectamineTM2000介导将第(一)步构建筛选得到的pPPARγ的重组干扰载
体及无关序列(阴性对照)和空白对照分别转染猪脂肪细胞。转染前一天，胰酶消化细胞并
计数，细胞铺板，使其在转染日密度为70％～90％，培养基中含10％胎牛血清，不含抗生素；
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基(OPTI-MEMⅠ培养基)稀释3μgDNA；对于每孔
细胞，使用50μlOPTI-MEMⅠ培养基稀释10μlLipofectamineTM2000试剂。LipofectamineTM
2000稀释后，在30min内同稀释的DNA混合(保温时间过长会降低活性)；混合稀释的DNA
和稀释的LipofectamineTM2000，在室温保温20min(复合物可以在室温保持6h稳定)；直接
将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀，每处理重复三次。如果在无血清条件下转
染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板，在加入复合物前移去生长培养基，替换无
血清培养基；在37℃，5％的CO2中保温4～6h后更换不含抗生素的完全培养基；在细胞中
加入质粒DNA和LipofectamineTM2000复合物18～48h后，分析检测干扰效果。
2、干扰效果检测：转染48h后，用TrizolReagent提取细胞中总RNA，采用Real-time
定量PCR方法检测pPPARγ基因表达水平。
结果为：
转染pPPARγ-siRNA1、PPARγ-siRNA2、PPARγ-siRNA3和PPARγ-siRNA448h后，荧光
定量PCR检测结果显示，与对照相比，阴性对照组PPARγ基因的表达没有明显的变化；转
染pPPARγ-siRNA1、转染pPPARγ-siRNA2、转染pPPARγ-siRNA3和转染pPPARγ-siRNA4后
转染PPARγ基因mRNA水平分别降低64.46％(P<0.01)、30.73％(P>0.05)、6.53％(P>0.05)
和43.40％(P<0.05)。其中，转染PPARγ-siRNA1干扰效果最好，较PPARγ-siRNA2、
PPARγ-siRNA3和PPARγ-siRNA4转染组PAPRγ的mRNA水平降低48.69％(P>0.05)、61.98％
(P<0.05)和37.21％(P>0.05)(图9)。
(三)、干扰条件优化
不同质粒DNA和脂质体浓度及比例对pPPARγ表达的影响。将筛选出的有效的
pPPARγ-siRNA1表达载体质粒DNA(μg)和LipofectamineTM2000(μL)按照不同的浓度和
不同的比例进行干扰条件优化，对六孔板每孔细胞中设定的质粒DNA(μg)和LipofectamineTM
2000(μL)的量为：2：4，2：6，2：8，2：10；3：4，3：6，3：8，3：10；4：8，4：10，
4：12。结果表明，对于6孔培养板，在质粒DNA3μg和LipofectamineTM200010μL时siRNA
对PPARγ目的基因表达的抑制效果最好，干扰效果达75％以上。本研究筛选出了能够有效干
扰-pPPARγ基因表达的siRNA干扰载体，并对干扰条件进行了优化，这将为进一步探讨
pPPARγ基因在猪脂肪代谢和脂肪沉积中的功能奠定实验基础。
(四)、pPPARγ-siRNA对pPPARγ及ATGL等脂肪代谢关键基因mRNA表达的影响
选取第(二)步筛选得到抑制效果最好的pPPARγ-siRNA表达载体---PPARγ-siRNA1，
按照第(三)步的优化的反应体系，检测其对目的基因mRNA表达的抑制作用。将猪脂肪细
胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95％进行处理。转染条件按优化时抑制效果最
佳的比例的进行转染，实验分成三个组：对照组(Control)，转染空载体，pPPARγ-siRNA组，
转染有效重组干扰载体PPARγ-siRNA1；阴性对照组(Neg.-control)转染pSilencer4.1-CMVneo
NegativeControl，每个处理三个重复。转染48h后收集脂肪细胞，Real-time定量PCR检测
pPPARγ基因mRNA表达水平。
结果如图10所示：转染PPARγ-siRNA148h后，猪脂肪细胞中PPARγ基因表达显著低
于空白对照组和阴性对照组。与空白对照组相比，PPARγ-siRNA组PPARγ基因的mRNA水
平显著降低了40.91％(P<0.01)；阴性对照组与空白对照组之间差异不显著(图10)。同时，
研究结果还表明，转染PPARγ-siRNA148h后，显著降低了猪脂肪代谢相关基因ATGL和HSL
基因表达。与空白对照组相比，ATGL基因的mRNA水平显著降低了67.82％(P<0.01)(图
11)，HSL基因的mRNA水平显著降低了39.96％(P<0.01)，FABP3的mRNA水平显著降低
了52.94％(P<0.01)(图12)。
(五)、RES+PPARγ-siRNA1对猪PPARγ、ATGL等基因表达的影响
将猪脂肪细胞传代培养24h后，使其在转染日密度达70-95％进行处理。试验分成4个
处理组：对照组(Control)，转染空载体；RES组，完全培养基(不含血清和酚红)+50μmol/L
RES；PPARγ-siRNA组，脂肪细胞转染PPARγ的重组干扰载体PPARγ-siRNA1；
RES+PPARγ-siRNA组，DMEM/F12培养基(不含血清和酚红)+50μmol/LRES，并转染
PPARγ-siRNA1，每个处理三个重复。转染48h后收集脂肪细胞，检测ATGL等基因mRNA
表达水平。
结果表明，与对照组相比，RES处理后使PPARγ的基因表达降低了36.65％(P<0.01)，
PPARγ-siRNA1转染后使PPARγ的基因表达降低了55.10％(P<0.01)，RES+PPARγ-siRNA1
处理后使PPARγ的基因表达降低了99.00％(P<0.01)；与RES处理组相比，PPARγ-siRNA组
和RES+PPARγ-siRNA组的PPARγ基因的mRNA水平分别降低了29.35％(P<0.05)和98.43％
(P<0.01)；RES+PPARγ-siRNA组较PPARγ-siRNA组PPARγ基因的mRNA水平降低了97.77％
(P<0.01)(图13)。
与对照组相比，RES处理后使脂肪分解关键酶ATGL基因的mRNA水平提高了495.57％
(P<0.01)，PPARγ-siRNA1转染后使ATGL的基因表达降低35.22％(P<0.01)，
RES+PPARγ-siRNA处理后使ATGL的基因表达降低了65.99％(P<0.01)；与RES处理组相
比，PPARγ-siRNA组和RES+PPARγ-siRNA组的ATGL基因的mRNA水平分别降低了89.12％
(P<0.05)和94.29％(P<0.01)；RES+PPARγ-siRNA组较PPARγ-siRNA组ATGL基因的
mRNA水平降低了47.50％(P<0.01)(图14)。
(六)、NAM+PPARγ-siRNA1对猪PPARγ、ATGL等基因表达的影响
NAM100和PPARγ-siRNA1协同调控ATGL等基因表达研究。将猪脂肪细胞传代培养24
h后，使其在转染日密度达70-95％进行处理。试验分成4个处理组：对照组(Control)，转
染空载体；NAM组，完全培养基(不含血清和酚红)+100μmol/LNAM；PPARγ-siRNA组，
脂肪细胞转染PPARγ的重组干扰载体PPARγ-siRNA1；NAM+pPPARγ-siRNA组，DMEM/F12
培养基(不含血清和酚红)+100μmol/LNAM，并转染PPARγ-siRNA1，每个处理三个重复。
转染48h后收集脂肪细胞，检测ATGL基因mRNA表达水平。
结果表明，与对照组相比，NAM处理后使PPARγ的基因表达提高了194.00％(P<0.01)，
PPARγ-siRNA1转染后使PPARγ的基因表达降低了50.00％(P<0.01)，NAM+PPARγ-siRNA
处理后使PPARγ的基因表达降低了72.50％(P<0.01)；与NAM处理组相比，PPARγ-siRNA
组和NAM+PPARγ-siRNA组的PPARγ基因的mRNA水平分别降低了82.99％(P<0.05)和
90.65％(P<0.01)；NAM+PPARγ-siRNA组较PPARγ-siRNA组PPARγ基因的基因表达差异
不显著(图15)。
结果表明，与对照组相比，NAM处理后使ATGL的基因表达降低了29.30％(P<0.05)，
PPARγ-siRNA1转染后使ATGL的基因表达降低了33.72％(P<0.01)，NAM+PPARγ-siRNA处
理后使ATGL的基因表达降低了57.45％(P<0.01)；与NAM处理组相比，NAM+PPARγ-siRNA
组的ATGL基因的mRNA水平降低了39.82％(P<0.01)；NAM+PPARγ-siRNA组较
PPARγ-siRNA组ATGL基因的mRNA水平降低了35.80％(P<0.01)(图16)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不
限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导
出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110>浙江大学
<120>猪PPARγ小干扰RNA表达载体的构建方法及用途
<160>12
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PPARγ-siRNA1
<400>1
aactttgggatcagctctgtg21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PPARγ-siRNA2
<400>2
aacaaacctcacgaagagcct21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PPARγ-siRNA3
<400>3
aaagtccttcccgctgaccaa21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PPARγ-siRNA4
<400>4
aagggagtttctcaagagcct21
<210>5
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅰ的S
<400>5
gatccctttgggatcagctctgtgttcaagagacacagagctgatcccaaagtta55
<210>6
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅰ的AS
<400>6
agcttaactttgggatcagctctgtgtctcttgaacacagagctgatcccaaagg55
<210>7
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅱ的S
<400>7
gatcccaaacctcacgaagagcctttcaagagaaggctcttcgtgaggtttgtta55
<210>8
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅱ的AS
<400>8
agcttaacaaacctcacgaagagccttctcttgaaaggctcttcgtgaggtttgg55
<210>9
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅲ的S
<400>9
gatccagtccttcccgctgaccaattcaagagattggtcagcgggaaggacttta55
<210>10
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅲ的AS
<400>10
agcttaaagtccttcccgctgaccaatctcttgaattggtcagcgggaaggactg55
<210>11
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅳ的S
<400>11
gatccgggagtttctcaagagcctttcaagagaaggctcttgagaaactccctta55
<210>12
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Ⅳ的AS
<400>12
agcttaagggagtttctcaagagccttctcttgaaaggctcttgagaaactcccg55