一种蛋白酶抑制剂cystatin及其免疫抑制作用技术领域
本发明涉及生物医药应用领域，特别是涉及一种蛋白酶抑制剂cystatin及其免疫抑制作用。
背景技术
半胱氨酸组织蛋白酶cathepsin是各种动物组织的细胞内（特别是溶酶体中）发现的一类蛋白酶，由组织蛋白酶A、B、C、D、E、L等多种酶组成。在免疫细胞中，组织蛋白酶参与对抗原的降解、加工和递呈，是启动免疫应答的关键蛋白酶。近年来的研究还表明，组织蛋白酶还参与细胞内其他的一些重要生理和病理过程，比如细胞凋亡、蛋白质加工、肿瘤发生、炎症以及神经退行性疾病等。
Cystatin蛋白家族是组织蛋白酶cathepsin的一类重要的抑制剂。它们调节细胞内组织蛋白酶的功能，对维持细胞内蛋白质的稳态起着重要作用。鉴于组织蛋白酶cathepsin家族在细胞免疫应答及众多疾病进程中的重要作用，其抑制剂Cystatin在免疫调节中的作用也越来越受到重视。例如CystatinC是半胱氨酸组织蛋白酶B、H、L和S的最有效抑制剂，在树突状细胞和巨噬细胞中发挥重要调节作用。胞外的CystatinC能够被其他细胞摄取，进入溶酶体，抑制溶酶体中组织蛋白酶的活性。CystatinC被证明在抗原递呈细胞中调节MHC-II类分子的加工和成熟，从而影响抗原的递呈。胞内CystatinC的水平还与DC的活化程度和细胞因子的表达水平相关，提示Cystatin活性影响着DC的成熟。在巨噬细胞中，CystatinB和C被证明影响活化的巨噬细胞产生一氧化氮，而且这个功能不依赖于Cystatin的蛋白酶抑制活性，提示Cystatin对炎症调节的新机制。CystatinF高表达于CD56dimCD16+的NK细胞亚群中，调节NK细胞参与炎症部位的免疫反应和细胞杀伤。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种蛋白酶抑制剂cystatin及其免疫抑制作用，其制备成本低，分子量小，性质稳定，吸收容易，具有强烈的抑制作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种蛋白酶抑制剂cystatin，所述蛋白酶抑制剂cystatin的基因序列为：
ATGGCTCACAGGGCAGGTATTATTGCAGTTCTCACAGCGCTGGTCGCTGTAACCCTTGCAATTCCTGGAGGCTGGTCGACGAAGGAGCCCTCATCCAGCCCCAAGTACAAAGAACTGGCCCACTTCGCTGTCGCTCAGCGCGTTGAAGGTCTGCAAAAGTACGACACAGTTCTCGAACTCACAAAGGTGGAGACTCAGGTCGTTGCTGGCGTTAACTACCGCCTAACCTTCACCATTGCCGGATCCGATTGCACAATAGGTGAAGTTGAGTACAATGCTGAACGTTGCCCGGCGAAGGATAATCAGGCAAAGGCAACCTGCACTGCGGTGGTCTACGAGAGGCCCTGGGAAAACGTGCGATCCCTCACTTCCCTCAACTGCGCTTGA。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin来源于森林革蜱中。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin的克隆和蛋白表达过程为：（1）克隆cystatin基因到原核表达载体pGEX-6P-2中；（2）大肠杆菌重组表达cystatin；（3）柱层析的方法纯化重组的cystatin蛋白。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin的克隆和蛋白表达过程为：（1）提取森林革蜱RNA，制备cDNA，根据同源基因设计特异性引物，从cDNA文库中扩增出目的基因的蛋白编码区片段，将目的基因的编码区双酶切后连接到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-2中；（2）将构建好的重组pGEX-6P-2目的基因表达质粒转化至大肠杆菌BL21菌株中，用IPTG诱导表达重组目的蛋白；（3）用GST介质纯化重组目的蛋白，用特异性蛋白酶在柱上酶切的方法，去除GST标签。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin对组织蛋白酶cathepsinL的活性具有抑制作用。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin的使用剂量与对组织蛋白酶cathepsinL活性的抑制效果成线性关系，所述蛋白酶抑制剂cystatin的使用剂量越多，所述cathepsinL活性的抑制效果越强。
在本发明一个较佳实施例中，在RAW264.7细胞中，所述蛋白酶抑制剂cystatin对细胞中的组织蛋白酶具有抑制作用。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin能抑制巨噬细胞和树突状细胞的活化，能抑制免疫细胞的抗原递呈作用
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin能抑制细菌内毒素脂多糖LPS导致的巨噬细胞活化。
在本发明一个较佳实施例中，所述蛋白酶抑制剂cystatin能抑制病原体导致的巨噬细胞活化。
本发明的有益效果是：本发明的蛋白酶抑制剂cystatin及其免疫抑制作用，原核表达的蛋白即具备生物学活性，制备成本低，分子量小，性质稳定，吸收容易，免疫原性差，不易被宿主中和降解，蜱蛋白酶抑制剂对巨噬细胞和树突状细胞有免疫抑制和免疫调节作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明的蛋白酶抑制剂cystatin的表达与纯化图；
图2是本发明的cystatin纯化蛋白抑制cathepsinL活性的结果图；
图3是本发明的不同剂量的cystatin对cathepsinL活性抑制作用的结果图；
图4是本发明在RAW264.7细胞中cystatin对cathepsinL的抑制活性的结果图；
图5是本发明cystatin抑制LPS诱导巨噬细胞表达白介素1（IL1β）的结果图；
图6是本发明cystatin抑制病原体Borrelia（Bb）诱导的巨噬细胞产生炎性细胞因子（mRNA和蛋白水平）的结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在虫媒传染病的昆虫宿主的生物学研究过程中，得到了医学媒介昆虫蜱类的唾液中编码一类组织蛋白酶抑制剂cystatin。蜱唾液中的这类cystatin对蜱类吸血及病原体传播行为都有重要的意义。
本发明是在森林革蜱中得到了新的蛋白酶抑制剂cystatin，并对其抑制蛋白酶的活性进行了鉴定，确认其对组织蛋白酶L（cathepsinL）有明显的抑制活性，对哺乳动物细胞中组织蛋白酶cathepsinL有强烈的的抑制活性。Cystatin能显著抑制巨噬细胞和树突状细胞的活化，能显著抑制免疫细胞抗原递呈和细胞因子的表达，是一个具有应用前景的免疫抑制分子。
实施例一：
森林革蜱cystatin的蛋白表达
（1）克隆cystatin基因到原核表达载体pGEX-6P-2中
Cystatin是一种序列确定的森林革蜱的半胱氨酸蛋白酶拮抗剂。
提取森林革蜱RNA，制备cDNA，根据同源基因设计特异性引物，从cDNA文库中扩增出目的基因的蛋白编码区片段，将目的基因的编码区双酶切后连接到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-2中，经测序确认为一个全新的序列。所述蛋白酶抑制剂cystatin的序列为：
ATGGCTCACAGGGCAGGTATTATTGCAGTTCTCACAGCGCTGGTCGCTGTAACCCTTGCAATTCCTGGAGGCTGGTCGACGAAGGAGCCCTCATCCAGCCCCAAGTACAAAGAACTGGCCCACTTCGCTGTCGCTCAGCGCGTTGAAGGTCTGCAAAAGTACGACACAGTTCTCGAACTCACAAAGGTGGAGACTCAGGTCGTTGCTGGCGTTAACTACCGCCTAACCTTCACCATTGCCGGATCCGATTGCACAATAGGTGAAGTTGAGTACAATGCTGAACGTTGCCCGGCGAAGGATAATCAGGCAAAGGCAACCTGCACTGCGGTGGTCTACGAGAGGCCCTGGGAAAACGTGCGATCCCTCACTTCCCTCAACTGCGCTTGA。
（2）大肠杆菌重组表达cystatin
将构建好的重组pGEX-6P-2目的基因表达质粒转化至大肠杆菌BL21菌株中，用IPTG诱导表达重组目的蛋白。
（3）柱层析的方法纯化重组的cystatin蛋白
用GST介质纯化重组目的蛋白，用特异性蛋白酶在柱上酶切的方法，去除GST标签。重组的cystatin蛋白浓缩后出去内毒素用于活性测试。
森林革蜱是研究蜱传疾病的良好的模式生物，其全基因组测序已经完成。经过上述步骤，克隆了全长的cystatin的cDNA，并且实现了在蛋白GST原核表达系统中的表达。纯化后得到的cystatin蛋白为12.1kD，具体如图1所示。
实施例二：
Cystatin纯化蛋白对cathepsinL活性的抑制鉴定
一、我们根据InnoZymeCathepsinLActivityAssayKit,FluorogenicCat.No.CBA023说明书对cathepsinL活性进行检测，试剂选择如下表所示。
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具体操作如下：
（1）分别加入激活缓冲剂（activationbuffer）、AMC、组织蛋白酶L（cathepsinL）（100ng/孔）、样品缓冲剂（samplebuffer），每组现体积100ul，室温慢摇5min。
（2）加入GST、CYSTATIN、抑制剂（inhibitor）、稀释液（diluent），每组现体积150ul，慢摇5min。
（3）加入底物（substrate），每组现体积200ul，37℃下摇床1到2小时后，在360nm、460nm处测荧光。
结果如图3所示，结果发现与阴性对照GST相比，cystatin的抑制活性为93.87%（阳性对照的抑制活性为91.9%）。
二、为进一步阐明cystatin的抑制效果，采用了不同剂量的纯化cystatin蛋白进行检测，如下表所示。
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结果如图3所示，结果发现cystatin的使用剂量与抑制效果成线性关系，随着使用剂量的增多，抑制效果明显增强。当cystatin剂量为1ng每孔（浓度为5ng/ml）时，对cathepsinL的活性的抑制达到50%。
三、在RAW264.7细胞中，对cystatin（200ng/孔）抑制cathepsinL活性进行检测，如下表所示，具体操作如下。
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（1）加入activationbuffer、AMC、RAW264.7细胞裂解液、samplebuffer，每组现体积100ul，室温慢摇15min。
（2）加入GST、CYSTATIN、diluent，每组现体积150ul，慢摇15min。
（3）加入substrate，每组现体积200ul，37℃下摇床1到2小时后，在360nm、460nm处测荧光。
结果如图4所示，结果发现，与阴性对照相比，cystatin对cathepsinL的抑制活性为90.77%。
因此，由上述结果可知，cystatin对纯化的cathepsinL有显著地抑制作用；在RAW264.7细胞中，且cathepsinB抑制剂存在的条件下，cystatin对细胞中的组织蛋白酶（如cathepsinL等）有一定的抑制作用。
实施例三：
Cystatin的免疫抑制活性
一、cystatin能抑制细菌内毒素脂多糖（LPS）导致的巨噬细胞活化，降低炎性细胞因子的表达水平。
具体操作如下：
（1）在分离到的小鼠腹腔巨噬细胞分别加入0.25uM、1uM、4uM不同浓度的cystatin或最高浓度对照蛋白GST，预孵育2小时。
（2）向上述细胞中加入200ng/ml浓度的细菌内毒素脂多糖，刺激4小时。
（3）收取细胞上清，并提取细胞总RNA，反转录成cDNA。用实时定量PCR的方法检测炎性细胞因子的表达水平。结果如图5所示，炎性细胞因子白介素1（IL1β）的表达水平受到革蜱cystatin的抑制，说明cystatin具有免疫抑制活性。
二、cystatin能抑制病原细菌Borrelia（Bb）导致的巨噬细胞活化，降低炎性细胞因子的表达水平。
具体操作如下：
（1）在分离到的小鼠腹腔巨噬细胞分别加入3uM浓度的cystatin或对照蛋白GST，预孵育2小时。
（2）向上述细胞中加入104/ml浓度的螺旋体细菌Bb，刺激4小时。
（3）收取细胞上清，并提取细胞总RNA，反转录成cDNA。用实时定量PCR的方法检测炎性细胞因子的表达水平。
结果如图6所示，结果发现，革蜱cystatin能显著抑制螺旋体细菌Bb刺激小鼠巨噬细胞产生炎性细胞因子（白介素1（IL1β）、肿瘤坏死因子（TNFα）、白介素6（IL6）的能力。说明cystatin能抑制病原体导致的巨噬细胞活化。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。