TYMS基因表达量荧光定量PCR检测试剂盒及其应用(一)技术领域
本发明涉及一种类胸苷酸合成酶(Thymidylatesynthase，TYMS)基
因荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。
(二)背景技术
类胸苷酸合成酶(Thymidylatesynthase，TYMS)基因定位于18p11.32，
全长16Kb，含7个外显子。TYMS表达产物为胸苷酸合成酶(TS)，TS
为两个相同单位组成的二聚体蛋白质，每个亚单位的分子量是36kDa。
胸苷酸合酶广泛存在于人体的细胞质中，主要功能是结合5，10-2亚甲基
四氢叶酸(CH2FH4)，催化脱氧尿苷酸(BUMP)甲基化为脱氧胸苷酸
(dTMP)，是dTMP从头合成的限速酶，而dTMP是核酸生物合成所必需
的，是细胞内胸苷的唯一来源，抑制TS活性便可抑制肿瘤细胞的增殖。
对56例NSCLC术后组织标本进行免疫组化及RI-PCR测定发现，
在癌组织中TS蛋白总阳性率为56％，临床病理特征分析后发现TS蛋白
及基因在鳞癌中表达水平显著高于腺癌，差异具有统计学义，同时研究发
现TS表达与分化程度亦密切相关(P<0.05)。对培美曲赛和多西他赛二线
治疗NSCLC头对头的III期随机研究进行的回顾性分析发现，在对鳞癌
的患者培美综述曲赛和多西他赛的中位生存分别为6.2个月，7.4个月(P＝
0.018)，多西他赛好于培美曲赛；在对非鳞癌的患者，培美曲赛和多西他
赛的中位生存分别为9.3个月和8.0个月(P＝0.048)，培美曲赛好于多西
他赛；此研究显示可能正是鳞癌中TS的过表达降低了其对抗叶酸药物的
敏感性。采用免疫组化及TaqManRTPCR法检测非小细胞肺癌患者癌组
织及癌旁正常组织中TS蛋白和基因的表达情况发现，TS蛋白及基因在
癌组织中均呈高表达，且TS蛋白及TS基因具有密切相关性。RTPCR扩
增TSmRNA时得到两种不同DNA片段，分别为三倍重复(3R)和双倍
重复(2R)型等位基因，其中具有3R/3R基因型的癌组织中TS表达水平
显著高于其它基因型。由上可知，TS表达水平对评估NSCLC的生物学
特性有重要作用，TS可能是预测NSCLC预后的潜在的重要分子标志物。
现有的证据己经向我们揭示了TS作为未来NSCLC个体化治疗的重要的
分子标志物的潜力。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种人TYMS基因荧光定量PCR检测试剂盒，用
于检测人TYMS基因的表达，特异性好，灵敏度高。
本发明采用的技术方案是：
一种检测人TYMS基因突变的荧光定量PCR试剂盒，主要包括特异
性引物和PCR反应试剂；所述特异性引物序列如下：
上游引物：5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTG-3’
下游引物：5’-AAAGGTCTGGGTTCTCGCTG-3’。
所述PCR反应试剂为本领域常规试剂，主要包括：dNTP、反转录缓
冲液、PCR缓冲液、Mg2+、双蒸水、逆转录酶、Tag酶等，也可直接采用
市售PCRMix成品。
所述试剂盒还可包括人TYMS基因检测标准品，所述标准品序列如
下：
5’-ATCTTCCTCTGATGGCGCTGCCTCCATGCCATGCCCTCTGCCA
GTTCTATGTGGTGAACAGTGAGCTGTCCTGCCAGCTGTACCAGAGA
TCGGGAGACATGGGCCTCGGTGTGCCTTTCAACATCGCCAGCTACG
CCCTGCTCACGTACATGATTGCGCACATCACGGGCCTGAAGCCAGG
TGACTTTATACACACTTTGGGAGATGCACATATTTACCTGAATCACAT
CGAGCCACTGAAAATTCAGCTTCAGCGAGAACCCAGACCTTT-3’。
标准品的制备：以Genebank中发布的人TYMS的基因序列为标准，
以健康体检人的外周血mRNA为模板，反转录为cDNA。以该cDNA为
模板，用上述引物扩增出特异性的PCR片段，然后把该PCR片段插入到
T载体中，利用大肠杆菌DH5α菌株转化并提取质粒，nanodrop2000测定
浓度和纯度，以此质粒作为检测分析中的标准品。
本发明还涉及所述的试剂盒在检测人TYMS基因表达量中的应用。
具体的，所述应用方法如下：
(1)采集待测样本，提取RNA；样本可以是血液、穿刺组织、石蜡组
织、手术切除组织等；
(2)以样品RNA为模板，进行反转录反应，得到样品cDNA；
反转录反应：RNA模板0.1ug，反转录反应试剂(promega试剂盒)，
双蒸水；反转录反应：25℃15min；50℃1hour；85℃5min；4℃，5min。
(3)以梯度浓度的人TYMS基因检测标准品为模板，加入所述特异性
引物和PCR反应试剂，组成PCR反应体系，进行PCR扩增，绘
制标准曲线；
(4)以样品cDNA为模板，加入所述特异性引物和PCR反应试剂，
组成PCR反应体系，进行PCR扩增，扩增结果对照标准曲线，
获得TYMS基因表达量。可以样品cDNA为模板，加入内参18s
特异性引物(F：5’-AGAAACGGCTACCACATCCA-3’；R：5’
-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’)和PCR反应试剂，组成PCR反
应体系，进行PCR扩增，监控实验体系的可行性。
所述PCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s、60℃
退火20s、72℃延伸20s(此处收集荧光信号)，40个循环。
本发明的有益效果主要体现在：本发明试剂盒用于检测人TYMS基
因表达量，特异性好，灵敏度高，具有较好应用前景。
(四)附图说明
图1为标准曲线及3对(癌组织和癌旁组织)临床样本的检测结果；
图2为内参18s的扩增曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围
并不仅限于此：
实施例1：
(1)样品准备：取患者手术切除组织，提取RNA(浓度不小于100ng，
A260/280不小于1.9)。
(2)样品处理：取100ng的RNA，加入反转录试剂(promega试剂盒)
5μl，补双蒸水到20μl，按如下条件进行反转录反应：25℃15分钟；
50℃1小时；85℃5分钟；4℃，5分钟。
(3)荧光定量PCR反应：
利用(2)中反转录产物为模板进行：取上述反转录模板5μl，加入
0.1ml的8联排管中(含荧光定量PCR反应试剂15μl)。同时在标
准管中(含荧光定量PCR反应试剂15μl)加入相应梯度浓度的标
准品；在内参管(含荧光定量PCR反应试剂15μl，引物为内参18s
特异性引物)中加入5μl上述cDNA模板。混匀。然后加入荧光定
量反应引物，上机检测。在ABIStepOnePlus仪器上，选择标准曲
线法和SYBR染料，进行PCR反应；
荧光定量PCR反应试剂组成如下：总体积：15μl；PCRMix(DBI
Bioscience)(10μl)引物集(0.2μl)，双蒸水(4.8μl)；
PCR反应条件如下：95℃预变性2min；95℃变性15s、60℃退
火20s、72℃延伸20s(此处收集荧光信号)，40个循环。
(4)结果判读。根据标准品建立标准曲线，利用待测样品的Ct值，从
该曲线上读取相应的TYMS基因表达量，结果参见图1，内参18s
的扩增曲线参见图2；由图可见：本发明试剂盒可用于检测人TYMS
基因表达量，特异性好，灵敏度高。
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