一种新琼寡糖的酶解制备方法技术领域
本发明涉及一种新琼寡糖的酶解制备方法，属于生物工程领域。
技术背景
龙须菜(Gracilarialemaneiformis)是江篱属(GracialariaGreville)下的一种海藻类植物，主要含有多糖类、藻胆蛋白等成分。种植面积广，年产量高，主要用作制备琼胶和鲍鱼饲料的原料。
琼胶（Agar）是复杂水溶性红藻多糖，集中于藻类植物细胞壁的髓部细胞间隙中，具有热可逆性、无色无味、对pH不敏感、熔点高于凝固点、稳定性强等优点。基于琼胶的众多优点，使其应用范围广，在生物学、食品行业、化工行业、医疗等领域都有应用。如食品工业中琼胶可作为食品的乳化剂、糖衣，生物学领域中琼胶可作为微生物的培养基成分等。此外，琼胶还可用于生产各种具有功能性、低分子量的琼胶寡糖。目前提胶的主要方法为碱法提胶，该法存在污染环境、琼胶出胶率低等缺点；而高温高压水提琼胶得率高，可以考虑作为制备寡糖的原料，这样不但环保，而且成本低。
琼胶寡糖是由琼胶多糖通过各种化学或生物方法降解而得到的，一般是指DP（degreeofpolymerization）为10以下的糖类。包括琼寡糖和新琼寡糖两个系列，二者都是以二糖为主要重复单位连接而成的。目前制备琼胶寡糖的方法分为化学分解法和生物分解法。化学分解法存在重复性差、产物不均一、污染环境、寡糖活性丧失、产物分析和回收难等问题。生物分解法即酶分解法，克服了化学方法的不足，采用琼胶酶对琼胶多糖糖苷键进行特异性剪切，生成不同分子量的功能性寡糖。
琼胶粘度高、不溶于冷水、不被生物体吸收利用，这些缺点导致了琼胶应用的受限。而琼胶寡糖克服了琼胶的不足，具有很好的水溶性、易被生物体吸收利用、且安全性高、稳定性高、几乎不残留等特点。基于这些特点，琼胶寡糖可应用于生物、食品、医疗等领域，实现琼胶和龙须菜的高值化利用。
发明内容
本发明提供了一种新琼寡糖的酶解制备方法，以龙须菜为原料，高压高温水提制备琼胶，利用实验室自行发酵生产的琼胶酶发酵液降解琼胶制备新琼寡糖，并通过凝胶色谱纯化寡糖，建立一套完整的新琼寡糖制备工艺。
本发明提供的新琼寡糖的制备方法为：
以龙须菜为原料，采用高温高压水提制备琼胶，并对水提温度、时间、液料比进行正交法优化，确定最佳工艺条件为：水提温度120℃、时间90min、液料比28:1（v/w）。此条件下琼胶得率为32.8%。用琼胶酶对琼胶进行酶解制备新琼寡糖，工艺流程为：将琼胶用0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制成一定浓度的底物，加热溶解，加入适量琼胶酶液在一定温度条件下反应一定时间，沸水5min灭酶，离心（12000r/min，5min）去沉淀，上清加乙醇至乙醇体积浓度为70%，4℃过夜，离心（12000r/min，5min）去沉淀（多糖及蛋白质），上清旋蒸近干，蒸馏水定容至50mL，苯酚-硫酸法测水解度。并对pH值、温度、时间、底物浓度、加酶量进行了优化。确定最优酶解条件为：pH6.36、温度54.47℃、底物浓度为0.6%（w/v）、时间2h、加酶量20U/mL。此条件下水解度为55.62%。酶解产物进行薄层层析色谱分析，确定酶解产物组成主要为新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖。冷冻干燥后的酶解产物采用SephadexLH-20凝胶柱进行分离纯化，洗脱液为蒸馏水，流速0.3mL/min，收集各组分并进行浓缩，薄层层析色谱验证，冷冻干燥得纯化后干品。
本发明的优点在于：本发明采用龙须菜为原料，水提制备琼胶，琼胶酶酶解琼胶制备新琼寡糖，SephadexLH-20色谱柱纯化寡糖。龙须菜来源丰富，价格低廉；水提琼胶得率比传统的碱提法提高了2.8%以上，而且无需消耗化学试剂、绿色环保、成本低，可用作制备琼胶寡糖的原料，实现龙须菜的高值化利用；传统化学法制备琼胶寡糖，需使用盐酸、硫酸、氢氧化钠等化学试剂，且该法存在重复性差、产物不均一等问题，采用酶法取代传统的化学法制备琼胶寡糖，可克服化学法的不足、反应温和、减少环境污染，并可获得高生物活性的琼胶寡糖。本实验室自行发酵生产的琼胶酶，活性高，有助于降低琼胶寡糖的生产成本。
附图说明
图1水提温度对琼胶得率的影响。
图2水提时间对琼胶得率的影响。
图3液料比对琼胶得率的影响。
图4pH值变化对水解度的影响。
图5温度变化对水解度的影响。
图6时间变化对水解度的影响。
图7底物浓度变化对水解度的影响。
图8加酶量的变化对水解度的影响。
图9酶解产物分离图谱。
图10琼胶寡糖的薄层层析图谱。其中1为标准新琼寡糖，从上至下为新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖；2为酶解产物中的新琼四糖；3为酶解产物中的新琼六糖；4为酶解产物中的新琼八糖。
具体实施方式
实验材料和试剂
1、实验材料：
龙须菜：福建亿达食品有限公司提供；
琼胶酶：福建省海洋酶工程重点实验室提供；
凝胶色谱柱：SephadexLH-20，购于sigma公司。
2、主要试剂：
无水乙醇、苯酚、硫酸等常规药品均为国产分析纯试剂。
3、琼胶得率测定方法：
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4、琼胶酶酶活测定方法：DNS法。
酶活力单位定义为：每分钟催化底物产生1μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位(U)。
酶活力单位计算：
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式中：
U：样品的酶活
△A：540nm下的吸光值
M：样品稀释倍数
V：样品的反应体积，mL
K：标准曲线斜率
t：反应时间，min
5、水解度测定方法：
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式中：
n：苯酚-硫酸法测得糖含量，g
m：底物干重，g
实施例1水提龙须菜制备琼胶的的工艺优化
（1）在液料比为16:1，时间为60min下，确定最适水提温度为120℃（图1）。
（2）在温度为120℃，液料比为16:1下，确定最适水提时间为90min（图2）。
（3）在温度为120℃，时间为90min下，确定最适水提液料比为24:1（图3）。
在单因素的实验基础上，采用正交试验进行水提琼胶的优化，按L9（34）正交表进行温度（100℃、110℃、120℃）；时间（60min、90min、120min）；液料比（20:1、24:1、28:1）正交试验，因素水平表如表1所示。
表1因素水平表
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结果分析：只有温度对琼胶得率具有显著性影响。
影响因素：温度>液料比>时间。
优化结果：温度120℃，时间90min，液料比28:1为水提龙须菜制备琼胶的最优工艺条件。此条件下琼胶得率最高为32.8%。
实施例2琼胶寡糖的酶解制备工艺优化
（1）在酶解温度为45℃，酶解时间为2h，底物浓度为0.5%，加酶量为10U/mL的条件下，研究pH值变化对水解度的影响。当pH值为6.5时，水解度最大（图4）。
（2）在酶解时间为2h，底物浓度为0.5%，pH值为6.5，加酶量为10U/mL的条件下，研究温度变化对水解度的影响。当温度为55℃时，水解度最大（图5）。
（3）在酶解温度为55℃，底物浓度为0.5%，pH值为6.5，加酶量为10U/mL的条件下，研究酶解时间变化对水解度的影响。当酶解时间为2h，水解度达到稳定（图6）。
（4）在酶解温度为55℃，酶解时间为2h，pH值为6.5，加酶量为10U/mL的条件下，研究底物浓度变化对水解度的影响。当底物浓度为0.5%时，水解度达到最大（图7）。
（5）在酶解温度为55℃，酶解时间为2h，底物浓度为0.5%，pH值为6.5的条件下，研究加酶量变化对水解度的影响。当加酶量为20U/mL时，水解度达到平稳（图8）。
在单因素的实验基础上，设计3因素3水平响应面实验（如表2所示），确定最佳工艺条件。
表2响应曲面实验设计因素水平编码表
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结果分析：模型显著。
影响因素：底物浓度>pH值>酶解温度
优化结果：酶解pH6.36、酶解温度54.47℃、底物浓度0.6%、酶解时间2h、加酶量20U/mL条件为最优工艺，水解度预测值为56.35%，水解度实验测定值55.62%，说明模型可以较好的反应实际酶解反应过程。
实施例3琼胶寡糖的分离纯化
将酶解得到的酶解产物经SephadexLH-20凝胶柱进行分离纯化。采用蒸馏水为洗脱液，流速0.3mL/min，每管收集1.2mL，采用苯酚-硫酸法测定寡糖含量（图9）。
将各组分收集、浓缩后进行薄层层析色谱，确定各自组分及纯度。新琼寡糖混合物经LH-20色谱柱得到很好的分离，所得寡糖分别为：新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖（图10，图中1为标准新琼寡糖，从上至下为新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖、新琼八糖；2为酶解产物中的新琼四糖；3为酶解产物中的新琼六糖；4为酶解产物中的新琼八糖）。