一种促进利福霉素SV发酵合成效率的补料方法技术领域
本发明涉及一种促进利福霉素SV发酵合成效率的补料方法。本发明属于生物制药发酵工程领域，特别是涉及一种发酵过程调控胞内NADH的氧化方向迁移及效率、改善碳、氮代谢流分配、促进利福霉素SV的核心氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的生成，提高利福霉素SV合成效率的方法。
背景技术
做为结核病治疗的大宗抗生素原料药，提高利福霉素发酵合成效率一直备受生产企业和研究单位关注。目前，国内关于提高利福霉素发酵效价的报道较多，包括：生产菌种的分子生物学信息特征、发酵培养基优化等方面，如对比文献1：在摇瓶水平添加豆油和丙氨酸可提高利福霉素SV效价12.3％(食品与发酵工业，商纯良，2011，37(5)：56-60)；对比文献2：在50吨大罐水平添加豆油和乙二酸可使利福霉素SV发酵十亿提高5.4％(发明专利ZL201210176175.9)；对比文献3：添加丙氨酸、豆油和磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇可使利福霉素SV效价平均提高17.0％(发明专利申请号201210176177.8)。对比文献4：在10L发酵罐培养地中海拟无枝酸菌过程中基料添加锌离子(终浓度0.75mg/L)对利福霉素SV效价和有机酸合成产生了显著影响(中国酿造，邓鹏飞，2013,32(8)：84-87)。但是，对比文献1只涉及豆油和丙氨酸存在交互作用，在确定的优化浓度下，利福霉素SV效价提高12.3％，并对生产菌种的糖酵解途径碳代谢、有机酸合成效率以及效价合成的影响进行了初步的分析，并没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移和效率对利福霉素SV合成的影响；对比文献2涉及豆油和乙二酸的双重作用调节三羧酸循环中的关键步骤---琥珀酸脱氢酶催化的反应的活性，通过促进利福霉素SV前体---甲基丙二酰CoA的合成代谢效率来提高利福霉素SV的合成效率，也没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移及效率对利福霉素SV合成的影响；对比文献3仅初步说明了三者具有调节利福霉素SV发酵的作用，而且该文献也没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移和效率对利福霉素SV合成的影响；对比文献4通过分析胞外部分有机酸、氨基酸的变化规律，报道锌离子通过抑制丙氨酸脱氢酶活性并引起丙酮酸积累，使由草酰乙酸衍生的赖氨酸和由α-酮戊二酸衍生的谷氨酸合成量增大，促进了利福霉素SV的合成。但是，对比文献4并没有涉及发酵过程中NADH的氧化方向迁移和效率对利福霉素SV合成的影响。
氧化还原反应几乎参与到微生物细胞生长和代谢的各个环节，在有氧呼吸条件下，NADH经电子传递链氧化为NAD+，并产生大量ATP，为细胞生命活动和产物的合成提供能量。但在发酵条件下电子传递受到限制，并引起碳代谢途径发生改变。细胞生长代谢过程中糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)会大量产生NADH，在发酵条件下细胞若不能很好的将NADH经电子传递链或一些脱氢酶催化的反应(如：丙氨酸脱氢酶)氧化，就会出现NADH/NAD+比例失衡。这必然会影响细胞的生理代谢和次级代谢物的积累。利福霉素SV的氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成效率与谷氨酰胺合成酶(GS)的活力密切正相关并受丙氨酸(Ala)抑制，而发酵条件下细胞通过丙氨酸脱氢酶氧化NADH生成Ala，该途径流量增强会抑制GS活性以及3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成效率。因此，若能改变发酵条件下NADH的氧化方向以及效率，即：降低NADH经丙氨酸脱氢酶催化途径碳流量，则既能使发酵条件下NADH/NAD+处于失衡状态，又能降低Ala的积累，使GS活性维持在较高水平，从而促进3-氨基-5-羟基苯甲酸和利福霉素SV的合成效率。因此，发酵条件下选择细胞合适的受氢体可能会实现上述目的。
在前期研究和生产中，我们确定发酵过程发酵液中乙醇的浓度相当高，而地中海拟无枝酸菌细胞是通过乙醇脱氢酶来氧化NADH并合成乙醇的，而受氢体为乙醛分子。在有机化工行业，乙醛是常用二碳试剂，也可构建杂环环系；在食品行业可用于调配水果香精，也可用于酿造酒用香精，在加香食品中浓度约为3.9-270mg/kg。但是，没有关于外源乙醛分子作为代谢调控因子作用于地中海拟无枝酸菌的新功能的报道，即：使NADH的氧化途径由丙氨酸脱氢酶催化的反应向乙醇脱氢酶催化方向迁移，并通过促进乙醇脱氢酶的活性来增强NADH的氧化、降低丙氨酸的合成、调节发酵过程中NADH的氧化方向和效率、提高利福霉素SV氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成效率、促进利福霉素SV发酵产量的新功能的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进利福霉素SV发酵合成效率的新补料方法，其实质性是不将乙醛作为常规意义上的有机化工二碳试剂、食品行业调配香精来使用，而是将乙醛分子作为代谢调控因子来促进发酵过程中NADH的氧化迁移和效率、增强利福霉素SV氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成效率、提高利福霉素SV的发酵产量。
地中海拟无枝酸菌的三级发酵48-72h时，开始无菌流加乙醛溶液至发酵结束前10h，使其终浓度为1.5-3.0mmol/L，培养结束时利福霉素SV效价平均提高10.1％。
所述发明具有材料易购、操作工艺简单、可控性高、适用于工业发酵生产的特点。
本发明提出的一种促进利福霉素SV发酵合成效率的补料方法，包括以下步骤：
(1)培养基的制备
①种子培养基
葡萄糖1.5％,黄豆饼粉1.0％,蛋白胨1.0％,硝酸钾0.05％,碳酸钙0.2％,可溶性淀粉1.5％，pH7.0。经0.1MPa蒸气灭菌30min备用；
②发酵培养基
葡萄糖6-10％,鱼粉0.3-0.55％,黄豆饼粉0.5-0.65％,蛋白胨0.4-0.7％，硝酸钾0.6-0.8％,碳酸钙0.5％,磷酸二氢钾0.02％，pH自然。经0.1MPa蒸气灭菌20min备用。
(2)菌种活化
取保藏的地中海拟无枝酸菌(A.mediterranei)菌种接入种子培养基，在摇床上培养48h，培养条件为28℃、220r/min。
(3)菌种扩大培养与合瓶种子细胞的收集
将上述菌种接到发酵摇瓶培养基中，装液量为50-100mL/250mL三角瓶，接种量为3％-5％，于27℃-28℃、150-200r/min振荡培养46-50h，后无菌操作将摇瓶种子培养基合瓶。(4)二级种子培养与三级发酵
将合瓶种子火焰保护接入二级种子罐，培养温度28℃，转速为160-200r/min，空气流量控制为0.8vvm，罐压控制为0.03-0.04MPa，培养48h后移种至三级发酵罐。
(5)三级发酵罐控制
培养温度28℃，转速0-48h为200r/min，48-72h为220r/min，72-96h为230r/min，96h至放罐为240r/min。空气流量控制：0-48h为0.4vvm，48-72h为0.6vvm，72-96h为0.8vvm，96h至放罐为1vvm。罐压控制：0-48h为0.02MPa，48-72h为0.03MPa，72-96h为0.04MPa，96h至放罐为0.05MPa。
(6)三级发酵培养周期为48-72h时，开始流加补入乙醛溶液至发酵结束前10h，使其终浓度为1.5-3.0mmol/L，其它控制工艺不变。
与现有技术相比本发明具有如下优点和显著的进步：按本技术方案进行操作，将作为有机化工行业常用二碳试剂和食品行业调香剂的外源乙醛用作代谢调控因子作用于地中海拟无枝酸菌，调节了发酵过程NADH的氧化迁移和效率、使发酵中后期乳酸、琥珀酸、苹果酸、丙氨酸的浓度降低，谷氨酸浓度大幅提高，更有效促进了3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成，培养结束时利福霉素SV效价平均提高10.1％。这是与现有技术最明显的不同，超出了对利福霉素SV促进效果的预期，产生了预料不到的技术效果。
附图说明
图1是流加乙醛对生物量(○，对照组；●：添加组)和利福霉素SV(□，对照组；■，添加组)合成的影响图，数据为三次平行试验的平均值。
由图1可知：从菌体进入对数生长期(48h)开始恒速流动补加乙醛，使其终浓度为1.5mmol/L，发酵后期促进了生物量的增长，高于对照组16.5％-83.7％，效价也得到相应的提高，在121h时，添加组效价比对照组提高23.3％，发酵结束时，利福霉素SV效价比对照提高10.1％。
图2为流加乙醛对乳酸(○，对照组；●：添加组)和琥珀酸(□，对照组；■，添加组)合成的影响图，数据为平均值±标准偏差。
由图2可知：随着发酵的进行，流加乙醛实验组中的乳酸、琥珀酸比对照组的浓度低，特别是在96h，流加组中乳酸的量为35mg/L，琥珀酸的浓度为36mg/L，分别只有对照组的88.5％,和41.9％。在微生物体内，糖酵解产生丙酮酸的同时还生成等量的NADH，当溶氧不充足时，菌体可以通过发酵将有机物氧化放出的电子直接传递给底物本身，产生各种不同的代谢产物，例如乳酸和琥珀酸发酵。我们在菌体发酵过程中流加乙醛后，其生成量减少，说明流加乙醛后减弱了碳代谢流向有机酸合成方向，反而转向了醇类合成方向。
图3为流加乙醛对对苹果酸(○，对照组；●：添加组)和丙氨酸(□，对照组；■，添加组)合成的影响图，数据为平均值±标准偏差。
由图3可知：随着发酵的进行，流加乙醛实验组中的苹果酸要比对照组的浓度低，特别是在96h，流加组苹果酸的浓度为138mg/L，只有对照组55.4％。在微生物体内，糖酵解产生丙酮酸的同时还生成等量的NADH，当溶氧不充足时，菌体可以通过发酵将有机物氧化放出的电子直接传递给底物本身，产生各种不同的代谢产物，例如：苹果酸酸发酵。我们在菌体发酵过程中流加乙醛后，其生成量减少，说明流加乙醛后减弱了碳代谢流向有机酸合成方向，反而转向了醇类合成方向。另外，随着发酵的进行，流加组中丙氨酸比对照组的浓度低，112h，流加组丙氨酸浓度为5.6mg/L，只有对照组的26.3％。说明流加乙醛作为NADH的外源电子受体，被还原成乙醇，从而减弱了丙酮酸向丙氨酸的转化效率，而丙氨酸与谷氨酰胺合成酶(GS)的活性成反比关系，当丙氨酸浓度降低，GS酶活上升，而谷氨酸的量也相应的增加了，使得更多的谷氨酸在GS酶的作用下转化成谷氨酰胺，谷氨酰胺的酰胺氮又是3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)直接供体，这样就促进了利福霉素SV的合成。
图4为流加乙醛对谷氨酸(○，对照组；●：添加组)和苯丙氨酸(□，对照组；■，添加组)合成的影响图，(数据为平均值±标准偏差)。
由图4可知：随着发酵的进行，流加组中谷氨酸比对照组的浓度高，112h，流加组谷氨酸浓度为2.3g/L，比对照提高29％；而流加组的苯丙氨酸在发酵后期比对照低，120h时，流加组苯丙氨酸的浓度为0.238mg/L，只有对照的17.1％。从以上结果我们分析流加乙醛作为NADH的外源电子受体，被其还原成乙醇，从而减弱了丙酮酸向丙氨酸的转化效率，而丙氨酸与谷氨酰胺合成酶(GS)的活性成反比关系，当丙氨酸浓度降低，GS酶活上升，而谷氨酸的量也相应的增加了，使得更多的谷氨酸在GS酶的作用下转化成谷氨酰胺，谷氨酰胺的酰胺氮又是3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)直接供体，这样就促进了利福霉素SV的合成。
具体实施方式
实施例1
1、培养基的制备
(1)种子培养基
葡萄糖1.5g,黄豆饼粉1.0g,蛋白胨1.0g,硝酸钾0.05g,碳酸钙0.2g,可溶性淀粉1.5g,定容至100mL，pH7.0。经0.1MPa高压蒸气灭菌30min备用；
(2)发酵培养基
葡萄糖6-10g,鱼粉0.3-0.55g,黄豆饼粉0.5-0.65g,蛋白胨0.4-0.7g硝酸钾0.6-0.8g,碳酸钙0.5g,磷酸二氢钾0.02g,定容至100mL，pH自然。经0.1MPa高压蒸气灭菌30min备用；
2、菌种活化
取保藏的地中海拟无枝酸菌(A.mediterranei)菌种接入种子培养基，在摇床上培养48h，培养条件为28℃、220r/min；
3、菌种扩大培养与合瓶细胞的收集
将上述菌种接到发酵摇瓶培养基中，装液量为50mL/250mL三角瓶，接种量为5％，于27℃、150r/min振荡培养46h，然后无菌操作将摇瓶种子培养基合瓶；
4、二级种子培养和三级发酵
将合瓶种子火焰保护接入二级种子罐，培养温度28℃，转速为160r/min，空气流量控制为0.8vvm，罐压控制为0.03MPa，48h无菌操作补入三级发酵罐；
5、三级发酵罐控制
培养温度28℃，转速0-48h为200r/min，48-72h为220r/min，72-96h为230r/min，96h至放罐为240r/min。空气流量控制：0-48h为0.4vvm，48-72h为0.6vvm，72-96h为0.8vvm，96h至放罐为1vvm。罐压控制：0-48h为0.02MPa，48-72h为0.03MPa，72-96h为0.04MPa，96h至放罐为0.05MPa。
6、调控因子的补加
市售乙醛无菌操作与无菌水混合，发酵周期48h时，开始无菌操作将乙醛溶液流加至三级发酵罐(100L)，至发酵结束前10h停止流加，使乙醛终浓度为1.5mmol/L。
实施例2
1、培养基的制备：同实施例1。
2、菌种活化：同实施例1。
3、菌种扩大培养与合瓶细胞的收集：同实施例1。
4、二级种子培养和三级发酵：同实施例1。
5、三级发酵罐控制：同实施例1。
6、调控因子补加
市售乙醛无菌操作与无菌水混合，发酵周期为60h时，开始无菌操作将乙醛溶液流加至三级发酵罐(100L)，至发酵结束前10h停止流加，使乙醛终浓度为2.0mmol/L。
实施例3
1、培养基的制备：同实施例1。
2、菌种活化：同实施例1。
3、菌种扩大培养与合瓶细胞的收集：同实施例1。
4、二级种子培养和三级发酵：同实施例1。
5、三级发酵罐控制：同实施例1。
6、调控因子补加
市售乙醛无菌操作与无菌水混合，发酵周期为72h时，开始无菌操作将乙醛溶液流加至三级发酵罐(100L)，至发酵结束前10h停止流加，使乙醛终浓度为3.0mmol/L。