一种鼠类携带病原体的TAQMAN低密度检测芯片.pdf

本发明公开了一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片，可以同时检测拉沙热病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒、萨累玛病毒等24种强致病性病毒，能够高通量、灵敏、准确的检测鼠类携带的24种强致病性病毒。降低交叉污染机会，避免了不同病毒引物和探针之间交叉反应，提高反应的特异性和灵敏性，同时节约试剂盒模板使用量，在一块384孔TaqMan低密度检测芯片上同时可以对8个样品192个项目同时检测，大大缩短了检测时间，操作简便。

1.   一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片，包括384孔TaqMan低密度芯片，固定于TaqMan低密度芯片上检测各类病毒的引物和探针，其特征在于TaqMan低密度芯片上固定有：检测拉沙热病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示；检测多不拉伐病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.6所示；检测辛诺柏病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.9所示；检测淋巴脉络丛脑膜炎病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.12所示；检测通托河病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15所示；检测萨累玛病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.16至SEQ ID NO.18所示；检测贝尤病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.21所示；检测贝尔梅霍病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.22至SEQ ID NO.24所示；检测莫佩亚病毒病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27所示；检测黑山病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.28至SEQ ID NO.30所示；检测蓝河病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.31至SEQ ID NO.33所示；检测卡塔琳娜病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.34至SEQ ID NO.36所示；检测格伯格洛伯病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.37至SEQ ID NO.39所示；检测岛景病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.40至SEQ ID NO.42所示；检测莱奇瓜纳斯病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.45所示；检测马西埃尔病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.46至SEQ ID NO.48所示；检测美利奴病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.49至SEQ ID NO.51所示；检测莫罗戈罗病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.52至SEQ ID NO.54所示；检测奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.55至SEQ ID NO.57所示；检测奥洛格兰德病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.60所示；检测斯金纳坦克病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.61至SEQ ID NO.63所示；检测瓜纳瑞托病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.64至SEQ ID NO.66所示；检测查帕雷病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.67至SEQ ID NO.69所示；检测卢约病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.70至SEQ ID NO.72所示。

一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片
技术领域
 本发明涉及鼠类携带的病原体检测，具体涉及一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片。
背景技术
鼠类属啮齿动物，是重要的医学媒介生物，可以以储存宿主或中间宿主的形式在全球范围内传播各类疾病，成为造成人类严重的众多卫生问题之一，已知全球可由鼠类传播的疾病中病毒性疾病有30余种。如拉沙热病毒等能引起严重的人类病毒性出血热，病死率最高可达30%；淋巴脉络丛脑炎病毒等则会引起脑炎症状。随着国际间交流日益频繁，鼠类携带强致病性病原体的传入及赴流行地区感染鼠类的危险日益加大。目前，鼠类携带病原体中病毒的培养分离为其诊断的金标准，但细胞培养需要较高的实验室条件，同时大多数病毒感染性强，需在4级生物安全实验室内操作，很大程度上限制了该方法的应用。血清学检测方法和病毒核酸检测方法使得在较低生物安全条件下能够进行病毒检测得到更广泛应用个，尤其是以PCR技术为代表的核酸检测技术。荧光定量PCR术是据普通PCR技术发展起来的基因检测新技术，它具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，被广泛应用于生命科学研究的各个领域。TaqMan低密度芯片本质是基于微流控技术的实时荧光定量PCR检测系统，将TaqMan技术的专一性、灵敏性及便捷性与实时定量PCR技术结合起来的一种技术，TaqMan低密度芯片科研根据用户在反应板中固话不同的探针和引物，可以同时检测1个标本的384个不同检测项目或8个标本的48个检测项目，节省试剂，操作简便。与普通芯片相比较，不仅方便与高通量性，同时可以提供荧光定量PCR的特性，具有高特异性、高灵敏度以及宽幅的检测范围。目前，尚未有报道基于TaqMan低密度芯片技术建立同时对鼠类携带拉沙热病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒等24种病毒检测技术的专利及文献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片，可以同时检测拉沙热病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒、萨累玛病毒等24种强致病性病毒，能够高通量、灵敏、准确的检测鼠类携带上述24种强致病性病毒。
本发明的技术方案是一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片，包括384孔TaqMan低密度芯片，固定于TaqMan低密度芯片上检测各类病毒的引物和探针，该TaqMan低密度芯片上固定有：检测拉沙热病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3；检测多不拉伐病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.6；检测辛诺柏病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.9；检测淋巴脉络丛脑膜炎病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.10至SEQ ID NO.12；检测通托河病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.13至SEQ ID NO.15；检测萨累玛病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.16至SEQ ID NO.18；检测贝尤病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.19至SEQ ID NO.21；检测贝尔梅霍病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.22至SEQ ID NO.24；检测莫佩亚病毒病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27；检测黑山病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.28至SEQ ID NO.30；检测蓝河病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.31至SEQ ID NO.33；检测卡塔琳娜病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.34至SEQ ID NO.36；检测格伯格洛伯病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.37至SEQ ID NO.39；检测岛景病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.40至SEQ ID NO.42；检测莱奇瓜纳斯病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.45；检测马西埃尔病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.46至SEQ ID NO.48；检测美利奴病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.49至SEQ ID NO.51；检测莫罗戈罗病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.52至SEQ ID NO.54；检测奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.55至SEQ ID NO.57；检测奥洛格兰德病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.58至SEQ ID NO.60；检测斯金纳坦克病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.61至SEQ ID NO.63；检测瓜纳瑞托病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.64至SEQ ID NO.66；检测查帕雷病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.67至SEQ ID NO.69；检测卢约病毒的引物和探针，其核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID NO.70至SEQ ID NO.72。
本发明所述的TaqMan低密度检测芯片，还包括阴性对照和阳性对照，阴性对照为正常组织细胞RNA，阳性对照可以为人工合成上述24种病毒的阳性质粒扩增目的片段转录RNA：pGEM-T- 拉沙热病毒、pGEM-T-多不拉伐病毒、pGEM-T-辛诺柏病毒、pGEM-T-淋巴脉络丛脑膜炎病毒、pGEM-T-通托河病毒、pGEM-T-萨累玛病毒、pGEM-T-贝尤病毒、pGEM-T-贝尔梅霍病毒、pGEM-T-牛轭湖病毒、pGEM-T-黑山病毒、pGEM-T-蓝河病毒、pGEM-T-卡塔琳娜病毒、pGEM-T-格伯格洛伯病毒、pGEM-T-岛景病毒、pGEM-T-莱奇瓜纳斯病毒、pGEM-T-马西埃尔病毒、pGEM-T-美利奴病毒、pGEM-T-莫罗戈罗病毒、pGEM-T-奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒、pGEM-T-奥洛格兰德病毒、pGEM-T-斯金纳坦克病毒、pGEM-T-瓜納瑞托病毒、pGEM-T-查帕雷病毒、pGEM-T-卢约病毒，其建立方法为将引物扩增区域前后延长进行基因合成为阳性质粒基因序列（序列分别如SEQ ID NO：73-96），然后将其克隆至pGEM-T-easy载体中，通过转录为RNA后为阳性RNA样品。
本发明具有下列优点：一种鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片，可以同时检测拉沙热病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒、萨累玛病毒等24种强致病性病毒，能够高通量、灵敏、准确的检测鼠类携带的24种强致病性病毒。降低交叉污染机会，避免了不同病毒引物和探针之间交叉反应，提高反应的特异性和灵敏性，同时节约试剂盒模板使用量，在一块384孔TaqMan低密度检测芯片上同时可以对8个样品192个项目同时检测，大大缩短了检测时间，操作简便。
具体实施方式
实施例1、鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片的制备
特异性引物探针制备：根据Genbank下载已公布鼠类携带病原体中需要的24种病毒基因序列，使用Beacon designer 7.0、Primer Express 3.0等软件进行特异性引物和探针设计，选择引物长度在18-24bp之间，Tm值在58-62℃之间，GC含量在40%-60%之间。探针长度在18-25bp，TM值在65-67℃之间。得到特异性引物和探针24组，检测引物和探针的核苷酸序列分别为为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.72所示。阳性模板制备：将设计的24种病毒的特异性引物扩增区域前后延长进行基因合成为阳性质粒基因序列（序列分别如SEQ ID NO：73-96），然后将其克隆至pGEM-T-easy载体中，人工合成拉沙热病毒、淋巴脉络丛脑膜炎病毒等24种核酸片段（上海生工生物工程有限公司合成），连接至pGEM-T easy 载体，转化至DH5α大肠杆菌，挑取克隆酶切鉴定，选取阳性克隆和阴性克隆增菌培养，使用质粒提取试剂盒（宝生物工程公司）提取阳性质粒。使用T7启动子引物和Oligod（T）15扩增目的片段，反应体系：DW 11.8μL、10 X PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mM each）1.6μL、rTaq（5U/μL）0.4μL、Mgcl₂1.2μL 、T7（20μM）1μL、oligod（T）₁₅ 1μL、质粒模板 1μL，共20μL。反应条件94℃ 5min，94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min（35cycle）72℃ 7min。使用T7RNA聚合酶合成阳性RNA，反应体系：10 X T7 RNA polymerase buffer 4μL、50mM DTT 4μL 、ATP/CTP/GTP/UTP（100mM）each 0.8μL、RNase inhibitor 1μL 、PCR扩增产物8μL 、T7 RNA polymerase 2μL 、DDW17.8μL，反应条件：37℃ 2h。将转录好的RNA使用DNase I消除模板DNA，在转录产物中加入6μLDNA酶缓冲液，DEPC DDW 2ul，DNA酶2ul（10U），37度30min，反应产物选用RNA纯化试剂盒进行纯化（宝生物工程公司）作为阳性模板。TaqMan低密度检测芯片制备：将设计引物、探针序列送ABI公司定制TaqMan低密度芯片，该TaqMan低密度芯片为8列，每列48孔，可检测8个样品。本设计委托ABI公司将24种特异性引物和探针固定于384板中，每孔引物固定浓度为600nM，探针固定浓度为180nM。每个样品检测24个项目，每个项目重复1次。
实施例2、鼠类携带病原体的TaqMan低密度检测芯片的检测方法
在每个反应管中加入2 X RT-PCR Buffer 50μL，25 X RT-PCR Enzyme Mix 4μL、Nuclease-free Water 26μL、转录病毒RNA 20μL。加入到384孔TaqMan低密度芯片上样孔中，进行离心封卡处理后使用ABI ViiA? 7进行反应，反应条件45℃10min、95℃10min、95℃30s和60℃45s交替循环45次。单点荧光检测在60℃，荧光通道选用FAM荧光探针通道。结果判定：同一检测项目2个检测孔均无Ct值或Ct值＞35，且无明显扩增曲线，判断为荧光RT-PCR检测阴性；同一检测项目2个检测孔Ct值均≤35，并有明显扩增曲线，初步判断为病毒荧光RT-PCR检测阳性；同一检测项目2个检测孔其中一个孔35＜Ct≤40或者其中一个Ct≤35另一个Ct值>35的标本应重做，若重做仍有明显扩增曲线，则判定为病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则则为阴性。本次试验结果显示，每种特性阳性转录病毒RNA在对应的检测孔均能得到荧光曲线，Ct值均<35，阴性对照各孔均无明显扩增曲线且Ct值均＞40。
实施例3、病毒阳性样本检测
临床样品RNA提取：选用本实验室保存了鼠类感染的卢约病毒样本DX1401、黑山病毒样本DX1402、淋巴脉络丛脑膜炎病毒样本DX1403，无菌取肺和肾组织各5mg加入300μL灭菌PBS匀浆，吸取100μL匀浆液用RNA提取试剂盒RNA进行RT-PCR检测。用微量分光光度计测量RNA浓度和纯度，OD260/280≥1.9,表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染。使用384孔TaqMan低密度芯片反应（参照实施例2进行），同时随机选择拉沙热病毒阳性质粒转录RNA作为阳性对照，VERO细胞RNA作为阴性对照。实验结果：实验结果显示感染卢约病毒样品DX1401在对应的卢约病毒检测孔的Ct值分别为29.67、29.88，感染黑山病毒样本DX1402在对应的黑山病毒检测孔的Ct值分别为30.85、31.03，感染淋巴脉络丛脑膜炎病毒样品DX1403样在对应的淋巴脉络丛脑膜炎病毒检测孔的Ct值分别为 29.12和29.29，其余各组检测孔荧光通道均无明显曲线或Ct值>40，同时阳性对照样品中拉沙热病毒质粒对应孔荧光值分别为26.78和27.01，阴性对照所有检测孔荧光通道均无明显曲线或Ct值>40，显示显示DX1401为卢约病毒， DX1402为黑山病毒， DX1403为淋巴脉络丛脑膜炎病毒，拉沙热病毒质粒检测呈阳性。
实施例4、各病毒阳性质粒转录RNA检测
同实施例3基本相同，所不同的只是阳性对照样品不同，阳性对照样品可以是萨累玛病毒阳性质粒、多不拉伐病毒阳性质粒、辛诺柏病毒阳性质粒、通托河病毒阳性质粒、贝尤病毒阳性质粒、贝尔梅霍病毒阳性质粒、莫佩亚病毒阳性质粒、蓝河病毒阳性质粒、卡塔琳娜病毒阳性质粒、格伯格洛伯病毒阳性质粒、岛景病毒阳性质粒、莱奇瓜纳斯病毒阳性质粒、马西埃尔病毒阳性质粒、美利奴病毒阳性质粒、莫罗戈罗病毒阳性质粒、奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒阳性质粒、奥洛格兰德病毒阳性质粒、斯金纳坦克病毒阳性质粒、瓜納瑞托病毒阳性质粒和/或查帕雷病毒阳性质粒，检测结果都可以在相对应的反应孔中得到明显曲线和Ct值，且同一检测项目2个检测孔Ct值均≤35。
<110>中华人民共和国大榭出入境检验检疫局
 
<120>鼠类病原体TaqMan低密度检测芯片及检测方法
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<170> PatentIn version 3.1
 
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TCAGGTTCCA CAATAATTC  19
 
 
<210>30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据黑山病毒设计的特异性探针BBTV P
<400>30
FAM- ACAGGAACAA GGATAAGACC ACACT -BHQ1   25
 
 
<210>31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据蓝河病毒设计的特异性引物BRV F
<400>31
GGTCATAGGA CAATGTATTT ATAC   24
 
 
<210>32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据蓝河病毒设计的特异性引物BRV R
<400>32
TGAGGAGCCG TAAGATTC  18
 
 
<210>33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据蓝河病毒设计的特异性探针   BRV P
<400>33
FAM- CCAGTCTCTT CTCCTTGCTT CCA -BHQ1  23
 
 
<210>34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据卡塔琳娜病毒设计的特异性引物CTNV F
<400>34
CCATCAATCA TCCATGAAG   19
 
 
<210>35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据卡塔琳娜病毒设计的特异性引物CTNV R
<400>35
CTCCAGACAT TTGTAATCC   19
 
 
<210>36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据卡塔琳娜病毒设计的特异性探针CTNV P
<400>36
FAM- TGGCAGTCAG CATCATAGCA ATTC -BHQ1   24
 
 
<210>37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据格伯格洛伯病毒设计的特异性引物GBAV F
<400>37
CGCTCTCTTG TACGAAAA  18
 
 
<210>38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据格伯格洛伯病毒设计的特异性引物GBAV  R
<400>38
GGATGGACAG GTGAAATG  18
 
 
<210>39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据格伯格洛伯病毒设计的特异性探针GBAV P
<400>39
FAM- CAATAGCCAT CATTACATTC AGGTCGG -BHQ   27
 
 
<210>40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据岛景病毒设计的特异性引物ISLAV F
<400>40
ACCTGTATGT CTCAATGC   18
 
 
<210>41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据岛景病毒设计的特异性引物ISLAV R
<400>41
CTCCCAGTCT TTCACAAA  18
 
 
<210>42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据岛景病毒设计的特异性探针ISLAV P
<400>42
FAM- CACAGTCCAC AATGAAGGCA GATG -BHQ1   24
 
 
<210>43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据莱奇瓜纳斯病毒设计的特异性引物     LECV F
<400>43
CAGGTTGAGT GGAGAAAA 18
 
 
<210>44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据莱奇瓜纳斯病毒设计的特异性引物LECV R
<400>44
CGAAGGTTCA CAGTTTTAG  19
 
 
<210>45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据莱奇瓜纳斯病毒设计的特异性探针LECV P
<400>45
FAM- AGAGCGACAC AACTGACACA ACTA -BHQ1   24
 
 
<210>46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据马西埃尔病毒设计的特异性引物MCLV F
<400>46
GGCACAAAAG GTTCTTTC  18
 
 
<210>47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据马西埃尔病毒设计的特异性引物MCLV R
<400>47
CCTGGAATGA CACATCTC  18
 
 
<210>48
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据马西埃尔病毒设计的特异性引物MCLV P
<400>48
FAM- ACCTTACAGA ACCACATATC ACCACA -BHQ1   26
 
 
<210>49
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据美利奴病毒设计的特异性引物MWV F
<400>49
GCCTCTTCAC TTTCAGTA  18
 
 
<210>50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据美利奴病毒设计的特异性引物MWV R
<400>50
GAGACTCACC CAATCTTG  18
 
<210>51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据美利奴病毒设计的特异性探针MWV P
<400>51
FAM- CAGCAATCAT CTATCAACAT CTCAGGC -BHQ1   27
 
 
<210>52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据莫罗戈罗病毒设计的特异性引物MORV F
<400>52
CCTTGTATTG CTTAGTCAA   19
 
 
<210>53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据莫罗戈罗病毒设计的特异性引物MORV R
<400>53
GGGAAATAGA GAGCTTTATA TAG    23
 
 
<210>54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据莫罗戈罗病毒设计的特异性探针MORV  P
<400>54
FAM- CTCAGGACCA AGATGTTCAC CAGA -BHQ1  24
 
 
<210>55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒设计的特异性引物OCEV F
<400>55
CAAGGCTACA AGAAGTGA   18
 
 
<210>56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒设计的特异性引物OCEV R
<400>56
GAGGTTAGGA GAATCAATG  19
 
 
<210>57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒设计的特异性探针OCEV P
<400>57
FAM- TCTCCAGGCG TGCTTCTAAC AA -BHQ1   22
 
 
<210>58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据奥洛格兰德病毒设计的特异性引物ORGV F
<400>58
GTGCATCAAG GAATTCTAA   19
 
 
<210>59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据奥洛格兰德病毒设计的特异性引物OCEV R
<400>59
CCCTGAGGTA TAAGAAACA  19
 
 
<210>60
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据奥洛格兰德病毒设计的特异性探针OCEV P
<400>60
FAM- CCCTGAGGTA TAAGAAACA -BHQ1   19
 
 
<210>61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据斯金纳坦克病毒设计的特异性引物SKTV F
<400>61
CTTCGTTCCC TTTGTAGA  18
 
 
<210>62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据斯金纳坦克病毒设计的特异性引物SKTV R
<400>62
GCTCTTCCAG ATGTTCAC   18
 
 
<210>63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据斯金纳坦克病毒设计的特异性探针SKTV P
<400>63
FAM- ATTGCGATTA TGCTGACTGC CAC -BHQ1  23
 
 
<210>64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据瓜納瑞托病毒设计的特异性引物GTOV F
<400>64
TGGCTTCTGA ATTACTCTG   19
 
 
<210>65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据瓜納瑞托病毒设计的特异性引物 GTOV R
<400>65
GAGGTTAGGG GCTTATGA  18
 
 
<210>66
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据瓜納瑞托病毒设计的特异性探针RV P
<400>66
FAM- AGGACTTCAT CATAGCCGTA ACAACA -BHQ1  26
 
 
<210>67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据查帕雷病毒设计的特异性引物CHAV F
<400>67
TTCGGGTTTC TACTCAAG  18
 
 
<210>68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据查帕雷病毒设计的特异性引物CHAV R
<400>68
GCAGTTGTGT CTCCCATA 18
 
 
<210>69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据查帕雷病毒设计的特异性探针CHAV P
<400>69
FAM- TGGTTCTGCC TGCCTTCTCA -BHQ1  20
 
 
<210>70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据卢约病毒设计的特异性引物LUJV  F
<400>70
CCTCTCTCAA TAGTCTACAG 20
 
 
<210>71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据卢约病毒设计的特异性引物LUJV R
<400>71
GCTCAGTTCC TACACATTA   19
 
 
<210>72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据卢约病毒设计的特异性探针LUJV P
<400>72
FAM- CCAAGTCTCA TTCCACCACC A -BHQ1  21
 
 
<210>73
<211>253
<212> DNA
<213>人工合成拉沙热病毒(Lassa virus)目标片段质粒
<400>73
Ttgatcaaag agagaaatct gatcatcact agaggtataa gcatctatcg taccaccgca 60
tatacaactg atagcataat taatgaacct ctctgaaatg agggcataaa aatctgatgt 120
gttgtgtaat attccttgac ccatgtcaag tattgaactg atgtgagaag gcactacacc 180
agcttggaaa ttagagtaaa agaaatcttc tgttattgac tgtttagttt tcttccttaa 240
ccctagttgg gct   253
<210>74
<211>118
<212> DNA
<213>人工合成多不拉伐病毒(Dobrava virus)目标片段质粒
<400>74
Tccttctttt cctttcttta ctaacaacaa ctacctacct caaaacaaca acactacctc  60
aacaactact acctcattga tttgcttcct gaatgtctct ttagggagtc tactacta   118
 
 
<210>75
<211> 195
<212> DNA
<213>人工合成辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)阳性质粒
<400>75
Agctactacg actaaagctg gaatgagcac cctcaaagaa gtgcaagaca acatcactct  60
ccacgaacaa caactcgtga ctgccaggca gaagctcaaa gatgcagaaa gagcggtgga  120
attggacccc gatgatgtta acaaaagcac attacagagc agacgggcag ctgtgtctgc    180
attggagacc aaact   195
 
 
<210>76
<211> 253
<212> DNA
<213>人工合成淋巴脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)阳性质粒
<400>76
Caattttggt ggagtctgga attgtatgcc caggactacc acttatcatt cctgatggtt 60
acaagctgat agacaattct ctcattcttc ttgagtgttt tgttaggagc tcaccagcca 120
gttttgagaa gaaatttata gaggacacta acaaattggc atgcatcagg gaagaccttg 180
ctgttgcggg tgtcacatta gttccaatag tagatggtcg ttgtgattat gataatagtt  240
ttatgccaga gtg   253
 
<210>77
<211> 219
<212> DNA
<213>人工合成通托河病毒(Tonto creek virus)阳性质粒
<400>7
Caacctcagg aagtgtcggg cccacaattt tgtggtccct aagaatttga ttcactgttt 60
tgttcctgtt gggaatgcag ccatgcttca cacatgagtc aatctcaata agcattgaca 120
aaagtttcaa gccttcggtg acaatggagg aggagttgac ctgtgatagg aggatcgttt 180
tctgctcagc atagaactct tcatcaggaa cccactttc  219
 
 
<210>78
<211> 155
<212> DNA
<213>人工合成萨累玛病毒(Saaremaa virus)阳性质粒
<400>78
Ggcagagtta ggtgcatttt ttgctgtcct ccaggatatg aggaatacaa tcatggcatc 60
caagactatt ggaacatcgg aggagaagct gagaaagaag tcctcattct atcaatctta 120
ccttcgaagg acacagtcca tgggaattca actgg  155
 
 
<210>79
<211> 157
<212> DNA
<213>人工合成贝尤病毒(Bayou virus)阳性质粒
<400>79
Tgtgaggctt attcagagaa tgggatcttt aatattagtt ccccaacttg tctcataaat 60
aaagttcaaa agttcagagg ttcagagcag agaataaact ttatatgcca aaggatagac 120
aacgatgtag tggtatattg taatggtcag aagaaag  157
 
 
<210>80
<211> 158
<212> DNA
<213>人工合成贝尔梅霍病毒(Bermejo virus)阳性质粒
<400>80
Gctgtgagag ttgaaactat caaagccatc actgccatag gagccaatac tagttgatat 60
ctaagaatca ggttggttag atggattttc tgggcttgtg ccaatcattt aatcatctca 120
ggactctcta atgtgattaa tacgggttga tcatgagg  158
 
 
<210>81
<211> 180
<212> DNA
<213>人工合成牛轭湖病毒(Bayou virus)阳性质粒
<400>81
Agcctgatga ccatttaaaa gaaaagtcat ctctcaggta tgggaatgtc cttgatgtca 60
actccattga ccttgaagaa ccaagtggcc agacagcaga ctggaaggca atcggagtct 120
acattctcag ttttgtcctt ccaatcgttc tgaaggctct gtacatgctg tcaactagag  180
 
 
<210>82
<211> 203
<212> DNA
<213>人工合成黑山病毒(Black Mesa virus)阳性质粒
<400>82
Cggtccacgt aataatttga ccttccgtca atcacaggaa caaggataag accacacttg 60
ctcaaatctt tagacaactg aattagtttc tcaaaatcat gtttatattt ctgctcaaat 120
gactcctggt tgactcgaac aaaggtttcc aagagaatta ttgtggaacc tgacactcta 180
tatccgtctg gaacaacgtc tgg  203
 
 
<210>83
<211> 257
<212> DNA
<213>人工合成蓝河病毒(Blue River virus)阳性质粒
<400>83
Gcaaaagaaa gtgatcctca caaaaacatt ggtcatagga caatgtattt atacattcac 60
cagtctcttc tccttgcttc caggtgtggc ccattcactt gccgttgaat tatgtgtacc 120
agggcttcat ggctgggcaa cgactgcttt actcatcaca ttctgttttg gatggctgct 180
tataccctcg gtaacattaa taatattaag aatcttacgg ctcctcacat tttcttgctc 240
acactactca acagagt  257
 
 
<210>84
<211> 146
<212> DNA
<213>人工合成卡塔琳娜病毒(Catarina virus)阳性质粒
<400>84
Gggcagtttc tctctttctt aggggaaatc ccatcaatca tccatgaagc cctaaatatt 60
gctctgatgg cagtcagcat catagcaatt ctgaaaggga ttacaaatgt ctggagaagc 120
gggatcctac agctactcat cttttt   146
 
 
<210>85
<211> 246
<212> DNA
<213>人工合成格伯格洛伯病毒(Gbagroube virus)阳性质粒
<400>85
Tggatatgac acctctaaac atgaccatgc cgctctcttg tacgaaaaac aatagccatc 60
attacattca ggtcggcaat gacacagggt tggagttgac tctaacaaac acatcaatca 120
tacatcacaa attttgcaac ctgtctgatg cacataaaaa gaacctctac gatcatacat 180
taatgagcat catctcaaca tttcacctgt ccatccccaa cttcaaccag tatgaggcca 240
tgagct   246
 
 
<210>86
<211> 233
<212> DNA
<213>人工合成岛景病毒(Isla Vista virus)阳性质粒
<400>86
Aagaaattaa tggaatacgt cgcccaaaac acctgtatgt ctcaatgcca actgcacagt 60
ccacaatgaa ggcagatgaa ctcactcctg gtaggttccg gaccattgtc tgtggtctat 120
ttcctgcaca gataatgaat aggaatatta ttagtccagt catgggagtg attggttttg 180
ctttttttgt gaaagactgg gaggataaaa ttcaagaatt cctcaggaag caa  233
 
 
<210>87
<211>152
<212> DNA
<213>人工合成莱奇瓜纳斯病毒(Lechiguanas virus)阳性质粒
<400>87
Actacatcca tgacccaaaa aagttataca caggttgagt ggagaaaaaa gagcgacaca 60
actgacacaa ctaatgctgc agccacgaca ttcgaatcac aagctaaaac tgtgaacctt 120
cgtgggactt gtgttttggc tgcagagcta ta  152
 
 
<210>88
<211> 196
<212> DNA
<213>人工合成马西埃尔病毒(Chapare virus)阳性质粒
<400>88
Aatactgtct ctggctataa aagattgatg ggcacaaaag gttctttcca atcatttaac 60
cttacagaac cacatatcac cacaaataaa cttgaatgga ttgacccaga tggtaatacc 120
cgtgatcatg taaatctcat cttaaataga gatgtgtcat tccaggatct gagtgacaac 180
ccttgtaaag tagatt  196
 
 
<210>89
<211> 253
<212> DNA
<213>人工合成美利奴病毒(Menekre virus)阳性质粒
<400>89
Ctggagactc tgtgataaac ataccatact gcctcttcac tttcagtatt gactggagga 60
ttgactcaac attctgtggg gtgactttca gactttccag catgttcccc ccatcaagca 120
tgactgcacc agccttcact gctgcactca aactaaaatt atagcctgag atgttgatag 180
atgattgctg ttcctgaatg atgttcaagat tgggtgagtc tcactcaact tctccaagt 240
ccgtcatgtt agg    253
 
 
<210>90
<211> 156
<212> DNA
<213>人工合成莫罗戈罗病毒(Morogoro virus)阳性质粒
<400>90
Ctaaactcat tctcatcatt taagcaactc cccttgtatt gcttagtcaa tgcctcaaaa 60
taatcttcta tcagtctggt gaacatcttg gtcctgaggt cccctatata aagctctcta 120
tttcccccaa cttgctcttt gtaggacaat gagaac  156
 
 
<210>91
<211> 260
<212> DNA
<213>人工合成奥科索科奥特拉-德埃斯皮诺萨病毒(Ocozocoautla de Espinosa virus)阳性质粒
<400>91
Cagaggaagt tttcaagata ggccttcaca caaggctaca agaagtgacc ctctctccag 60
gcgtgcttct aacaaatcat gatcacgaat tgccagtgtt atgttcagtg aataggacgc 120
atctatattt caaaggcggc aacttcagtt ttgaagttta cattgacgat gttgttgtcc 180
tacttatggt ggaaggtggc tccgacatct ccattgattc tcctaacctc agtgcctgtc 240
tcccagatgg tcaggagtgg  260
 
 
<210>92
<211> 162
<212> DNA
<213>人工合成奥洛格兰德病毒(Orogrande virus)阳性质粒
<400>92
Aattcatcat tcctaaactt aaacttgaca gtgcatcaag gaattctaaa aagacttctt 60
cactctgaat cttgtctgaa ccgaactcaa cttggtaaca ttcttcctta ttttgtttct 120
tatacctcag ggttggcttt tcacatctac tagagtgctc tc  162
 
 
<210>93
<211>232
<212> DNA
<213>人工合成斯金纳坦克病毒(Skinner Tank virus)阳性质粒
<400>93
Taggcttact tgagctgcgc ttaaatctga cttcgttccc tttgtagacc cagagccgaa 60
cttatcccag tttgacatca tggggcaatt gatatctctc tttgaaggaa ttccatcaat 120
tttaaatgag gctcttaatg ttgcactggt ggcagtcagc ataatcgcaa ttctgaaagg 180
gattgtgaac atctggaaga gcggtctcct acagcttctc accttcctga tc  232
 
 
<210>94
<211> 173
<212> DNA
<213>人工合成瓜納瑞托病毒(Guanarito virus)阳性质粒
<400>94
Tgaagaaact cttgtctagt ctgtcagcta tggcttctga attactctgt ctattgctca 60
ctctcacatc ctcctttagc ctaaaagctt cctctgagag ccccaatctg gacctatttt 120
tatgttcata agcccctaac ctctgatcaa atcctgcttg aatcaggatg tac   173
 
 
<210>95
<211> 203
<212> DNA
<213>人工合成查帕雷病毒(Chapare virus)阳性质粒
<400>95
Actaggtctt caattcttga actaattgtt ttcgggtttc tactcaagct atgggtaaca 60
ccaaaacaaa ggacagacag tatcaatcga actcaagcca acccacaaac acatctgcac 120
cagttctgct gagaaggcag gcagaaccaa gtctgtatgg gagacacaac tgcagatgct 180
gttggtttgc agacacaaac cta  203
 
<210>96
<211> 170
<212> DNA
<213>人工合成卢约病毒(lujo virus)阳性质粒
<400>96
Aagatcattc aatctcaata gtggatgtcc cctctctcaa tagtctacag catactccac 60
caagtctcat tccaccacca ggatgagcaa tcaccagatc cttgagatgc ttgctgtacg 120
ctaatgtgta ggaactgagc ttgacccatc cgattacccc tgagaaacag  170
 
 
<210>97
<211> 26
<212> DNA
<213> T7启动子引物序列
<400>97
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGG  26