一种水稻的育种方法.pdf

本发明提供了一种水稻的育种方法，包括以下步骤：a)采用CTAB法提取野生菰DNA；b)用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA；c)采用花粉管通道法将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。本发明通过限制性内切酶酶切野生菰DNA导入水稻后，后代的变异率比完整DNA导入明显提高，稳定速度快，获得了优良的水稻新株系和新品种。实验结果表明，酶切野生菰DNA导入水稻创新的水稻新品种茎秆粗大，穗大粒多，后期灌浆速度快，克服了大穗而分蘖力弱、包颈、结实率低的缺陷；田间观察未发现严重病虫害危害，是一批极具增产潜力的资源材料。

权利要求书1.  一种水稻的育种方法，包括以下步骤：a)采用CTAB法提取野生菰DNA；b)用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA；c)采用花粉管通道法将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。2.  根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Hind Ⅲ.和EcoR Ⅰ。3.  根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤a)具体为：a1)取野生菰幼叶，用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，加入1倍CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min；a2)向步骤a1)获得的溶液中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；a3)向步骤a2)获得的上清液中加入CTAB缓冲液、体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；a4)向步骤a3)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；a5)向步骤a4)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％冷乙醇-40℃冰箱中沉淀2h后离心；a6)将步骤a5)获得的沉淀用冷乙醇洗一次，自然干燥后，用TE缓冲液溶解，加入RNA酶贮存缓冲液处理后，获得野生菰DNA。4.  根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述2倍CTAB提取缓冲液包括：2％CTAB、100mMTris、20mM pH值为8.0的EDTA、1.4M NaCl和1％的分子量为40000的PVP。5.  根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述高盐缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA和1M NaCl。6.  根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，1倍TE缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA；RNA酶贮存缓冲液包括：1mg/mlRNaseA和100U/ml RNaseT1。7.  根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于，步骤b)包括：用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，酶切后的DNA用冷乙醇-40℃下过夜，离心，得到的沉淀干燥后用1倍SSC缓冲液溶解，获得酶切野生菰DNA。8.  根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，所述1倍SSC缓冲液包括：150mMNaCl,15mMpH值为8.0的C6H9Na3O9。9.  根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤c)为：在水稻开花1～3h，切柱头1/3～2/3，然后在切口处滴入步骤b)获得的酶切野生菰DNA溶液，浸泡去掉柱头的子房，将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。10.  根据权利要求9所述的育种方法，其特征在于，所述酶切野生菰DNA溶液的浓度为100-200μg/ml。

说明书一种水稻的育种方法
技术领域
本发明属于水稻育种技术领域，尤其涉及一种水稻的育种方法。
背景技术
现代水稻育种研究从理论和技术上已达到了很高的水平，但仍不能满足水稻生产发展的需求，尤其在抗病性、抗逆性、高光效、品质及产量等重要农艺性状的改良上成效不令人十分满意。这是因为水稻基因组本身有用的基因资源已利用殆尽。由于农作物育种目标的迫切性和现有育种手段和材料的局限性，迫使水稻育种专家去寻找更有效的育种新材料和新途径。
通过远缘杂交方法将外源基因转移到水稻，由于种间杂交的不亲和性，杂交后代疯狂分离，很难得到稳定的后代。
花粉管通道法由我国周光宇先生70年代提出，在水稻、棉花、玉米、大豆、瓜类等大多农作物上得到广泛应用。但主要采用整体DNA导入。
野生菰是水稻的近缘属植物。菰中蕴含丰富的有利基因，具有明显的比较优势：①株型良好，光合效率较理想；分蘖能力很强，生长速度快，生物产量高。②抗逆性强，野生菰的耐冷性强，耐旱耐涝，抗病性强.③灌浆成熟极快，授粉后15天左右灌浆成熟完毕，随即进入后熟。④营养价值高。将野生菰的基因导入水稻中，选择具有水稻和菰优良性状和保健作用的新品种。开展高产、优质、抗性强的巨穗型水稻新品种的产业化示范推广，将有助于提高水稻单产,提高水稻的营养价值,增加水稻抗性，对于我国水稻绿色产业的发展和保障国家粮食安全具有重要的战略意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻的育种方法，本发明通过限制性内切酶酶切野生菰DNA导入水稻后，后代的变异率比完整DNA导入明显提高，稳定速度快，获得了优良的水稻新株系和新品种。
本发明提供了一种水稻的育种方法，包括以下步骤：
a)采用CTAB法提取野生菰DNA；
b)用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA；
c)采用花粉管通道法将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。
优选的，所述限制性内切酶为HindⅢ.和EcoRⅠ。
优选的，所述步骤a)具体为：
a1)取野生菰幼叶，用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，加入1倍CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min；
a2)向步骤a1)获得的溶液中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
a3)向步骤a2)获得的上清液中加入CTAB缓冲液、体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
a4)向步骤a3)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；
a5)向步骤a4)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％冷乙醇-40℃冰箱中沉淀2h后离心；
a6)将步骤a5)获得的沉淀用冷乙醇洗一次，自然干燥后，用TE缓冲液溶解，加入RNA酶贮存缓冲液处理后，获得野生菰DNA。
具体而言，所述步骤a)包括以下步骤：
a1)取50克野生菰幼叶，用液氮研磨，加入50ml 2倍CTAB提取缓冲液的500ml离心管中充分混匀后，再加入50ml 1倍CTAB缓冲液，在55-65℃恒浴30min
a2)向步骤a1)获得的溶液中加入150ml氯仿:异戊醇(24:1)，充分摇动5min，8000r/min，室温下离心5min。
a3)向步骤a2)获得的上清液中加入1/10体积的10％的CTAB缓冲液，加入200ml氯仿:异戊醇(24:1)，充分摇动5min，4000r/min，室温下5min离心。
a4)向步骤a3)获得的上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，室温下30min，5000转，4℃离心5min。得到沉淀用0.8ml高盐缓冲液充分溶解，15000r/min离心2min。
a5)向步骤a4)获得的上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，室温下30min，5000转，4℃离心5min。得到的沉淀用4ml双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％的冷乙醇，-20℃冰箱中2h以上，15000转离心20min。
a6)步骤a5)获得的沉淀用70％的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用2000μl 0.1倍TE缓冲液溶解，加入200μl RNA酶贮存缓冲液(1mg/ml)，37℃，一小时降解RNA，获得野生菰DNA。
a7)紫外吸收光谱法检测DNA的浓度和纯度：
DNA浓度的检测采用紫外吸收光谱法。DNA溶液260的OD值为1，相当于约50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA，DNA浓度(μg/μl)＝OD260×核酸稀释倍数×50。(A 260/A 280≥1.8，A260/A230≥2.0表明DNA纯度符合质量要求。
优选的，所述2倍CTAB提取缓冲液包括：2％CTAB、100mM pH值为8.0的Tris、20mM pH值为8.0的EDTA、1.4M NaCl和1％重均分子量为40000的PVP。
优选的，所述高盐缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA和1M NaCl。
优选的，1倍TE缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA；RNA酶贮存缓冲液包括：1mg/ml RNaseA和100U/ml RNaseT1。
优选的，步骤b)包括：
用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，酶切后的DNA用冷乙醇-40℃下过夜，离心，得到的沉淀干燥后用1倍SS缓冲液溶解，获得酶切野生菰DNA。
具体而言，步骤b)包括：
用限制性内切酶HindⅢ.+EcoRⅠ酶切DNA，电泳检测。用琼脂糖凝胶电泳检测其分子量的分布范围，酶切完整的DNA呈弥散状。酶切后的DNA用2.5倍体积95％的冷乙醇，-40℃冰箱中过夜，15000转离心20min。沉淀干燥后用1SSC溶解，获得酶切野生菰DNA。其中，所述酶切野生菰DNA溶液的浓度为100-200μg/ml。
优选的，所述1倍SSC缓冲液包括：150mMNaCl,15mM C6H9Na3O9(柠檬酸三钠pH8.0)。
优选的，所述步骤c)为：
在水稻开花1～3h，切柱头1/3～2/3，然后在切口处滴入步骤b)获得的酶切野生菰DNA溶液，浸泡去掉柱头的子房，将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。
优选的，所述酶切野生菰DNA溶液的浓度为100-200μg/ml。
在本发明中，导入受体，即水稻应选择综合性状好，只有少数或个别性状需要改良的品种或品系，例如湘晚籼12号和湘早籼45号等。
按照上述方法将酶切野生菰DNA导入水稻后收获D0代种子，其后代变异率较高。
将D0代种子种植后，按照常规方法进行选育，从而获得优良的水稻新株系和新品种。本发明对所述选育方法没有特殊限制，包括但不限于选择优良单株进行系统选育等方法。实验结果表明，本发明提供的方法可选育出优良的品系，表现出茎杆粗壮，穗大粒多(500-600粒/穗)，抗病性强等优点，理论产量近1吨。
与现有技术相比，本发明首先采用CTAB法提取野生菰DNA，然后用限制性内切酶酶切所述野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA；再采用花粉管通道法将所述酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。本发明通过限制性内切酶酶切野生菰DNA导入水稻后，后代的变异率比完整DNA导入明显提高，稳定速度快，获得了优良的水稻新株系和新品种。实验结果表明，酶切野生菰DNA导入水稻创新的水稻新品种茎秆粗大，穗大粒多，后期灌浆速度快，克服了大穗而分蘖力弱、包颈、结实率低的缺陷；田间观察未发现严重病虫害危害，是一批极具增产潜力的资源材料。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附表，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 野生菰DNA提取
1.取50克野生菰幼叶，用液氮研磨，加入50ml 2倍CTAB提取缓冲液，在500ml离心管中充分混匀后，再加入50ml 1倍CTAB提取缓冲液。其中，2倍CTAB提取 缓冲液包括：2％CTAB(十六烷三甲基溴化铵)，100mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，20mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠pH8.0)，1.4M NaCl，1％PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)Mw40,000；1倍CTAB缓冲液(2倍CTAB提取缓冲液用双蒸水稀释1倍)。
2.在55～65℃恒浴30min，加入150ml氯仿:异戊醇(24:1)，充分摇动5min，8000r/min，室温下5min离心。
3.取上清液加入1/10体积的10％的CTAB缓冲液，加入200ml氯仿:异戊醇(24:1)，充分摇动5min，4000r/min，室温下离心5min。
4.上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下30min，5000转，4℃离心5min。沉淀用0.8ml高盐缓冲液充分溶解，15000r/min离心2min，其中，高盐缓冲液包括：10mM Tris(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0),1M NaCl(氯化钠)。
5.上清加入0.6倍体积的异丙醇，室温下30min，5000转，4℃离心5min。沉淀用4ml双蒸水溶解，加入2.5倍体积95％的冷乙醇，-20℃冰箱中2h以上，15000转离心20min。
6.沉淀用70％的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用2000μl 0.1倍TE缓冲液溶解，加入200μl RNA酶贮存缓冲液(1mg/ml)，37℃，一小时降解RNA。其中，1倍TE缓冲液包括：10mM pH值为8.0的Tris、1mM pH值为8.0的EDTA；RNA酶贮存缓冲液包括：1mg/ml RNaseA,100U/ml RNaseT1,沸水中处理3分钟，冰箱中保存。
7.紫外吸收光谱法检测DNA的浓度和纯度。DNA浓度的检测采用紫外吸收光谱法。DNA溶液260的OD值为1，相当于在约50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA，DNA浓度双链DNA样品浓度(μg/μl)＝OD260×核酸稀释倍数×50。(A 260/A 280≥1.8，A260/A230≥2.0表明D N A纯度符合质量要求。
8.用限制性内切酶HindⅢ.+EcoRⅠ酶切DNA，电泳检测。用琼脂糖凝胶电泳检测其分子量的分布范围，酶切完整的DNA呈弥散状。酶切后的DNA用2.5倍体积95％的冷乙醇，-40℃冰箱中过夜，15000转离心20min。沉淀干燥后用1倍SS缓冲液溶解，浓度为100-200μg/ml，其中，1倍SSC缓冲液包括：150mMNaCl,15mM C6H9Na3O9(柠檬酸三钠pH8.0)。
实施例2 野生菰DNA的导入及后代选择
1.导入受体的选择
受体应选择综合性状好，只有少数或个别性状需要改良的品种或品系。
2.导入时间和方法
在水稻开花1～3h，切柱头1/3～2/3，然后在切口处滴入DNA溶液，浓度为100-200μg/ml。浸泡去掉柱头的子房，及时套袋。待种子成熟时收获D 0代种子。
3.野生菰整体DNA和酶切野生菰DNA导入水稻的变异率分析
采用步骤2的方法，将实施例1步骤7获得的野生菰整体DNA和步骤8获得的酶切野生菰DNA分别导入水稻品种湘晚籼12号和湘早籼45号中。
2003年，采用野生菰整体DNA导入方法，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子123粒，后代发现变异株6株，变异率为4.9％；湘早籼45号共导入400粒，获得种子128粒，后代发现变异株6株，变异率为4.7％。
2003年，采用酶切野生菰DNA导入，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子125粒，后代发现变异株17株，变异率为13.6％；湘早籼45号共导入400粒，获得种子122粒，后代发现变异株16株，变异率为13.1％。
2004年，采用野生菰整体DNA导入方法，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子126粒，后代发现变异株5株，变异率为4.0％；湘早籼45号共导入400粒，获得种子128粒，后代发现变异株7株，变异率为5.5％。
2004年，采用酶切野生菰DNA导入，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子124粒，后代发现变异株18株，变异率为14.5％；湘早籼45号共导入400粒，获得种子132粒，后代发现变异株17株，变异率为12.9％。
结果参见表1，表1为本发明实施例提供的育种方法的变异率。
表1 本发明实施例提供的育种方法的变异率

由表1可知，采用花粉管通道法将酶切野生菰DNA导入水稻后，其变异率高于野生菰整体DNA导入获得的水稻。
4.后代选择
将步骤3导入酶切野生菰DNA获得的湘早籼45号D0代种子(最好50粒以上)播于盆钵内，育苗1～2叶时移至秧田，然后再移栽大田，其植株形态和受体差 别不大，所收种子为D1代。
D1代每个种植1500～2000单株，从中选取有变异的单株进行种植，获得D2代种子。
D2代每个变异株系种植双行或3行，共60蔸，受体作对照。稳定株系测产分析(含试味)，表现好的进入品比和多点联合品比试验以及推荐参加省区域试验。
从D5代的株系中获得了植株表现茎杆粗壮，穗大粒多(500-600粒/穗)，抗病性强等优点，理论产量近1吨的稳定株系。
实施例3
将湘早籼45号D5代获得的稳定株系于4月1日播种，7月18日成熟，属中熟早稻类型。
田间取样考种结果，每蔸平均有效穗9.85穗，每亩有效穗数16.665万穗，每穗实粒数149.9粒，结实率74.8％，千粒重25.4克，折合亩产625公斤，实际产量每亩627公斤。
直播亩有效穗27.67万穗，每穗实粒数100.46粒，结实率72.04％，按千粒重25.4克计算，理论产量每亩706.05公斤。
野生菰DNA导入水稻创新的水稻新品种茎秆粗大，穗大粒多，后期灌浆速度快。克服了大穗而分蘖力弱、包颈、结实率低的缺陷；田间观察未发现严重病虫害危害，是一批极具增产潜力的资源材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。