一种大肠杆菌BBM2015001菌株及其用途.pdf

本发明提供了一种大肠杆菌BBM2015001(Escherichia coli BBM2015001)菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015151，保藏日期为2015年3月24日，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。本发明所提供的大肠杆菌BBM2015001菌株能够用于制备预防及治疗因外周感染而导致的神经炎症的药物中，该菌株为绿色荧光蛋白内源表达的尿路致病性大肠杆菌经过转基因操作后的衍生菌株，为革兰氏阴性菌株，其致病性较低。

权利要求书
1.  一种大肠杆菌BBM2015001(Escherichia coli BBM2015001)菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015151。

2.  权利要求1所述的大肠杆菌BBM2015001菌株的用途，其特征在于：用于制备预防及治疗因外周感染而导致的神经炎症的药物中。

说明书一种大肠杆菌BBM2015001菌株及其用途
技术领域
本发明提供了一种大肠杆菌BBM2015001(Escherichia coli BBM2015001)的衍生菌株，以及该菌株在药物中的用途，属于药品技术领域。
背景技术
外周感染是外界病原微生物侵入人体所引起的局部组织和全身性炎症反应。越来越多的研究表明，感染引起的外周炎症会对中枢神经系统造成影响，引起认知功能的损伤，影响正常的工作和学习。在多种外周炎症中，手术创伤诱导的炎症反应是较为常见的一种外周炎症，可能导致神经炎症，诱发术后认知功能障碍。该病多发于65岁以上的老年患者，国内报道术后2～7天严重精神障碍的发生率是3.26％～4.80％，常在术后恢复的过程中持续数月甚至数年，对患者造成严重的短期或长期影响。目前研究表明，手术创伤或者感染引起的高水平炎症因子，是导致术后认知功能障碍的重要诱因，不仅激活了外周免疫反应，同时也激活中枢神经系统的免疫反应。如何有效地治疗和预防手术后的外周感染及炎症，将成为治疗神经炎症及认知水平障碍的主要难题。
发明内容
本发明提供了一种大肠杆菌BBM2015001(Escherichia coli BBM2015001)菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015151，保藏日期为2015年3月24日，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
本发明所提供的大肠杆菌BBM2015001菌株能够用于制备预防及治疗因外周感染而导致的神经炎症的药物中，该菌株为绿色荧光蛋白内源表达的尿路致病性大肠杆菌经过转基因操作后的衍生菌株，为革兰氏阴性菌株，其致病性较低。
将本发明所提供的大肠杆菌BBM2015001菌株接种在LB培养基培养至对数生长期，离心并重悬于磷酸缓冲液(PBS)中，分多次以不同剂量注射到6-8周的FVB小鼠腹腔内，每次间隔为24h，每次注射选用当天培养的BBM2015001菌株。多次注射完成24h后小鼠获得良性炎症状态。
小鼠经诱导获得良性炎症后，其先天性免疫系统得到全面加强。小鼠腹腔作为良性炎症诱导剂注射的组织，我们称为良性炎症诱导灶(简称诱导灶)。诱导灶内的免疫细胞获得免疫耐受，巨噬细胞的吞噬能力得到增强，CD11b+粒细胞下调表面TLR4、CD86、MHCII表达量；诱导灶外的外周组织和器官中，包括脾脏和血液中的CD11b+粒细胞上调表面TLR4、CD86、MHCII表达量，提高免疫监视的强度。
良性炎症经过行为生物学实验检测，没有行为测试异常，在诱导的过程中不会激活中枢神经系统。和其他免疫刺激不同，良性炎症也不会引起下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA axis)释放皮质酮抑制免疫系统的功能。在诱导过程中，诱导剂BBM2015001菌株剂量逐次增强，作为先天性免疫系统的“负重训练”。
经过以上试验验证，本发明所提供的大肠杆菌BBM2015001菌株能够用于制备预防及治疗因外周感染而导致的神经炎症的药物中。
附图说明
图1为本发明实施例中旷场实验结果图；
图2为本发明实施例中神经系统细胞因子上调的抑制作用的实验结果图；
图3为本发明实施例中大脑切片海马体附近的小胶质细胞的Iba-1抗原染色结果；
图4为本发明实施例中大脑切片海马体附近的小胶质细胞的Iba-1抗原标记面积占总切片面积百分比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
本发明所提供的大肠杆菌BBM2015001(Escherichia coli BBM2015001)菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015151，保藏日期为2015年3月24日，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
实验例1：良性炎症抗静脉注射菌株BBM2015001诱导的病态行为效果研究
1.实验材料：
1.1药物：
大肠杆菌BBM2015001菌株的磷酸缓冲重悬液；
对照药物：磷酸缓冲液。
1.2动物：6-8周龄的FVB野生型小鼠，20-25g。
2.方法
2.1良性炎症的诱导：
将FVB小鼠分为两组：良性炎症诱导组和对照组，每组10只。
将大肠杆菌BBM2015001菌株接种在LB培养基培养至对数生长期，离心并重悬于磷酸缓冲液(PBS)中，分三次以不同剂量注射到6-8周的FVB小鼠腹腔内，每次间隔为24h，每次注射选用当天培养的BBM2015001菌株。
第一天注射剂量：BBM2015001菌株2.0x 107CFU重悬于100μl PBS制成混合液注射；对照组小鼠进行磷酸缓冲液腹腔注射。
第二天注射剂量：BBM2015001菌株2.5x 108CFU重悬于100μl PBS制成混合液注射；对照组小鼠进行磷酸缓冲液腹腔注射。
第三天注射剂量：BBM2015001菌株1.0x 109CFU重悬于100μl PBS制成混合液注射；对照组小鼠进行磷酸缓冲液腹腔注射。
第三天注射24h后小鼠获得良性炎症状态。
2.2免疫刺激：
取BBM2015001菌株2.0x 109CFU重悬于200μl PBS制成混合液，在小鼠进入良性炎症状态后，经尾静脉注射给良性炎症诱导组和对照组小鼠。
2.3旷场行为学实验：
小鼠接受免疫刺激24h后进行旷场实验，旷场实验装置由40x40x25cm的不透明塑料盒构成，将小鼠放入旷场角落后，使用仪器记录小鼠在5min中内移动的总距离。
3.结果与结论：
旷场实验通过检验小鼠的运动状态获得小鼠的病态行为信息，实验结果如图1所示。从图1可知，使用本发明的BBM2015001菌株诱导良性炎症组与磷酸缓冲液对照组相比，单位时间内的总运动量有显著性差异，p<0.05，证明诱导良性炎症的小鼠在静脉注射菌株BBM2015001后没有明显的病态行为。由于神经炎症的行为学症状是在免疫刺激后表现病态行为，因此良性炎症能够对神经炎症诱发的病态行为有较好的预防效果。
实验例2：BBM2015001菌株对腹腔细菌感染诱导的神经系统细胞因子上调的抑制作用研究
1.1药物：
大肠杆菌BBM2015001菌株的磷酸缓冲重悬液；
对照药物：磷酸缓冲液。
1.2动物：6-8周龄的FVB野生型小鼠，20-25g。
2.方法
2.1良性炎症的诱导及免疫刺激：
将FVB小鼠分为三组，阴性对照组，良性炎症组和阳性对照组，每组5只。所有注射均为腹腔注射，注射剂量均为100μl按照下表进行处理：

2.2mRNA提纯分离及即时定量聚合酶链式反应：
小鼠经良性炎症诱导后3h，所有组别的小鼠用二氧化碳杀死，解剖分离小鼠大脑，用解剖刀小心分离前额皮质、海马体和下丘脑并置于液氮冷冻。用Trizol试剂提取以上三部分组织总mRNA，Nanodrop分光测定仪测量浓度和纯度。提纯后的mRNA使用Promega公司的反转录试剂盒经反转录酶催化得到cDNA。即时定量聚合酶链式反应使用Applied Biosystems公司的Taqman基因表达量测量系统，将GAPDH基因表达量作为内参，5’荧光报告染色剂的荧光强度使用Applied Biosystems公司的ABI PRISM 7300序列检测系统，数据分析采用比较阈值反应周期数相对于管家基因GAPDH的表达量作为基因表达的比较参数。检测的基因包括炎症因子白细胞介素-1(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的基因表达量。
3.结果与结论：
本实验的结果图如图2所示，从图2可知，阴性对照组没有受到免疫刺激，其下丘脑、前额皮质、海马体的炎症因子mRNA水平的表达量均维持生理状态的较低水平。阳性对照组突然受到大剂量的活性BBM2015001菌株腹腔注射，在刺激后3h免疫信号传导到中枢神经系统，表现为下丘脑、前额皮质、海马体的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的大幅上调(从6倍到20倍不等)，说明大剂量活性BBM2015001菌株腹腔注射能够引起显著的神经炎症。经过良性炎症诱导的小鼠，当受到和阳性对照组相同的免疫刺激时，其下丘脑、前额皮质、海马体的炎症因子mRNA水平的表达量比阴性对照组略高(仅下丘脑IL-1β的表达量和阴性对照组有显著性差异)，但比阳性对照组有显著的降低(p<0.05)。
结论：根据以上结果，可见良性炎症对外周感染引起的中枢神经系统炎症因子上调有显著的抑制作用。
实验例3：BBM2015001菌株对神经炎症激活脑内星状小胶质细胞的抑制作用研究
1.1药物：
大肠杆菌BBM2015001菌株的磷酸缓冲重悬液；
对照药物：磷酸缓冲液。
1.2动物：6-8周龄的FVB野生型小鼠，20-25g。
2.方法
2.1良性炎症的诱导及免疫刺激：
将FVB小鼠分为三组，阴性对照组，良性炎症组和阳性对照组，每组5只。所有注射均为腹腔注射，注射剂量均为100μl按照下表进行处理：

2.2组织分离和免疫切片：
小鼠经良性炎症诱导后24h，所有组别的小鼠用二氧化碳杀死后立即用4％多聚甲醛进行心脏灌流固定。分离小鼠大脑置于4％多聚甲醛溶液继续固定24h，移入20％蔗糖溶液4℃静置24h。将大脑快速置于干冰上冷冻，使用冷冻切片机将脑组织冠状面切片，切片厚度为30μm。
2.3免疫组织化学染色：
冷冻大脑切片经过1％氢硼化钠和0.5％过氧化氢孵浴以减少抗体非特异性识别的背景，先后与兔抗鼠Iba-1一抗和生物素标记的二抗孵浴，通过显色剂链霉亲和素-花青染料2(Cy2-streptavidin)进行显色。
2.4小胶质细胞形态学分析：
取显微镜物镜20x放大倍数下的海马体组织Iba-1染色图像，使用ImageJ根据图像设置染色识别阈值，计算小胶质细胞的Iba-1抗原标记面积占总切片面积百分比。每组小鼠的脑组织海马体切片随机取3幅图像，每幅图像至少含有30个小胶质细胞。
3.结果与结论：
图3是大脑切片海马体附近的小胶质细胞的Iba-1抗原染色结果。从图3可知，阴性对照组没有受到免疫刺激，其海马体内的小胶质细胞维持生理状态的形态，细胞的触角伸出成网状，触角末端染色不可见，仅见小胶质细胞的胞体。阳性对照组由于突然受到大剂量的活性BBM2015001菌株腹腔注射，在刺激后免疫信号传导到中枢神经系统，经24h后海马体的小胶质细胞激活，形态发生变化，其触角由静息状态的网状铺开变为收缩至胞体附近，触角Iba-1表达量上调，触角形状清晰可见。通过大脑内小胶质细胞的形态学变化，说明大剂量活性BBM2015001菌株腹腔注射能够引起中枢神经系统小胶 质细胞的激活，而作为中枢神经系统内的免疫细胞，小胶质细胞的激活表明外周细菌感染引起显著的中枢神经炎症。经过良性炎症诱导的小鼠，当受到和阳性对照组相同的免疫刺激时，其中枢神经系统内的小胶质细胞形态和阴性对照组相比没有明显变化，显著区别于阳性对照组，显示良性炎症组的神经炎症得到明显的控制。
图4是大脑切片海马体附近的小胶质细胞的Iba-1抗原标记面积占总切片面积百分比。由图4可知，阳性对照组相比于阴性对照组和良性炎症组具有较高的Iba-1标记百分比，表示上调的Iba-1抗原，进而证实阳性对照组有更为严重神经炎症表征。结论：根据以上结果，可见良性炎症对外周感染引起的中枢神经系统小胶质细胞激活有显著的抑制作用。
通过本发明中以上三个实施例的实验验证，本发明所提供的大肠杆菌BBM2015001菌株能够用于制备预防及治疗因外周感染而导致的神经炎症的药物中，且具有良好的效果。