产醌类化合物的重组酵母菌 发明领域 本发明涉及产醌类化合物的微生物菌种技术领域， 具体地， 本发明涉及产醌类化 合物的重组酵母菌技术领域。
背景技术 醌类化合物 (quinonoids) 是具有共轭体系的环己二烯二酮类化合物， 主要有苯 醌、 萘醌、 菲醌和蒽醌四种类型， 是一类重要的氧化还原物质， 在生物体内起着抗其他生物 侵害的保护作用， 有些醌类化合物还是重要的药物。
游离醌类化合物一般具有升华性， 极性较小， 一般溶于乙醇、 丙酮、 乙醚等有机溶 剂。常用菲格尔 (Feigl) 反应、 博恩特瑞格 (Borntrager) 反应进行显色反应。常用硅胶 薄层色谱进行色谱鉴定， 展开剂多用混合溶剂， 如： 苯 - 乙酸乙酯 - 乙酸 (75 ∶ 24 ∶ 1)、 甲 苯 - 甲酸甲酯 - 甲酸 (5 ∶ 4 ∶ 1)， 醌类化合物在日光下多显红色、 黄色， 在紫外光 (UV) 下 多显红色、 黄棕色、 橙色荧光， 随其分子中酚羟基等助色团数量的增多而颜色加深。
醌类化合物早期作为一种天然色素， 曾用于染料工业， 后来研究发现它们具有泻 下、 抑菌、 利尿、 止血等多方面的生物活性。醌类物质 chrysarobin 具有较强的抗霉菌作用， 是治疗疥癣等皮肤病的有效药物。最近的研究证明， 多数醌类化合物具有明显的抗肿瘤作 用， 对小鼠黑色素瘤、 艾氏腹水癌细胞、 大鼠乳癌细胞、 宫颈癌细胞等多种癌细胞具有明显 的抑制作用， 其中醌类物质 emodin 可通过增强 Bu25TK 细胞核凝聚、 膜联蛋白黏合及 DNA 断 裂而抑制癌细胞的 DNA 合成并诱导癌细胞凋亡， 其途径为 Caspase 介导的线粒体途径， 表现 在 Caspase3、 Caspase9 的激活和多糖酶的断裂。
离子束介导转基因是 20 世纪 90 年代中国科学院离子束生物技术重点实验室在研 究注入离子与生物体相互作用的基础上， 首先提出的一种新的转基因方法。作为一种全新 的转基因手段， 离子注入介导转基因有其自身的特点 ： 首先， 不需要事先知道或克隆出目的 DNA 片段， 其次可转移 DNA 大片段， 适于多基因或基因簇的转导 ； 其次， 转入的外源 DNA 是直 接整合入宿主总 DNA 中， 因此具有较好的遗传稳定性。注入离子对细胞具有极强的刻蚀作 用， 致使细胞表面形成可使外源 DNA 进入的通道， 这一点与基因枪方法并无差异。注入离子 对细胞的刻蚀和溅射作用属于冷加工性质， 不伤及邻近组织和细胞， 比产生热效应的激光 束法具有明显的优势。 同时由于注入正离子的积累， 大大降低了细胞表面的负电性， 从而减 少了细胞对溶液中带负电的外源 DNA 的静电斥力， 有利于外源基因的导入。加之通道局部 区域也由于带正电， 便于吸引带负电性的 DNA 主动进入受体细胞。另一方面， 目前离子注入 在真空环境中进行， 真空造成的负压使细胞内部的部分水分蒸发， 当干燥的细胞进入含有 DNA 的缓冲液中时， 由于吸胀作用加强， 也增加了外源 DNA 进入通道的机会。 此外， 离子注入 也增加了外 会对受体细胞内染色体造成直接损伤 ( 如断裂 ) 和间接损伤 ( 如自由基作用 )， 源 DNA 与受体细胞 DNA 重组和整合的机会。正是这些因素使得离子束介导 DNA 大分子的遗 传转化具有较高的转化率。
酵母菌与人类的关系源远流长， 目前已建立了酵母菌的基因组数据库和蛋白质组
数据库。 酵母菌作为单细胞低等生物， 具有易培养、 繁殖快、 便于基因操作、 能对外源蛋白进 行翻译后加工和修饰、 不产生或很少有毒物质等特性， 已成为外源基因表达的合适宿主。
甘草 (Glycyrrhiza) 是豆科 (Leguminosae) 蝶形花亚科 (Papiliantae Taub.)， 属 多年生深根性草本植物， 具有抗寒、 耐热、 抗盐碱等优良特性， 适应性强， 生命力旺盛， 根系 发达， 是荒漠、 半荒漠地区保持水土、 改良土壤、 防风固沙的重要药用植物， 被国家列为二级 野生药材物种。
通过离子注入介导甘草基因组 DNA 在酵母菌中的转化， 实现重组酵母菌发酵生产 醌类化合物的技术突破， 将对我国民族制药业的发展产生深远的影响。 发明内容
本发明通过对照现有技术， 针对重组酵母菌发酵生产醌类化合物未见报道， 而通 过离子注入介导甘草基因组 DNA 在酵母菌中转化获得有效的微生物菌种发酵获得醌类化 合物也未见报道。本发明的目的是提供一种为获得醌类化合物的重组酵母菌株。
本发明的技术方案 ： 本发明提供了重组酵母工程菌菌株， 通过离子注入介导甘草 基因组 DNA 在酵母菌中转化的方法获得的二株产醌类化合物的重组酵母菌， 其分别为酿 酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434 和异常汉逊酵母 (Hansenula anomala) CGMCC 3435， 这两种菌种通过传统的发酵工艺都可以有效获得醌类化合物。 本发明技术方案中所述的两种菌种都为酵母菌， 具有常规酵母菌的一些共同的技 术特征， 都通过传统的发酵技术有效获得醌类化合物， 是基于提取天然药物醌类化合物共 同技术要求前提下实现。
具体地， 本发明采用已公开的技术， 具体技术已经通过申报国家发明专利， 并获得 发明专利授权， 其申请号为 2006100114027， 即通过改良的 CTAB 法大量提取野生乌拉尔甘 草 (Glycyrrhiza uralensis) 并获得总 DNA， 通过在酵母中转化从而获得本发明产醌类化 合物的两株重组酵母菌。
本 发 明 技 术 方 案 所 用 酵 母 菌 并 不 限 于 酵 母 属 (Saccharomyces)、 汉逊酵母属 (Hansenula) 和其他酵母属通过发酵可获得醌类化合物， 本发明技术效果的再现， 同时在 于， 通过离子注入介导甘草基因组 DNA 在酵母菌中转化的技术方案的结合。具体地， 本发明 优选为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC.No.3434 和异常汉逊酵母 (Hansenula anomala)CGMCC.No.3435。
一方面， 本发明提供了一种重组酵母菌株的菌株， 编号命名为 5005， 其主要次生 代谢产物为醌类化合物。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单 位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)。地址 ： 北京市朝阳区北辰 西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 ： 100101。保藏日期是 2009 年 11 月 9 日， 保藏号是 CGMCC.No.3434。根据受体菌的来源， 经微生物学鉴定， 5005 菌为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 该菌株的菌落呈颜色乳白色， 中央隆起， 边缘圆整 ； 斜面菌 种培养温度 28-30℃， 培养时间 24h ； 液体摇瓶培养温度 28-30℃， 转速 200-220r/m， 培养时 间 96h。可采用如下方法对其进行保存 ： 采用常规的斜面传代保存法， 此方法是将本发明菌 种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面， 常规培养和保存即可。或是利用真空 冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种， 低温或常温保藏即可。本发明进一步建立菌种保
藏、 复壮及选育的系统工艺流程技术。
另一方面， 本发明提供了一种重组酵母菌株， 编号命名为 6076， 其主要次生代谢产 物为醌类化合物。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位 ： 中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)。地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 ： 100101。保藏日期是 2009 年 11 月 9 日， 保藏号是 CGMCC.No.3435。根据受体菌的来源， 经微生物学鉴定， 6076 菌为异常汉逊酵母 (Hansenula anomala)， 该菌株的菌落呈乳白色， 中央隆起， 边缘圆整 ； 斜面菌种培养温度 30-32℃， 培养 时间 24h ； 液体摇瓶培养温度 30-32℃， 转速 200-220r/m， 培养时间 96h。可采用上述保存 5005 菌的方法对其进行保存。
通过实施本发明具体的技术指标， 实现本发明内容， 可以通过技术方案获得的二 株重组酵母菌， 即酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434 和异常汉逊酵母 (Hansenula anomala)CGMCC 3435， 通过传统的微生物发酵技术手段有效获得醌类化合物 的有益效果。
附图说明 ： 无 具体实施方式
实施例一 ： 产醌类化合物的重组酿酒酵母菌
采用改良的 CTAB 法大量提取野生乌拉尔甘草 (Glycyrrhiza uralensis) 的基因 组 DNA。
取细胞浓度为 1.0×107CFU/mL 的酿酒酵母菌体稀释液 0.1mL 均匀涂布于直径 90mm 的无菌平皿中央， 无菌风吹干制成菌膜， 置于 LCD1000 型离子注入机小真空靶室的无 + + 菌靶台上进行 Ar 注入。Ar 注入能量 10KeV、 剂量 15×1015ions/cm2， 真空度 10-3Pa。
用 2mL 乌拉尔甘草基因组 DNA 的 TE 缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜， 28℃温育 2h 后， 洗脱至 YEPD 平板。
其中， YEPD 培养基的成分为 (w/v) ： 酵母膏 1.0％、 蛋白胨 2.0％、 葡萄糖 2.0％、 琼 脂 2.0％， 其余为无菌水。
将 YEPD 平板上生长的菌落接入斜面培养， 再进行液体培养。收集培养液， 进行薄 层色谱 (TLC) 检测。获得一株编号为 5005 的重组酿酒酵母菌， 其培养液中含有红色的醌类 化合物， 用甲苯 - 甲酸甲酯 - 甲酸 (5 ∶ 4 ∶ 1) 展开时， 其 Rf 值为 0.24。
重组酿酒酵母菌 5005 于 2009 年 11 月 9 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏号为 3434。
实施例二 ： 产醌类化合物的重组异常汉逊酵母菌
采用改良的 CTAB 法大量提取野生乌拉尔甘草 (Glycyrrhiza uralensis) 的基因 组 DNA。
取细胞浓度为 1.0×107CFU/mL 的异常汉逊酵母菌体稀释液 0.1mL 均匀涂布于直 径 90mm 的无菌平皿中央， 无菌风吹干制成菌膜， 置于 LCD1000 型离子注入机小真空靶室的 + + 无菌靶台上进行 Ar 注入。Ar 注入能量 10KeV、 剂量 15×1015ions/cm2， 真空度 10-3Pa。
用 2mL 乌拉尔甘草基因组 DNA 的 TE 缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜， 28℃温育 2h 后， 洗脱至 YEPD 平板。其中， YEPD 培养基的成分为 (w/v) ： 酵母膏 1.0％、 蛋白胨 2.0％、 葡萄糖 2.0％、 琼 脂 2.0％， 其余为无菌水。
将 YEPD 平板上生长的菌落接入斜面培养， 再进行液体培养。收集培养液， 进行薄 层色谱 (TLC) 检测。获得一株编号为 6076 的重组异常汉逊酵母菌， 其培养液中含有红色的 醌类化合物， 用甲苯 - 甲酸甲酯 - 甲酸 (5 ∶ 4 ∶ 1) 展开时， 其 Rf 值为 0.51。
重组异常汉逊酵母菌 6076 于 2009 年 11 月 9 日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏号为 3435。
实施例三 ： 重组酵母菌培养液中醌类化合物的薄层色谱 (TLC) 鉴定
以 甲 苯 - 甲 酸 甲 酯 - 甲 酸 (5 ∶ 4 ∶ 1) 为 展 层 剂， 硅 胶 薄 板 层 析， 利用 醌 类 化 合 物 在 日 光 和 紫 外 光 下 特 异 的 绿 色， 确 定 醌 类 化 合 物 的 存 在。 酿 酒 酵 母 (Saccharomycescerevisiae)CGMCC 3434 和 异 常 汉 逊 酵 母 (Hansenula anomala)CGMCC 3435 所产醌类化合物在日光下显红色， 在紫外光 (UV) 下显红色荧光， 前者的 Rf 值为 0.24， 后者的 Rf 值为 0.51。
实施例四 ： 重组酵母菌培养液中醌类化合物的气相色谱 - 质谱 (GC-MC) 鉴定
利用 PE Turbemass-Autosystem XL 气相色谱 - 质谱 (GC-MC) 仪对收集和纯化的 重组酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434 和重组异常汉逊酵母 (Hansenula anomala)CGMCC 3435 培养液中的醌类化合物进行检测， 检测条件为 ： GC-MC 仪柱型 ： PE-5MS 30m×0.25mm×0.25μ ；
程序升温 ： 70 ℃ 保 持 10min ； 4 ℃ /min 升 至 120 ℃， 保 持 5min ； 5.8 ℃ /min 升 至 250℃， 保持 37min ；
进样口温度 ： 280℃ ；
分流比 ： 60 ∶ 1 ；
载气流速 ： 15psi ；
载气 ： 氦气 (99.999％ ) ；
离子源 ： 200℃ ；
传输线 ： 260℃ ；
扫描范围 ： 30amu ～ 550amu ；
功率 ： 70ev ；
电离方式 ： EI ；
光电倍增 ： 270V ；
进样量 ： 1.0μL。
重 组 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434 培 养 液 中 的 醌 类 化 合物的保留时间 (RT) 为 12.092min， 与 WILEY 化合物库中的醌类化合物 CAS1211-29-6 和 CAS42536-97-0 的 相 似 性 分 别 为 70.9 ％ 和 72.1 ％。 重 组 异 常 汉 逊 酵 母 (Hansenula anomala)CGMCC 3435 培养液中的醌类化合物的 RT 为 21.311min， 与 Nist 化合物库中的醌 类化合物 CAS1000192-59- 和 Nbs 化合物库中的醌类化合物 CAS111-70-6 的相似性分别 为 69.7％和 54.6％。确定重组酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434 和重组 异常汉逊酵母 (Hansenulaanomala)CGMCC 3435 培养液中的醌类化合物均为新的醌类化合 物。
通过上述的实施例， 更容易理解本发明。 上述实施例只是举例性的描述， 而不应当 被理解为用来限制本发明的范围。 本发明所用酵母菌并不限于酵母菌属 (Saccharomyces)、 汉逊酵母菌属 (Hansenula) 和其他酵母菌属通过发酵可获得醌类化合物， 同时在于， 通过 离子注入介导甘草基因组 DNA 在酵母菌中转化的技术方案的结合。另外， 在上述的说明中， 如无特别说明，％皆指重量百分比。7