胸腺素ΑSUB1/SUB的聚乙二醇化衍生物.pdf

摘要
申请专利号：	CN03131498.8	申请日：	2003.05.16
公开号：	CN1532207A	公开日：	2004.09.29
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/66; C07K7/06; C07K5/00; C07K17/02; C08G65/48; C08F290/06; A61K38/08; A61K38/00; A61K38/32; A61P1/16; A61P31/12; A61P31/14; A61P11/00; A61P35/00	主分类号：	C07K14/66; C07K7/06; C07K5/00; C07K17/02; C08G65/48; C08F290/06; A61K38/08; A61K38/00; A61K38/32; A61P1/16; A61P31/12; A61P31/14; A61P11/00; A61P35/00
申请人：	中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所;
发明人：	刘克良; 王良友; 刘尚义; 吴萍; 赵修南; 董泄建
地址：	100850北京市海淀区太平路27号
优先权：	2003.03.21 CN 03121060.0
专利代理机构：	中国国际贸易促进委员会专利商标事务所	代理人：	唐伟杰
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内容摘要

本发明涉及胸腺素α1的聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的药物组合物，及其在治疗或预防免疫缺陷、免疫功能低下等相关疾病的药物中用途，包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治疗或预防中的应用。

权利要求书

1.式(I)化合物或其衍生物：
PEG-M-Cys-T       (I)
或或
其中PEG为RO(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂，R＝H或CH₃，n＝5-1000，
Cys为半胱氨酸，它通过其侧链硫醚原子与M基团共价相连；Cys还
以其羧基与T的N-端氨基形成酰胺键相连或以其氨基与T的C-端羧基形
成酰胺键相连，Cys位置包括位于T序列的两端、任意两相邻氨基酸之间
以及替代任意位置的氨基酸，
T表示天然Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段。
2.根据权利要求1的化合物或其衍生物，其中含Tα₁(17-24)序列的
任意片段由下式代表：
R₁-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-R₂
R₁＝H、
Leu、
Asp-Leu、
Lys-Asp-Leu、
Thr-Lys-Asp-Leu、
Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、
Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu。
R₂＝H、Glu、Glu-Ala、Glu-Ala-Glu、Glu-Ala-Glu-Asn。
3.式(II)化合物：
[PEG-X-(CH₂)mCO-Y]z-T           (II)
其中T表示天然Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段，X＝O、
NH或NHCO，Y＝O或NH，m＝0-6，z＝1-11，并且T序列中任意位点
的氨基或羟基可经一个或多个PEG分子共价修饰，如天然Tα₁全序列中
N-端去乙酰化后的氨基和14、17、19、20位赖氨酸侧链氨基，1、8、9、
位丝氨酸的侧链羟基和7、12、13位苏氨酸的侧链羟基。
4.式(III)化合物，
T-[CO-Y-PEG]z                   (III)
其中，T表示天然Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段，Y＝O或
NH，z-1-10，并且T序列中任意位点的羧基可经一个或多个PEG分子
共价修饰，如天然Tα₁全序列中C-端羧基，2、6、15位天冬氨酸的侧链
羧基和10、18、21、24、25、27位谷氨酸的侧链羧基。
5.药物组合物，其含有至少一种式(I)或式(II)或式(III)的化
合物及药物载体或赋形剂。
6.权利要求1-4中任一化合物或衍生物在制备用于预防或治疗与免疫
缺陷或免疫功能低下相关疾病的药物中用途包括在乙型肝炎，丙型肝炎，
恶性黑色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治
疗或预防中的应用。
7.制备式(I)化合物或衍生物的方法，其包括将PEG-MAL或PEG-VS或
PEG-IODO与HS-Cys-T反应。

说明书

胸腺素α₁的聚乙二醇化衍生物

发明领域

本发明涉及胸腺素α₁聚乙二醇化衍生物，其制备方法，含它们的药物
组合物，及其在治疗或预防与免疫缺陷、免疫功能低下相关疾病的药物
中的用途，包括包括在乙型肝炎，丙型肝炎，恶性黑色素瘤，非小细胞
性肺癌，冠状病毒引起的SARS(严重的急性呼吸综合症)等相关疾病的
治疗或预防中的应用。

背景技术

胸腺素α₁(Tα₁)是胸腺分泌的是一种重要的多肽，是一种针对T淋巴细
胞的免疫增强剂，能促进T细胞的成熟和分化，并促使成熟的T细胞分
泌多种淋巴因子(如白介素-2和γ-干扰素等)，还能促进白介素-2受体的
生成。Tα₁由28个氨基酸残基组成，分子量为3108，等电点为4.2，N-
端含有乙酰化结构。Tα₁的一级结构如下：

1 10

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-

20 28

Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH

Tα₁用于免疫缺陷或免疫受抑制的疾病的临床治疗研究始于20世纪
80年代，目前已经取得了较好的效果。当单独使用或与干扰素配合使用
治疗慢性乙型肝炎时，Tα₁是一种安全有效的药物。对于许多其它疾病，
包括丙型肝炎、非小细胞肺癌、黑色素瘤和艾滋病，Tα₁都有一定的疗效。
另外，Tα₁也可作为疫苗辅助药，来加强流感疫苗和乙型肝炎疫苗的效果。

目前临床使用的Tα₁为化学合成品，价格昂贵、用药剂量大、周期长。
因此，对Tα₁进行结构修饰，增加其对酶或非酶环境的稳定性，延长作用
时间及增加生物活性是十分必要的。

发明内容

本发明人经研究现已发现Tα₁或其片段经聚乙二醇(PEG)共价修饰后
可延长Tα₁或其片段在体内的半衰期，从而在保持Tα₁或其片段生物活性
的同时，降低Tα₁或其片段的用量并延长了Tα₁或其片段的体内作用时间。

本发明涉及式(I)所示的Tα₁或其片段的PEG化衍生物：

PEG-M-Cys-T (I)

或或

其中PEG为RO(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂，R＝H或CH₃，n＝5-1000。

Cys为半胱氨酸，其通过它侧链硫醚原子与M基团共价相连；Cys还
以其羧基与T的N-端氨基形成酰胺键相连或以其氨基与T的C-端羧基形
成酰胺键相连，Cys位置包括位于T序列的两端、任意两相邻氨基酸之间
以及替代任意位置的氨基酸。

T表示天然Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段。

本发明再一方面涉及含至少一种式(I)化合物及药用载体或赋形剂的
药物组合物。

本发明还涉及至少一种式(I)化合物在制备用于预防或治疗与免疫缺
陷或免疫功能低下相关疾病的药物中用途，包括在乙肝，丙肝，恶性黑
色素瘤，非小细胞性肺癌，冠状病毒引起的SARS等相关疾病的治疗或预
防中的应用。

本发明还涉及制备式(I)化合物的方法，其包括：将PEG-MAL，PEG
-VS或PEG-IODO与HS-Cys-T反应。

根据本发明，在本发明中使用的缩写词具有下面的含义：

Tα₁-胸腺素α₁，

PEG-聚乙二醇，

PEG-MAL-马来酰亚胺基聚乙二醇，

PEG-VS-乙烯砜基聚乙二醇，

PEG-IODO-碘代乙酰胺基聚乙二醇，

Ala-丙氨酸，

Asn-天冬酰胺，

Asp-天冬氨酸，

Cys-半胱氨酸，

Glu-谷氨酸，

Ile-异亮氨酸，

Lys-赖氨酸，

Leu-亮氨酸，

Ser-丝氨酸，

Thr-苏氨酸，

Val-缬氨酸，

Ac-乙酰基，

Boc-叔丁氧羰基，

Fmoc-芴甲氧羰基，

DMF-二甲基甲酰胺，

DCC-二环己基碳二亚胺，

HBTU-2-(1H-1-羟基苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸，

HOBT-1-羟基苯并三唑，

HOSu-N-羟基琥珀酰亚胺，

NMM-N-甲基吗啡啉，

TFA-三氟乙酸，

Ts-Cl-对甲苯磺酰氯

EDT-巯基乙醇，

RP-HPLC-反相高效液相色谱，

IFN-干扰素。

本发明中所有氨基酸构型除注明为D-型外，均为L-型。

根据本发明，本发明所涉及的平均分子量由几百到几万的PEG-OH可
作为商品化试剂购买到，PEG-NH₂可以购买或通过以下反应得到：

将PEG-NH₂分别与马来酸酐、乙烯基氯化亚砜、碘代乙酸酐反应得
PEG-MAL、PEG-VS和PEG-IODO。例如PEG-MAL通过以下反应得到：

Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段可用常规的固相或液相多
肽合成法合成，在合成过程中很容易在N-端或C-端引入一个Cys，将含
Cys的肽链溶于水中，用碳酸氢钠调pH7-8，加入3倍当量的PEG-MAL
或PEG-MAL或PEG-VS和PEG-IODO室温搅拌反应，用反相高效液相色谱
纯化得PEG修饰的Tα₁或含Tα₁(17-24)序列的片段。PEG-MAL修饰Cys-T
的反应如下：

本发明以平均分子量为750、2000和5000的CH₃O-PEG-OH(mPEG-OH)
为原料，合成了系列PEG的马来酰亚胺衍生物(mPEG-MAL)。应用固相多
肽合成法，分别在T的N-端和C-端引入一个半胱氨酸分子，将多肽从树
脂上裂解下来并经反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化得Cys-T和
T-Cys-NH₂。将Cys-T或T-Cys-NH₂溶于水中，用碳酸氢钠调pH7-8，加
入3倍当量的mPEG-MAL，室温搅拌反应，RP-HPLC监测反应进程。反应
完成后，用RP-HPLC纯化产物得到了平均分子量为750、2000和5000的
mPEG-MAL修饰T的N-端和C-端的产物。各化合物经RP-HPLC分析为单一
峰，经质谱和氨基酸组成分析表明结构正确。

本发明进一步涉及式(II)化合物：

[PEG-X-(CH₂)mCO-Y]z-T (II)

其中T表示天然Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段，X＝O、
NH或NHCO，Y＝O或NH，m＝0-6，z＝1-11，并且T序列中任意位点
的氨基或羟基可经一个或多个PEG分子共价修饰，如天然Tα₁全序列中
N-端去乙酰化后的氨基和14、17、19、20位赖氨酸侧链氨基，1、8、9、
位丝氨酸的侧链羟基和7、12、13位苏氨酸的侧链羟基。

本发明进一步涉及式(III)化合物，

T-[CO-Y-PEG]z (III)

其中，T表示天然Tα₁全序列或含Tα₁(17-24)序列的任意片段，Y＝O
或NH，z＝1-10，并且T序列中任意位点的羧基可经一个或多个PEG分
子共价修饰，如天然Tα₁全序列中C-端羧基，2、6、15位天冬氨酸的侧
链羧基和10、18、21、24、25、27位谷氨酸的侧链羧基。

根据本发明，将PEG-OH或PEG-NH₂先分别与光气、草酰氯、C₂-C₈卤
代酸、C₃-C₈二酸酐反应，再与HOSu反应得PEG-X-(CH₂)mCOOSu(m＝0-6)。
用固相或液相多肽合成法合成T。将T溶于水中，用碳酸氢钠调pH7-8，
加入适量的PEG-X-(CH₂)mCO-OSu，室温搅拌反应，可实现PEG对多肽的
N-端氨基、Lys侧链氨基、Ser或Thr侧链基的羟基修饰。

根据本发明，在PEG的一端先引入氨基、羧基或制备PEG化修饰的氨
基酸(如Fmoc-Lys(NH-COCH₂-PEG)-OH、Fmoc-Glu(CO-NH-PEG)-OH
Fmoc-Asp(CO-NH-PEG)-OH)，再用液相或固相法偶联到肽序列中去，可
实现对多肽的N-端氨基、C-端羧基、Lys侧链氨基、Asp或Glu侧链羧基
的修饰。

根据本发明，本发明的药物组合物制成适用于哺乳动物用的各种剂
型，例如用甘露醇作赋形剂制成注射剂。

根据本发明，本发明中所用术语“含Tα₁(17-24)序列的任意片段”
是指Tα₁的17位-24位的氨基酸序列及17位-24位氨基酸序列两端的
增减，并优选下面序列

R₁-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-R₂

R₁＝H、

Leu、

Asp-Leu、

Lys-Asp-Leu、

Thr-Lys-Asp-Leu、

Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu、

Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu。

R₂＝H、Glu、Glu-Ala、Glu-Ala-Glu、Glu-Ala-Glu-Asn。

根据本发明，与免疫缺陷或免疫功能低下有关的疾病举例有：乙型
肝炎，丙型肝炎，非小细胞肺癌，黑色素瘤或艾滋病，冠状病毒引起的
SARS。

具体实施方式

实施例

下述实施例代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例
的限制。实施例所用平均分子量为5000的mPEG-OH为Sigma产品，固相
合成载体Wang树脂为ACT产品，TFA为ACROS产品，Rink酰胺树脂、DCC、
HOBT、HBTU、Fmoc-保护氨基酸为上海吉尔生化产品。

实施例1 Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-Tα1的制备

1.1 mPEG₅₀₀₀-MAL的合成

称取mPEG₅₀₀₀-OH 20g(4mmol)置于250ml反应瓶中，加入100ml
CH₂Cl₂，固体溶解后再加入3.0ml Et₃N(20mmmol)和3.8g Ts-Cl(20mmol)，
室温搅拌反应。TLC监测反应完全后，旋转蒸发除去溶剂，加100ml无水
乙醚沉淀出固体，得15.2g mPEG₅₀₀₀-OTs，收率70％。

将15g mPEG₅₀₀₀-OTs(3mmol)溶于30ml DMF，加入1.68g(18mmol)邻
苯二甲酰亚胺钾盐，120℃反应4小时。减压蒸去溶剂，将残余物溶于50ml
无水乙醇，加入2.0ml水合肼，回流反应4小时。旋转蒸发除去溶剂，
将残余物溶于30ml CH₂Cl₂，滤去不溶物，再将滤液旋转蒸发除去溶剂，
用无水乙醚沉淀出固体，得12.5g mPEG₅₀₀₀-NH₂，收率83％。

将1.25g mPEG₅₀₀₀-NH₂溶于20ml二氧六环中，加入马来酸酐0.1g，80℃
搅拌反应30min。减压蒸去溶剂，加入50ml无水乙醚，冷却沉淀出固体，
滤集固体，干燥后得1.10g。将所得固体溶于15ml乙酸酐，加入0.5g
乙酸钠，100℃搅拌反应45min。减压蒸去溶剂，将残余物用二氯甲烷
溶解，将滤液浓缩至干，加入无水乙醚，沉淀出固体，滤集、干燥后得
浅黄色固体0.61g mPEG₅₀₀₀-MAL，收率48％。

1.2 Cys-Tα₁的合成

用固相法合成Cys-Tα₁：以0.5mmol Wang树脂为固相载体，
Fmoc-AA-OH(2.0mmol)作为原料，DCC(2.0mmol)-HOBT(2.0mmol)作缩合剂
按Tα₁的氨基酸序列合成全保护肽链，得2.9g Fmoc-Tα₁-树脂。称取290mg
Fmoc-Tα₁-树脂(0.1mmol)，以20％哌啶/DMF脱除Fmoc后，用
DCC(2.0mmol)-HOBT(2.0mmol)将Fmoc-Cys(Trt)-OH(2.0mmol)偶联到树
脂上，再以20％哌啶/DMF脱除Fmoc后得Cys-Tα₁-树脂。将树脂干燥后，
以EDT-间甲酚-TFA作裂解液，0℃反应90分钟，滤除树脂，将滤液旋转
蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出白色固体，滤集固体，溶于水中，冰冻
干燥得白色干粉120mg。RP-HPLC纯化，FAB-MS分析，M+1峰：3170(理
论值：3169)。

1.3 Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-Tα₁的合成

将经RP-HPLC纯化后的Cys-Tα₁溶于水中，以碳酸氢钠调pH至7-8，加
入3倍当量的mPEG₅₀₀₀-MAL，室温反应，用RP-HPLC监测反应进程和分
离产物。

Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-Tα₁经MALDI-TOF-MS分析，在8350附近有一系列
峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型结构特征。酸水解
(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例分析与理论值相符：
Asp，4.00(4)；Thr，2.81(3)；Ser，2.75(3)；Glu，6.57(6)；Ala，3.00(3)；
Val，2.58(3)；Ile，1.00(1)；Leu，1.08(1)；Lys，4.31(4)。

实施例2 Tα₁(17-24)-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂的制备

2.1 Tα₁(17-24)-Cys-NH₂的合成

以0.1mmol Rink酰胺树脂作载体，Fmoc-AA-OH(0.2mmol)作为原料，
HBTU(0.2mmol)-NMM(0.3mmol)作缩合剂，按Tα₁(17-24)的氨基酸序列合
成全保护肽树脂。以EDT-间甲酚-TFA作裂解液，0℃反应90分钟，滤除
树脂，将滤液旋转蒸发除去TFA，加无水乙醚沉淀出白色固体，滤集固体，
溶于水中，冰冻干燥得白色干粉20mg。RP-HPLC纯化，FAB-MS分析，M+1
峰：1091(理论值：1090)。

2.2 Tα₁(17-24)-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂的合成

将经RP-HPLC纯化的Tα₁(17-24)-Cys-NH₂溶于水中，以碳酸氢钠调pH
至7-8，加入3倍当量的mPEG₅₀₀₀-MAL，室温反应2小时，用RP-HPLC分离产
物。

Tα₁(17-24)-Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-NH₂-Tα₁经MALDI-TOF-MS分析，在
6182附近有一系列峰，相邻两峰分子量相差约44，具有聚乙二醇的典型
结构特征。酸水解(6N盐酸水溶液，110℃，22小时)的氨基酸组成比例
分析与理论值相符：Glu，3.41(3)；Val，1.52(2)；Lys，3.07(3)。

实施例3 Tα₁及其类似物对小鼠脾细胞产生IFN-γ的诱生作用

断头放血处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏，放入RPMI1640液
中。将脾脏放在100目不锈钢网上或尼龙网中用针芯或三角玻棒研磨，
制成脾细胞悬液。用培养液离心洗涤脾细胞一次后，加入Tris-NH₄Cl缓
冲液(0.16M NH₄Cl和0.17M Tris按9∶1混合，pH7.2)作用3-5分钟，
溶解RBC，再用培养液离心洗涤两次。用苔盼蓝染色，活细胞数需在95％
以上。用10％小牛血清1640液将细胞浓度调整到1.25×10⁷个/mL备用。
将脾细胞加入到培养无菌48孔培养板中，每孔800μL；再加入表1所示
的不同浓度待测样品和ConA 100μL(终浓度0.5μg/mL和1.0μg/mL)，置
5％CO₂培养箱中，37℃培养24小时，离心取上清，用小鼠IFN-γ检测试剂
盒测定IFN-γ的含量。

表1

    样品名称
  样品浓度(μg/mL)
            IFN-γ(ng/mL)
    ConA
    (0.5μg/mL)
    ConA
    (1.0μg/mL)
  1640培养液
    -
    27.3
    45.2

  Zadaxin

    0.1
    1.0
    10.0
    37.8
    33.9
    25.8
    9.5
    22.8
    16.8

  Tα₁

    0.1
    1.0
    10.0
    25.0
    34.0
    28.4
    15.1
    33.9
    35.4

  Cys(mPEG₅₀₀₀-MAL)-Tα₁

    0.1
    1.0
    10.0
    29.0
    26.7
    33.5
    21.7
    13.6
    27.3

  Cys(mPEG₂₀₀₀-MAL)-Tα₁

    0.1
    1.0
    10.0
    22.9
    12.8
    12.0
    38.9
    26.4
    19.2

注：Zadaxin为赛生公司的商品化Tα₁，空白对照细胞培养液上清的IFN-γ
浓度为13.8ng/mL。

实施例4 Tα1衍生物的体外抗SARS病毒实验

生长成片的96孔塑胶板培养的Vero E6细胞，倾出培养液后，加入
100TCID50的SARS病毒，吸附2小时，倾出病毒，加入待测样品，终浓
度为100μg/ml，继续培养7天，每天在显微镜下观察Vero E6细胞病变
程度，结果如表2所示：

表2

           组别
  浓度(μg/ml)
  100TCID50的结果
病毒对照(未加Tα1衍生物)
    0
    4+/4
Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1
    100
    4-/4
Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24)
    100
    4-/4
Tα1-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2
    100
    4+/4

注：4-/4表示4个孔都无病毒繁殖，即阴性；4+/4表示4个孔均为
阳性。

结论：Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1和Cys(mPEG5000-MAL)-Tα1(17-24)
在100μg/ml时有体外抗SARS病毒活性，Tα1-Cys(mPEG5000-MAL)-NH2
在100μg/ml时无体外抗SARS病毒活性。