利用油菜A和C亚基因组间杂种优势的方法 技术领域
本发明属于油菜杂种优势利用技术领域，具体涉及到一种利用油菜亚基因组间杂种优势的方法。其国际专利分类号为A01H 1/02。
背景技术
遗传学研究已经证明，双二倍体的甘蓝型油菜(AACC)、芥菜型油菜(AABB)和埃塞俄比亚芥(BBCC))是由芸苔属的三个基本种，即白菜或白菜型油菜(AA)、黑芥(BB)和甘蓝(CC)两两杂交后自然加倍产生的。这一历程发生年代久远，长期的隔离、选择和进化，使相同的基因组在不同的种间产生了深刻的分化。如果将甘蓝型油菜的染色体组认定为AACC，为了反映这种基因组分化，可将白菜型油菜的染色体组记为ArAr，埃塞俄比亚芥染色体组记为BcBcCcCc。
油菜种间杂种存在着极强的杂种优势。甘蓝型油菜与埃塞俄比亚芥(BcBcCcCc)、与芥菜型油菜(AABB)的F1杂种也均表现出强大的杂种优势(刘后利，《油菜的遗传与育种》，上海科技出版社，1985；Meng等，Euphytica，1998)。显然，这种甘埃种间杂种优势源于甘蓝型油菜的A、C基因组分别与埃芥的Bc或Cc亚基因组间的互作。由于油菜地这种种间杂种优势来源于整个基因组或亚基因组间的互作，称之为亚基因组间杂种优势。
由于甘埃杂种均为非整倍体，染色体配对不正常，杂种不育或育性极低，因此油菜的这种亚基因组间杂种优势只能表现在营养生长方面，但结实率极低，无法用于杂种种子生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种可以获得结实率正常的油菜亚基因组间杂种优势的方法，提高油菜杂种优势强度，组配超强优势的甘蓝型油菜杂交组合。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用油菜杂种优势的方法，该方法包括常规杂交育种方法和分子生物学育种方法，将传统种间杂种的育种方法革新为利用油菜亚基因组间杂种优势的方法，通过种间杂交和分子标记辅助选择，将白菜型油菜的Ar基因组与埃塞俄比亚芥Cc基因组结合在一起，培育出染色体组型为ArArCcCc的甘蓝型油菜优良品系，进而组配超强优势的甘蓝型油菜杂交组合。这些品系的价值并不在于其本身可能具有一定的杂种优势，而在于用它们与自然的甘蓝型油菜配组，可产生染色体组型为ArACcC的F1杂种。由于这些杂种中存在着Ar/A、Ar/C和Cc/C间的基因组互作和亚基因组间互作，将会产生超强的杂种优势。而在另一方面，这些杂种又是双二倍体，育性正常，从而可以利用于油菜籽的生产。
体实施方式
实施例1
1、种间杂交：
以埃塞俄比亚芥作母本，以白菜型油菜作父本，得到染色体组型为ArBcCc的F1种间杂种种子。但这一组合的杂交亲和性低，结实率因组合不同而差异很大。对于结实率近于零的组合须采用胚挽救方法得到杂种苗。用0.1％秋水仙素处理埃塞俄比亚芥与白菜型油菜的F1杂种幼苗，获得染色体组型为ArArBcBcCcCc的异源六倍体。
2、对杂交后代的处理
用双低甘蓝型油菜品种与埃塞俄比亚芥与白菜型油菜杂交的异源六倍体杂交，产生染色体组型为ArArBcCcC的倍半五倍体。在减数分裂中，倍半五倍体中的Bc基因组因不能配对而将被消除，仅Ar、A、Cc’、C基因组的染色体传递到F2代。种植F2代植株，检查花粉母细胞减数分裂行为，选减数分裂和散粉正常，结实率高，农艺和品质性状符合育种要求且染色体数为2n＝38的单株。
3、对当选株系的基因组分析测试：
对处理杂交后代后所获得的植株进行基因组指纹分析。所述的方法包括扩增片段长度多态性(AFLP)，简单序列重复(SSR)，限制性片段长度多态性(RFLP)等可靠性高，稳定性强的DNA指纹分析方法。然后再根据当选植株的DNA指纹，结合其亲本指纹在埃塞俄比亚芥/白菜型油菜与甘蓝型油菜杂交后代中选出染色体组型为ArArCcCc的F3株系。
DNA指纹分析方法具体步骤是：
AFLP的分析程序：AFLP指纹分析主要采用Vos等(1995)的方法，并对其进行了以下修正：(1)采用250ng基因组DNA，2.5U EcoRI，2.5U MseI，2.0μl双酶切缓冲液Y+/TangoTM，加超纯水到20μl 37℃酶切3小时；(2)酶切完成后，每个反应再加5μl连接混合液于37℃连接3小时，该混合液由以下成分构成：EcoRI接头(5μM)0.5μl，MseI接头(50μM)0.5μl，T4 DNA连接酶0.5U，10x T4 DNA连接酶缓冲液0.5μl，用超纯水把混合液体积调至5μl；(3)预扩增采用以下体系进行，10×Taq DNA聚合酶缓冲液2.0μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTP(含dATP dTTPdCTP dGTP四种脱氧核苷酸各2.0mM)2μl，带1-碱基3′-延伸末端的EcoRI引物30ng，带1-碱基3′-延伸末端的MseI引物30ng，Taq DNA聚合酶0.5U，稀释了10倍的酶切/连接核苷酸产物1μl，加超纯水至20μl。预扩增的PCR热循环为：①94℃ 2分钟，②94℃ 30秒，③50℃ 30秒，④72℃ 1分钟，⑤重复②到④步34次，⑥将PCR热循环于4℃停止。(4)预扩增产物稀释10倍后取1μl再进行选择性扩增，并采用有3个碱基的3’-延伸末端的引物来控制扩增带纹的密集程度。其PCR热循环为：①94℃ 2分钟，②94℃ 30秒，③65℃ 30秒，④72℃ 1分钟，⑤重复②到④步10次，并且使每个循环的复性温度都在上个循环的基础上降低一度，这样使复性温度一直降到56℃，然后保持56℃的复性温度继续进行25个循环。⑥最后将PCR热循环于4℃停止。(6)按《分子克隆》(第二版)中的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(7)电泳结果采用试剂盒银染显示，方法见银染试剂盒说明书。
SSR的分析程序：SSRs(Simple Sequence Repeats，简单序列重复)是指根据真核生物基因组中具有丰富变异的简单重复序列两端的保守序列设计PCR引物扩增出来的多态性带纹。我们所用的引物主要根据Szewc-McFadden等1996年的报道合成的。PCR混合液为：DNA模板10ng，左右引物各15pmol，dATP dTTP dCTP dGTP四种脱氧核苷酸各3.75μmol，MgCl2(25mM)1.875μl，1.0U Taq酶，10×Taq DNA聚合酶缓冲液1.5μl，15μl反应体系。PCR热循环采用以下体系进行：94℃变性2分钟，接着是20个循环的严紧性不断降低的变温PCR扩增：94℃ 60秒变性，变温30秒复性，72℃延伸45秒，复性温度从68℃到58℃，每2个循环降低1℃，然后保持58℃的复性温度再扩增25个循环，最后4℃储藏。PCR扩增产物按《分子克隆》(第二版)中的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和试剂盒银染显示多态性。
RFLP的分析程序：RFLP指纹分析主要按《分子克隆》(第二版)的方法进行，并对其进行了少量修正：(1)取15μg质量上好的基因组DNA进行酶切，0.4N NaOH转膜；(2)1-4张10×20cm2膜取30ml预杂交液于65℃预杂交8-10小时；(30ml预杂交液包含：硫酸葡聚糖(Dextransulfate)0.3g于17.7ml超纯水65℃溶解，20×SETS 6ml，50×Denharts 6ml，10％ SDS 0.3ml，变性断裂的鲑鱼精DNA 3mg。)(3)5-10ml杂交液于65℃杂交12小时；(5ml杂交液包含硫酸葡聚糖0.5g于2.92ml超纯水65℃溶解，20×SETS 1ml，50×Denharts 1ml，10％ SDS 0.05ml，变性断裂的鲑鱼精DNA 0.1mg，[α-32P]dCTP标记的探针40μl；(4)探针标记采用以下体系常温标记5小时：探针DNA模板4μl(约400ng)，6碱基随机引物3μl(150ng)，DNA分子量标记2μl(20ng)，超纯水19μl，以上混合均匀后沸水浴3分钟，于冰水中冷却后继续加入二硫苏糖醇(DTT)2ul(40mmol)，dATP、dGTP和dTTP混合液2μl(各10mmol)，10×Klenow聚合酶缓冲液4ul，DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment)2ul，进口[α-32P]dCTP 2ul(20μCi)。(5)洗膜和压片按《分子克隆》(第二版)中讲述的方法进行。
采用以上各种分子标记，本发明在白菜型油菜或埃塞俄比亚芥内部和它们之间都检测到了丰富的多态性，其中更不乏白菜型油菜或埃塞俄比亚芥所特有的标记，为辅助选择提供了大量信息，现举例说明。
白菜型油菜所特有的标记有：PN138H15、PN67H9、PA14H3.4、PN54B6.5......
4、配合力测验
以基因组组成主要为ArArCcCc的新甘蓝型油菜与甘蓝型油菜不育系测交，根据F1的表现选出超强优势的杂交组合。当所选株系中不含恢复基因时，采用转基因方法导入TA29或其它雄性不育基因。
本发明的优点是：
1.解决了油菜亚基因组间杂种不育的问题，使其杂种能用于油菜F1种子的生产。
2.获得超强优势的油菜组合。