红腰子豆素和它的制备方法及其用途.pdf

红腰子豆素和它的制备方法及其用途，属于制药领域，涉及来源于植物种子提取的植物糖蛋白的分离纯化技术及其应用。它是从红腰子豆经过粉碎后，用1％的氯化钠溶液浸提，离心取上清液，用醇醚混合液沉淀，离心得到的粗提取物，真空冷冻干燥后用氯化钠溶解，经二乙胺基乙基纤维素离子交换层析柱，收集红腰子豆素的洗脱液，真空冷冻干燥，得到红腰子豆素，它是一种由四个蛋白亚基组成的糖蛋白，每个蛋白亚基的平均分子量为29.5～30.5kD；红腰子豆素平均分子量为119～121kD，用于制备提高机体免疫力、贫血和再生障碍性贫血、预防白细胞减少、治疗和预防淋巴细胞低下的药物。

1、  一种红腰子豆素，其特征是从豆科(Legaminosae)菜豆属(Phaseolus)的红腰子豆(Phaseolus vuigaris)植物的种子提取的由四个蛋白亚基组成的糖蛋白，每个蛋白亚基的平均分子量为29.5～30.5kD；红腰子豆素平均分子量为119～121kD。

2、  根据权利要求1所说的红腰子豆素，其特征是所述的四个蛋白亚基中，一种亚基的N端氨基酸序列为Ser-Asn-Asp-Ile-Tyr-Phe-Asn-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg，另一种亚基的N端氨基酸序列为Ala-Ser-Gln-Thr-Ser-Phe-Ser-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg。

3、  根据权利要求1所说的红腰子豆素的制备方法，其特征是用红腰子豆种子经过粉碎后，用1％的氯化钠溶液浸提12～16小时，离心取上清液，用10％～30％的醇醚混合液沉淀，离心得到红腰子豆素的粗提取物，真空冷冻干燥后用1％～5％的氯化钠溶解，经二乙胺基乙基纤维素离子交换层析柱，收集红腰子豆素的洗脱液，真空冷冻干燥，即得到红腰子豆素。

4、  根据权利要求1所述的红腰子豆素的用途，其特征在于制备含有红腰子豆素的冻干粉针剂、小水针。

5、  根据权利要求1所述的红腰子豆素的用途，其特征在于制备提高机体免疫力的药物。

6、  根据权利要求1所述的红腰子豆素的用途，其特征在于制备治疗贫血和再生障碍性贫血的药物。

7、  根据权利要求1所述的红腰子豆素的用途，其特征在于制备治疗和预防白细胞减少的药物。

8、  根据权利要求7所述的红腰子豆素的用途，其特征在于制备治疗和预防淋巴细胞低下的药物。

红腰子豆素和它的制备方法及其用途
                        技术领域
本发明属制药领域，涉及来源于植物种子提取的植物糖蛋白的分离纯化技术及其应用。
                        背景技术
Rigas等采用硫酸铵沉淀技术最先从菜豆中分离植物血球凝集素提取物(Rigas D.A.et al.，1955，J.Biol.Chem.212：609)，但提取物较粗。Allen等首先将植物血球凝集素提取物用离子交换层析方法分离为刺激淋巴细胞分裂和低红细胞凝集活性的L-PHA(白细胞凝集素)和既有刺激淋巴细胞分裂又有促红细胞凝集活性的蛋白混合物H-PHA(Allen，L.W.，et al.，1969，Proc Natl.Acad.Sci.USA，63：334)。Dahlgren等根据PHA的不同的凝集活性，分离出只凝集白细胞的L-PHA和白细胞和红细胞均凝集的E-PHA(Dahlgren，K.et al.，1970，Arch.Biochem.Biophys.，137：306)。Weber等测定出L-PHA和E-PHA的分子量分别为150000和140000，各由四个分子大小相似的亚基构成(Weber，T.H.et al.，1972，Biochem.Biophys.Acta，263：94)。根据提取方法的不同，PHA的制品分为PHA-M和PHA-P，前者为盐水浸出物，为PHA的糖蛋白形式；后者为酸浸出物，为PHA的蛋白形式。我国的丁邦裕等(1991年)用pH值为2的酸性水抽提江苏豌豆种子粉后，硫酸铵分级沉淀得PHA的一种同工凝集素PHA-P(生物化学杂志，1991，7：26)；
CN1230891A公开了一种凝集素在制备控制粘膜细胞增殖、减轻和/或治疗因细胞-损伤剂引起的损伤以及减轻和/或治疗代谢性疾病之药物中的应用，其凝集素包括天然的和化学合成的，而该专利是来自菜豆、大豆、刀豆、小麦胚芽、莲花种子、洋葱、兵豆、番茄、马铃薯提取分离的一种凝集素；CN1240670A公开了一种植物血球凝集素的分离纯化技术，它是用植物菜豆为原料，用盐溶液抽提和强阳离子柱层析两个步骤，采用一根强阳离子柱S-Sepharose Fast Flow(SSFF)获得了高纯度PHA-E，纯度可达95％以上，PHA-E是一种红细胞凝集素，其等电点为6.5，分子量约为33kD，血细胞凝集活性最低为13μg/ml。
CN1439425公开了一种植物血球凝集素(PHA-P)，用于制备抗癌药物，PHA-P是一类含糖量为23.1％的糖蛋白；但上述的这些文献报道，都是实验室的研究，植物血球凝集素至今还未成为工业医药产品，应用于临床。由于不同植物中的植物血球凝集素PHA的组成差异较大，作用也会不同。
                        发明内容
本发明的目的是寻找从红腰子豆植物提取一种活性成分，分离纯化红腰子豆素的方法，用于促进淋巴细胞分裂生长和分化，适用于工业生产，应用于制备药物。
为达到本发明的目的所采用的技术方案：从豆科(Legaminosae)菜豆属(Phaseolus)的红腰子豆(Phaseolus vuigaris)植物的种子提取的由四个蛋白亚基组成的糖蛋白，每个蛋白亚基的平均分子量为29.5～30.5kD；红腰子豆素平均分子量为119～121kD。所述四个蛋白亚基可以相同，也可以不同，其中，一种亚基的N端氨基酸序列可以为Ser-Asn-Asp-Ile-Tyr-Phe-Asn-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg，另一种亚基的N端氨基酸序列可以为Ala-Ser-Gln-Thr-Ser-Phe-Ser-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg。
本发明所说的红腰子豆素的制备方法，是用红腰子豆经过粉碎后，用1％的氯化钠溶液浸提12～16小时，离心取上清液，用10％～30％的醇醚混合液沉淀，离心得到红腰子豆素的粗提取物，真空冷冻干燥后用1％～5％的氯化钠溶解，经二乙胺基乙基纤维素离子交换层析柱，收集红腰子豆素的洗脱液，真空冷冻干燥，即得到红腰子豆素。
用上述方法制得的红腰子豆素经过聚丙烯酰胺电泳检测、十二烷基硫酸钠(SDS)变性电泳检测、蛋白质分子量测定等检测分析表明红腰子豆素是由四个平均分子量为29.5～30.5kD蛋白亚基组成的糖蛋白，通过氨基酸序列测定表明红腰子豆素有两种不同N端氨基酸序列的蛋白亚基；并经生物活性检测，用人体血液体外培养观察其对淋巴细胞转化率的作用，可见本发明所提供的红腰子豆素能促进人体血液中淋巴细胞转化，其转化率大于60％，在其对淋巴细胞发挥药效作用剂量范围内对人体红细胞没有凝集作用。
红腰子豆素生物活性检测方法
1.材料和方法
1.1材料
检测样品：108II
血源：正常输血员血液
培养液：RPMI-1640培养液(自配、不含小牛血清)。
1.2方法
按以下步骤进行操作：血液放置37℃恒温箱自然沉降；→红腰子豆素样品用无菌生理盐水配成1mg/ml浓度，取0.1毫升稀释至1毫升，再取0.15毫升加入含有0.5毫升血浆的1640培养液2.5毫升中，使其最终浓度为10μg/ml，设不加红腰子豆素对照管；→放置37℃二氧化碳培养箱培养72小时；→终止培养，将培养管放于离心机离心1000转/10分钟；→吸取沉淀的细胞涂片；→Wright染液染色；→油镜下计数200个淋巴细胞中转化细胞的百分率。
2.结果
在红腰子豆素刺激下，小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，在镜下可见分裂相的淋巴母细胞。计数200个淋巴细胞的进入分裂生长状态数目，减去对照管的相应数目，即可获得淋巴细胞的转化率。一般来说，在剂量为5～10μg/ml的红腰子豆素时，淋巴细胞的转化率有60％～70％。
用本发明提供的红腰子豆素用途之一，可制备含有红腰子豆素和药学上可接受的赋形剂，制成冻干粉针剂、小水针剂。
1、冻干粉针剂的制备
配方：红腰子豆素             10g
      氯化钠                 10g
      甘露醇                 30g
操作方法：用1％的氯化钠溶液溶解成为每毫升含有红腰子豆素10毫克的溶液，按GMP要求和冻干粉剂的通常制备方法，制成每支为5毫克或10毫克的注射用冻干粉针，按生物制品质量检验的要求检定合格后即可。在冻干粉针剂中还可以加入适量的甘露糖、乳糖或其它的一些药用辅料。
2、水针剂的制备
配方：红腰子豆素             10g
      氯化钠                 10g
      蒸馏水                 加至1000ml
操作方法：用药用生理盐水溶解成为每毫升含有红腰子豆素5毫克或10毫克的溶液→按GMP要求和水针剂的通常制备方法，制成每支为5毫克或10毫克的注射用水针剂→质量鉴定合格后即可获得成品。
本发明所提供的红腰子豆素的用途之二，可用于制备提高机体免疫力地药物。
下面用本发明提供的红腰子豆素进行体外免疫学试验，说明其在医药领域中用于提高机体免疫力的用途。
1、机体免疫力的测定——淋巴细胞转化试验
对于人体来说，正常人体外周血淋巴细胞的转化率≥55％，而免疫力低下的人体的外周血淋巴细胞转化率一般＜50％。用淋巴细胞转化试验测定人体免疫力状态的方法同前述的“红腰子豆素生物活性检测方法”。
2、红腰子豆素对提高人体免疫力的临床观察
使用方法：细胞免疫功能低下者20例，每日静脉滴注红腰子豆素15毫克(溶于5％葡萄糖生理盐水)。结果：使用红腰子豆素治疗，细胞免疫功能恢复较快，14例有效的患者在治疗前的平均淋巴细胞转化率为38％，治疗后上升到57％。细胞免疫功能恢复正常(淋巴细胞转化率大于55％)12例，细胞免疫功能有提高者4例，其余5例无变化。表明红腰子豆素对提高免疫力有较好的效果。
红腰子豆素的用途之三，是用于制备治疗贫血和再生障碍性贫血的药物中的应用。
红腰子豆素的用途之四，是用于制备治疗和预防白细胞减少的药物中的应用。
红腰子豆素的用途之五，是用于制备治疗和预防淋巴细胞低下的药物中的应用。
下面用动物试验证明红腰子豆素用于制备治疗贫血和再生障碍性贫血和白细胞减少症的药物中的应用，特别是对淋巴细胞减少的白细胞减少症效果更好：
1、红腰子豆素对再生障碍性贫血、白细胞减少、淋巴细胞减少的小鼠模型药效试验
一、材料和方法
1、动物：Balb/c小鼠，8～12周龄，体重16～20g，雄性；DBA/2小鼠，8～12周龄，雌雄不拘，由中山大学实验动物中心提供。
2、药物及其对照：红腰子豆素冻干粉针1mg/瓶，阳性药物对照为环孢素A(CSA)，阴性对照为生理盐水。
3、造模方法：电离辐射损伤模型，破坏全身造血组织(包括淋巴细胞系统、红细胞系统、粒细胞系统和单核细胞及巨噬细胞系统)
(1)辐射：根据华南农大辐照中心所检定的⁶⁰Co辐射强度(0.5Gy/min)，共照射6Gy/12min。
(2)免疫细胞输入：取DBA/2小鼠胸腺细胞，4h内将细胞尾静脉注射照射后的Balb/c小鼠，输入量为1×10⁶个细胞/只。
(3)药物注射：红腰子豆素冻干粉针和环孢素A(CSA)按预定剂量(0.05mg/只/天)进行。
4、小鼠分组及处理：
将小鼠随机分组，每组15只，分别为：
正常组(Con-)：未照射动物腹腔注射生理盐水，0.2ml/天；
模型组(Con+)：造模后处理同正常组；
红腰子豆素组：造模后腹腔注射红腰子豆素，注射体积0.2ml/天；
CSA组：造模后腹腔注射环孢素A注射体积0.2ml/天(剂量约为人的50倍)。
5检测指标：实验结束时每组随机检测10只动物。测定小鼠的血红蛋白，对红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板和骨髓有核细胞数(BMNC)计数。
6数据处理：取10只动物的检测结果的平均值。统计处理主要数据以均值±标准差表示，进行t检验，p＜0.05为显著。^*为红腰子豆素和模型组比较具有显著差异。
二、结果和分析
各组小鼠的血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板和骨髓有核细胞数的检测结果如下表。
药物处理    血红蛋白      红细胞        白细胞       淋巴细胞        血小板         骨髓有核细
            (g/L)         (10¹¹/L)     (10⁹/L)    (10⁸/L)        (10⁹/L)       胞数(10⁵)
正常组      170±7.4      5.15±1.12    7.5±0.9     680.3±11.2     641.3±5.2     110.2±10.3
模型组          83±8.0         1.32±0.31        0.51±0.12       110.2±10.3      8.0±0.9          0.99±0.26
红腰子豆素     151±10.5^*     3.98±0.83^*      1.16±0.32^*     231.5±23.3^*   171.2±10.3^*     45.10±0.53^*
处理组
CSA组          119±10.6^*     2.65±0.62^*      1.17±0.06^*     220±14.6^*     181.9±14.5^*     20.91±1.23^*
由此可见，红腰子豆素对再生障碍性贫血小鼠的血红蛋白、红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板和骨髓有核细胞有显著的恢复和治疗作用，对白细胞减少(低下)、淋巴细胞减少(低下)有显著的治疗效果。
2、红腰子豆素对骨髓抑制小鼠模型药效试验：
一、材料和方法
1.动物：昆明鼠18～22g，每组15只，8～12周龄。雌雄不拘，由中山大学实验动物中心提供。
2.药物和对照：红腰子豆素冻干粉针1mg/瓶
3.造模方法：环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠每日一次，连续三次
分组：正常组：注射生理盐水0.2ml/次
      造模组阴性对照：造模后尾静脉注射生理盐水0.2ml/次
      高剂量组：造模后尾静脉注射红腰子豆素0.1mg/只/次
      中剂量组：造模后尾静脉注射红腰子豆素0.05mg/只/次
      低剂量组：造模后尾静脉注射红腰子豆素0.025mg/只/次
      注射体积：0.2ml/次
于造模后尾静脉注射红腰子豆素，每三日注射一次，共注射三次。在最后一次红腰子豆素后的第四日处理动物进行观察。
4.检测指标：各组小鼠分别于注射当天、第5天、第10天测定血红蛋白(HGB)，对其红细胞、白细胞、血小板计数。采用尾静脉采血方法。造模后第5天，每组处死2只小鼠进行骨髓细胞学检查。造模后第15天，全部处死小鼠，进行骨髓细胞培养和骨髓细胞学检查：红系祖细胞(BFU-E)、粒巨系祖细胞(CFU-GM)。
5.数据处理：主要数据以均值±标准差表示，进行t检验，p＜0.05为显著。
^*为各组和模型组比较具有显著差异。
                                         各组外周血象变化
组别          只数       WBC(×10⁹/L)       RBC(×10¹²/L)      HGB(g/L)          PLT(×10⁹/L)
小剂量组      9          3.5±0.9^*          5.1±0.7^*          93.9±14.4^*      534.2±110.4^*
中剂量组      11         4.0±0.5^*          4.7±0.4^*          92.8±4.4^*       467.9±43.3^*
高剂量组      11         4.2±0.7^*          5.3±0.4^*          97.7±6.4^*       504.1±76.0^*
造模组        8          3.0±0.6            3.3±0.8             49.2±10.6        239.8±79.0
正常组        13         5.4±1.6^*          4.6±0.7^*          80.2±7.4^*       724.8±104.3^*
各组骨髓细胞学变化
组别          只数       粒：红            有核细胞数            形态描述
小剂量组      9          0.90±0.12         5.5±0.2^*         骨髓增生活跃，可见幼红及巨核细胞
中剂量组      11         1.40±0.11^*       8.6±0.5^*         骨髓增生活跃，多见幼红及巨核细胞
高剂量组      11         1.80±0.09^*       12.1±0.2^*        骨髓增生活跃，易见幼红及巨核细胞
造模组        8          0.75±0.16         1.3±0.3            骨髓增生活跃，可见少许幼红，偶见巨核细胞
正常组        13         2.08±0.14^*       15.3±0.7           骨髓增生明显活跃，易见幼红及巨核细胞
                    各组BFU-E、CFU-GM培养
组别          只数       BFU-E               CFU-GM
小剂量组      9          14.70±7.35^*       7.91±1.73^*
中剂量组      11         11.90±4.64^*       12.0±5.0^*
高剂量组      11         13.66±3.12^*       9.7±2.1^*
造模组        8          1.60±1.2           0.63±0.45
正常组        13         2.18±1.72          6.8±1.7
由此可见，红腰子豆素对骨髓抑制小鼠的血红蛋白、红细胞、白细胞、血小板和骨髓有核细胞有显著的恢复和治疗作用。说明体外可刺激小鼠红系、粒巨系祖细胞增殖及分化作用。说明红腰子豆素可加速损伤骨髓造血功能的恢复，可用于制备贫血药物。
3、红腰子豆素制剂对再生障碍性贫血的疗效观察
用红腰子豆素制剂治疗再生障碍性贫血12例，其中有效7例，有效率达58％。使用方法为：一次用红腰子豆素15～20毫克(根据体重增减用药量)，溶于生理盐水后再与10％的葡萄糖液混合，静脉滴注，两个星期为一个疗程。病人治疗时间为2个月到12个月不等。对于有疗效的病例，一般用药2～3个疗程后，可显著减少输血次数，血红蛋白、红细胞和白细胞数逐步恢复正常。4、红腰子豆素对慢性苯中毒引起的白细胞减少疗效观察
方法：10例职业性的慢性苯中毒者，每日一次以红腰子豆素15毫克加入10％的葡萄糖静脉滴注，连续14天为一个疗程。
结果：经过一个疗程后，8例患者的白细胞显著升高，升高的幅度为10％～48％，平均达29％；10例患者的淋巴细胞转化率均明显提高，提高率为27％～53％，平均提高38％；患者的自觉症状都有不同程度的改善。
本发明的积极效果是：1.从豆科植物红腰子豆种子用简单的提取分离技术得到了一种纯度较高的糖蛋白，植物资源易得，工艺简单，适于工业化批量生产。
2.本发明所提供的产品可用于制备提高机体免疫力、贫血和再生障碍性贫血、预防白细胞减少、治疗和预防淋巴细胞低下的药物。
3、本发明所提供的红腰子豆素能促进人体血液中淋巴细胞转化，其转化率大于60％，在其对淋巴细胞发挥药效作用剂量范围内对人体红细胞没有凝集作用。
下面通过实施例和附图详细说明本发明的技术方案
                     附图说明
图1、为红腰子豆素的离子柱分离纯化色谱图。
图2、为红腰子豆素的分子筛纯化色谱图。
图3、为红腰子豆素的凝胶电泳扫描图。
图4、为红腰子豆素的SDS-PAGE电泳图。
图5、为红腰子豆素的质谱分析图。
                 具体实施方式
实施例1：红腰子豆素的制备
取广东江门产红腰子豆种子洗净晾干，用粉碎机粉碎，过50目网筛后，称取500克，用1％的氯化钠溶液5倍重量溶液浸提12小时，3000rpm离心15分钟取上清液，用70％的乙醇沉淀，再用10％乙醚沉淀，取上清经3000rpm离心15分钟取沉淀，即为红腰子豆素的粗提取物约25g，真空冷冻干燥后每次用10g粗粉加2％的氯化钠溶液溶解后以30kD超滤膜超滤后进行DEAE-Sepharose离子交换分离，以15mmol/L pH6.5磷酸盐缓冲液(A液)平衡离子交换柱，进样后，将A液和B液(B液中含有1mol/L NaCl的溶液)以0.01～0.05mol/L NaCl梯度进行洗脱，流速为5ml/min，276nm波长检测，收集含红腰子豆素洗脱液，见图1中箭头所示。在-40℃真空冷冻干燥。
然后对含有红腰子豆素的收集峰进行分子筛凝胶过滤，脱盐或以5～10kD截留分子量超滤膜超滤浓缩脱盐，如图2所示，经过真空冷冻干燥，即获得红腰子豆素纯品289mg。通过反相C18的HPLC或变性电泳分析测定红腰子豆素的纯度≥97％。
取本品进行非变性电泳(PAGE)检测
方法：按通用的聚丙烯酰胺电泳方法。分离胶为10％，浓缩胶为4％。以卡马斯亮蓝染色。用Bio-Rad的Gel Doc 2000成像系统进行分析。
电泳的结果如图3所示，表明红腰子豆素在非变性电泳中呈现为一条较宽的蛋白质带，这是一种典型的糖蛋白分子的不均一性的电泳行为(与其SDS-PAGE对照)。
取本品进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测
检测方法：1.制胶贮液配制：
1)丙稀酰胺贮液：14.55g丙稀酰胺+0.45gN，N′-甲叉双丙稀酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50ml，过滤。用棕色瓶可在4℃保存一个月。
2)浓缩胶缓冲液贮液(0.1mol/L Tris-HCL，pH6.8)：6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中，用4mol/L盐酸调节至pH6.8，再用双蒸水加至50ml，4℃保存。
3)分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCL，pH8.8)：9.08g Tris溶解在40ml双蒸水中，用4mol/L盐酸调节至pH8.8，再用双蒸水加至50ml，4℃保存。
4)10％SDS：25gSDS，用双蒸水溶解至250ml，室温保存。
5)10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水，使用前新鲜配制。
6)10％TEMED：0.1ml TEMED+0.9ml双蒸水。
SDS不连续电泳用的凝胶配方(垂直电泳用)
贮液                            凝胶终浓度
                            T＝3％        T＝10％
单体贮液(ml)                3.4           10
浓缩胶缓冲液贮液(ml)        2.4           -
分离胶缓冲液贮液(ml)        -             7.5
10％SDS                     0.2           0.3
双蒸水                      14            12.2
10％过硫酸铵                10            10
10％TEMED                   10            10
2.电泳：电泳缓冲液常用Tris-甘氨酸系统(0.025mol/L Tris，0.192mol/L甘氨酸，0.1％SDS，pH8.3)，加样(恒电流2mA)，浓缩电泳(恒电流10mA，时间30min)，分离电泳(恒电压300V，时间45min)共约2小时。上样量不小于10ug。
3.染色：考玛斯亮蓝染色
染色液：在980ml 2％磷酸中加入100g过硫酸铵，直到完全溶解。再加1g考玛斯亮蓝G-250(溶在20ml水中)，不需过滤，使用前振摇。
固定：将凝胶放在12％三氯醋酸中固定1小时。
染色：取160ml染色液，在染色时加40ml甲醇。染色过夜。
漂洗：染色后用漂洗液(10％醋酸、5％甲醇水溶液)漂洗24小时以上。随后用水反复浸泡至无醋酸味。
电泳的结果如附图4所示，左带为红腰子豆素，右带为蛋白质分子量标准。红腰子豆素在SDS-PAGE下呈现为均一的蛋白质带，通过与蛋白质分子量标准的比较表明红腰子豆素的蛋白亚基的分子量为30kD左右。由PAGE和SDS-PAGE的比较表明，红腰子豆素的糖基化链有较大的不均一性。
取本品进行质谱分析，测定其分子量
质谱分析在Bruke公司ProFlex III MALDI TOF质谱仪上进行，采用阳离子工作模式。基质为CCA(a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)饱和液，基质溶解液为50％的乙腈和50％的溶解有0.1％TFA的双蒸水。按1∶20将样品溶液和基质溶液混合后点样，室温下自然干燥，进行质谱分析。
质谱分析结果如图5所示，由此表明红腰子豆素的蛋白亚基的平均分子量为29.3～30.5kD，结合电泳的分析数据表明天然的红腰子豆素的平均分子量为约120kD左右。通过质谱分析可以推测：红腰子豆素的糖基化链的不均一性是比较大的，并且其蛋白亚基之间的分子量有一定差异。
取本品进行氨基酸序列测定
氨基酸序列测定在Applied Biosystem 491 Pulse Liquid Phase测序仪上自动进行。苯异内酰硫脲(PTH)氨基酸用PTH C18柱在Applied Biosystem的140C分析仪上进行反相HPLC。
氨基酸序列结果确定如下：
一种亚基的N端氨基酸序列为：Ser-Asn-Asp-Ile-Tyr-Phe-Asn-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg
另一种亚基的N端氨基酸序列为：Ala-Ser-Gln-Thr-Ser-Phe-Ser-Phe-Gln-Arg-Phe-Asn-Glu-Thr-Asn-Leu-Ile-Leu-Gln-Arg
用本品测定其对人体外周血淋巴细胞的促分裂作用
测定方法：
1.淋巴细胞的分离(参见薛庆善.2001.体外培养的原理与技术.科学出版社.590-592)
2.淋巴细胞的培养(参见薛庆善.2001.体外培养的原理与技术.科学出版社.610-611)及参照前述“淋巴细胞转化试验”的方法
1)用含10％小牛血清培养基将纯化的淋巴细胞配成密度为5×10⁵～1×10⁶个/ml的悬液。加入红腰子豆素至终浓度10μg/ml。
2)将细胞悬液加入25cm²培养瓶，每瓶12ml。
3)至饱和湿度、37℃、5％CO₂培养箱培养3天。
3.Wright染液染色和观察
离心收集培养的细胞，涂片后Wright染色液染色，在显微镜中观察细胞的分化情况。
结果：在镜下可见分裂相的淋巴母细胞，加入红腰子豆素的淋巴细胞转化率为65％；未加红腰子豆素的对照，处于分裂相的淋巴母细胞很少，淋巴细胞转化率为52％。
实施例2
取广东的红腰子豆种子洗净晾干，用粉碎机粉碎，过50目网筛后，称取400克，用1％的氯化钠溶液7倍重量溶液浸提16小时，3000rpm离心15分钟取上清液，用70％的乙醇沉淀，再用20％乙醚沉淀，取上清经3000rpm离心15分钟取沉淀，即为红腰子豆素的粗提取物约20.3g，真空冷冻干燥后，每次将粗提取物10g用1％的氯化钠溶液溶解后以30kD超滤膜超滤后进行DEAE-Sepharose离子交换分离，以15mmol/L_PH6.5磷酸盐缓冲液(A液)平衡离子交换柱，进样后，将A液和B液(B液中含有1mol/L NaCl的溶液)以0.01～0.05mol/L NaCl梯度进行洗脱，流速为5ml/min，276nm波长检测，收集含红腰子豆素洗脱液在-40℃真空冷冻干燥。
然后对含有红腰子豆素的收集峰进行分子筛凝胶过滤脱盐或以5～10kD截留分子量超滤膜超滤浓缩脱盐，经过真空冷冻干燥，即获得红腰子豆素纯品400mg。通过反相C18的HPLC或变性电泳分析测定红腰子豆素的纯度≥97％。淋巴细胞转化率为67％。
实施例3：
取广东的红腰子豆种子洗净晾干，用粉碎机粉碎，过50目网筛后，称取400克，用1％的氯化钠溶液8倍重量溶液浸提16小时，3000rpm离心15分钟取上清液，用70％的乙醇沉淀，再用30％乙醚沉淀，取上清经3000rpm离心15分钟取沉淀，即为红腰子豆素的粗提取物约20.3g，真空冷冻干燥后，将10g粗提取物用5％的氯化钠溶液溶解后以30kD超滤膜超滤后进行DEAE-Sepharose离子交换分离，以15mmol/L_PH6.5磷酸盐缓冲液(A液)平衡离子交换柱，进样后，将A液和B液(为B液中含有1mol/L NaCl的溶液)以0.01～0.05mol/L NaCl梯度进行洗脱，流速为5ml/min，276nm波长检测，收集含红腰子豆素洗脱液在-40℃真空冷冻干燥。
然后对含有红腰子豆素的收集峰进行分子筛凝胶过滤脱盐或以5～10kD截留分子量超滤膜超滤浓缩脱盐，经过真空冷冻干燥，即获得红腰子豆素纯品385mg。通过反相C18的HPLC或变性电泳分析测定红腰子豆素的纯度≥97％。淋巴细胞转化率为68％。
                              序列表
<110>广州拜迪生物医药有限公司
<120>红腰子豆素和它的制备方法及其用途
<160>2
<210>1
<211>20
<212>PRT
<400>1
亚基A的N端氨基酸序列为：
Ser Asn Asp Ile Tyr Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn
1                5                  10
Glu Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg
        15                  20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<400>2
亚基B的N端氨基酸序列为：
Ala Ser Gln Thr Ser Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn
1                5                  10
Glu Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg。
        15                  20