一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法.pdf

本发明提供了一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法。本发明采用小鼠耐缺氧实验作为参芎葡萄糖注射液生物活性的测定方法，实验证实参芎葡萄糖注射液可明显延长缺氧小鼠的存活时间，显示出较好的生物活性。该方法操作简便、指标明确、灵敏度高、重现性好，可用于表征参芎葡萄糖注射液生物活性信息，能有效控制参芎葡萄糖注射液的内在质量。

1.  一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法，其特征是健康昆明小鼠若干，随机分为正常对照组、盐酸异丙肾上腺素对照组和参芎葡萄糖注射液组，参芎葡萄糖注射液组健康昆明小鼠每天均自尾静脉注射给药一次，连续三天，给药量为以盐酸川芎嗪计，56mg/kg；正常对照组健康昆明小鼠注射与参芎葡萄糖注射液组给药量等体积的生理盐水；盐酸异丙肾上腺素对照组健康昆明小鼠在注射与参芎葡萄糖注射液组给药量等体积的生理盐水20min后，皮下注射15mg/kg盐酸异丙肾上腺素；正常对照组、盐酸异丙肾上腺素对照组和参芎葡萄糖注射液组注射15min后将各组置于装有5g钠石灰的125ml广口瓶中，瓶口用凡士林密封，封盖后，以秒表观察小鼠存活时间,将每组数据进行t检验，以如下公式(1)计算存活时间延长率；

盐酸异丙肾上腺素组存活时间与正常对照组比较有显著性差异则试验有效；在试验有效情况下，参芎葡萄糖注射液组存活时间与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著差异，则参芎葡萄糖注射液符合规定；结果判定盐酸异丙肾上腺素组存活时间与正常组比较有显著性差异(p<0.05)则试验有效；参芎葡萄糖注射液组存活时间与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著差异(p<0.05)，则样品符合规定，显示其具有延长小鼠存活时间的作用。

2.  如权利要求1所述的一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法，其特 征在于，所述正常对照组、盐酸异丙肾上腺素对照组和参芎葡萄糖注射液组中的健康昆明小鼠雌雄各半。

一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法
技术领域
本发明属于中药制剂质量控制的技术领域，特别涉及一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法。
背景技术
中药成分复杂、药理活性广泛，单一或少数指标性成分的含量测定和指纹图谱的定性鉴别，因没有与中药的药效建立直接的内在联系，难以全面反映其内在品质，难以有效地控制和评价中药的质量，更难以反映安全性和有效性。而生物活性测定以药物的生物效应为基础，直奔“有效性”的主题，从而达到控制药品质量的作用。
参芎葡萄糖注射液作为目前临床广泛用于治疗心脑血管疾病的一种有效制剂，现行质量标准过于简单，主要采用理化分析方法，对丹参素和盐酸川芎嗪进行含量测定，难以全面反映制剂的化学成分特征。随着我国药品生产质量控制水平的提高和对注射剂安全、疗效、质量可控等问题重视程度的不断深入，研究建立了UFLC法同时测定参芎葡萄糖注射液中6种主要成分以及指纹图谱测定方法，但与其有效性间的关系尚难确定。为进一步完善参芎 葡萄糖注射液质量控制方法，有必要对以生物活性测定并结合理化分析方法作为中药注射剂质量标准有效性指标进行深入应用研究，提高中药质量控制的准确性，整体性。
鉴于参芎葡萄糖注射液由丹参和盐酸川芎嗪配伍组成。其中丹参为临床用于治疗心绞痛及心肌梗死的传统中药，主要含有丹参素、丹参酮、原儿茶醛等活性成分，具有保护心肌内皮细胞、抗心肌缺血、抗心律失常、改善微循环、抗氧化等药理作用。川芎嗪为中药川芎中提取精制的有效成分，具有扩张冠状动脉，增加冠脉血流量，改善动脉微循环，抗血小板聚集，改善心肌供氧和明显的心肌保护作用。因此，选择经典的小鼠耐缺氧试验作为参芎葡萄糖注射液生物活性的评价模型，能够较好兼顾丹参和盐酸川芎嗪的生物活性，以达到综合评价和控制产品质量的目的。
发明内容
本发明针对现有技术所存在的诸多问题而提供一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法。
本发明针对参芎葡萄糖注射液现行质量标准过于简单，未与其药效建立内在联系，难以全面反映其内在品质的问题，首次提出对参芎葡萄糖注射液的生物活性进行测定，并作为其质量控制指标。以小鼠耐缺氧实验作为参芎葡萄糖注射液生物活性测定方法和限值剂量确定依据，对参芎葡萄糖注射液 生物活性进行测定。在实验中，选择具有活血化瘀功能的川芎嗪作为阳性药，并进行了重复性实验、精密度实验方法学验证，结果表明该法操作简便、指标明确、灵敏度高、重现性好，可用于表征参芎葡萄糖注射液质量生物活性信息，以达到综合评价和控制产品质量的目的。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方法如下：
一种参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法，其是健康昆明小鼠若干，随机分为正常对照组、盐酸异丙肾上腺素对照组和参芎葡萄糖注射液组，参芎葡萄糖注射液组健康昆明小鼠每天均自尾静脉注射给药一次，连续三天，给药量为以盐酸川芎嗪计，56mg/kg；正常对照组健康昆明小鼠注射与参芎葡萄糖注射液组给药量等体积的生理盐水；盐酸异丙肾上腺素对照组健康昆明小鼠在注射与参芎葡萄糖注射液组给药量等体积的生理盐水20min后，皮下注射15mg/kg盐酸异丙肾上腺素；正常对照组、盐酸异丙肾上腺素对照组和参芎葡萄糖注射液组注射15min后将各组置于装有5g钠石灰的125ml广口瓶中，瓶口用凡士林密封，封盖后，以秒表观察小鼠存活时间,将每组数据进行t检验，以如下公式(1)计算存活时间延长率；
            
盐酸异丙肾上腺素组存活时间与正常对照组比较有显著性差异则试验有效；在试验有效情况下，参芎葡萄糖注射液组存活时间与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著差异，则参芎葡萄糖注射液符合规定；结果判定盐酸异丙肾 上腺素组存活时间与正常组比较有显著性差异(p<0.05)则试验有效；参芎葡萄糖注射液组存活时间与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著差异(p<0.05)，则样品符合规定，显示其具有延长小鼠存活时间的作用。
在本发明的一个优选实施例中，所述正常对照组、盐酸异丙肾上腺素对照组和参芎葡萄糖注射液组中的健康昆明小鼠雌雄各半。
本研究根据参芎葡萄糖注射液的功能主治和药理作用，选择小鼠耐缺氧实验对其进行生物活性测定方法的研究，进一步完善其质量标准，以达到综合控制产品质量的目的。
具体实施方式
本发明参芎葡萄糖注射液的生物活性测定方法是经过大量的筛选试验得到的最佳方案，以下实验研究为本发明的优选过程：
一、材料
1、药品与试剂
参芎葡萄糖注射液(规格100ml：盐酸川芎嗪100mg，丹参相当于丹参素20mg，贵州景峰注射剂有限公司提供，批号20130979，20140307，20131104，20140418，20131125，20131211，20131008，20140132，20140198，20140254)，注射用盐酸川芎嗪(规格40mg，批号131005A2，哈尔滨三联药业有限公司)， 盐酸异丙肾上腺素注射液(规格2ml:1mg，批号131102，上海和丰制药有限公司)，钠石灰(规格500g，批号20131006，上海钠辉干燥试剂厂)。
2、动物
健康昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供，使用许可证号SCXK(黔)2012-001。
二、方法
1、小鼠常压耐缺氧实验
昆明小鼠，体重18-22g，雌雄各半，小鼠尾静脉注射给药，于末次注射后20min，皮下注射15mg/kg盐酸异丙肾上腺素，于注射后15min将小鼠置于装有5g钠石灰的125ml广口瓶中，瓶口用凡士林密封，封盖后，以秒表观察小鼠存活时间,将每组数据进行t检验，计算存活时间延长率。
            
2、统计方法
结果用均数±标准差表示，所有数据采用SPSS 13.0版软件进行t检验，P<0.05有统计学意义。
三、结果
1、小鼠常压耐缺氧模型的建立
取小鼠50只，雌雄各半，体重18-22g。随机分为5组，除对照组注射等体积的生理盐水外，其余各组小鼠分别按5、10、15、20mg/kg皮下注射盐酸 异丙肾上腺素，于注射后15min，测定小鼠存活时间，结果见表1。
表1 不同剂量的盐酸异丙肾上腺素注射液对小鼠存活时间的影响
注：与正常对照组比较，^＊p<0.05
表1结果表明，10、15、20mg/kg盐酸异丙肾上腺素均可显著降低小鼠的存活时间，而剂量为15mg/kg时，降低缺氧小鼠的存活时间既显著又不太严重，故选择剂量15mg/kg。
2、限值剂量研究
表2 不同剂量参芎葡萄糖注射液对小鼠存活时间的影响
                  
            
注：与正常组比较，^#p<0.01；与盐酸异丙肾上腺素组比较，^＊p<0.05
表2结果表明，参芎葡萄糖注射液(以盐酸川芎嗪计)剂量为28.0mg/kg、56.0mg/kg连续三次给药可明显延长小鼠的存活时间，与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著性差异(p<0.05)。为了增加可靠性和保证重复性，选用剂量56.0mg/kg(相当于人临床日用量的20倍)作为限值剂量，连续给药三天进行试验。
3、方法学验证
(1)重复性实验
取同一批号(20131125)参芎葡萄糖注射液，进行6次平行测定试验(56.0mg/kg，以川芎嗪计)，6次试验均可显著延长小鼠的存活时间，延长率在16.52％至21.64％之间，与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著性差异(p<0.05)，表明本方法重复性较好。
(2)精密度实验
同实验室不同实验人员采用56.0mg/kg(以川芎嗪计)的参芎葡萄糖注射液尾静脉注射给药连续三天后进行测定，使小鼠存活时间延长15.30％以上， 与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著性差异(p<0.05)，表明本方法精密度较好。
(3)方法适用性考察
表3 不同批次参芎葡萄糖注射液小鼠耐缺氧生物活性的测定
            
注：与盐酸异丙肾上腺素组比较，^＊p<0.05
对不同批号的10批参芎葡萄糖注射液进行测定，与盐酸异丙肾上腺素组比较有显著性差异(p<0.05)，使小鼠存活时间延长14.55％以上，不同批号产 品之间无显著性差异，表明本方法适用性较好，同时也说明产品不同批次间质量均一性较好。
研究结果表明，10批参芎葡萄糖注射液样品均显示出较好的生物活性，参芎葡萄糖注射液存活时间与模型组盐酸异丙肾上腺素比较有显著差异(p<0.05)。建议采用该法测定时结果为阳性(使小鼠存活时间延长14.55％以上，与模型组比较有统计学意义)可判断为合格。