二氨基双吲哚环壬酰亚胺在制备抗肿瘤药物中的应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200410009255.0

申请日:

2004.06.25

公开号:

CN1593402A

公开日:

2005.03.16

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K 31/407申请日:20040625授权公告日:20100414终止日期:20160625|||授权|||实质审查的生效|||公开

IPC分类号:

A61K31/407; A61P35/00

主分类号:

A61K31/407; A61P35/00

申请人:

刘树忠; 陈煜清; 赵新华

发明人:

刘树忠; 陈煜清; 赵新华

地址:

100021北京市朝阳区潘家园南里17号院2号楼706室

优先权:

专利代理机构:

北京君尚知识产权代理事务所

代理人:

周政

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内容摘要

本发明涉及二氨基双吲哚环壬酰亚胺的用途,特别是在制备抗肿瘤药物中的用途。本药二氨基双吲哚环壬酰亚胺安全无毒,可使癌细胞核固缩、核肿大、胞膜破碎,从而使癌组织大面积坏死;具有显著的免疫促进作用,加速免疫细胞(淋巴细胞、单核细胞)的分泌,并在肿瘤组织内大量聚集吞噬杀死癌细胞;此外,本药还能在肿瘤组织内外形成成纤维细胞包膜,阻止肿瘤细胞向周围组织、器官浸润。

权利要求书

1.  二氨基双吲哚环壬酰亚胺在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.
  二氨基双吲哚环壬酰亚胺在制备抗艾氏腹水癌、人卵巢癌肿瘤的药物中的应用。

说明书

二氨基双吲哚环壬酰亚胺在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及二氨基双吲哚环壬酰亚胺的用途,特别是在制备抗肿瘤药物中地用途。
背景技术
CN1364762A专利申请已经公开了化合物:6,8-二羰基-14,15-二氨基-5a(15a),8a(13b)-脱氢-吲哚并[2,3-C]氮杂环壬烷并[8,7-b]吲哚(二氨基双吲哚环壬酰亚胺),其分子式为:C20H17N5O2,分子结构式为:

目前尚无关于该化合物用途的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供二氨基双吲哚环壬酰亚胺的新用途,即在制备药物中的应用。
实际上,本发明涉及二氨基双吲哚环壬酰亚胺在制备抗肿瘤药物中的应用。
涉及二氨基双吲哚环壬酰亚胺在制备抗艾氏腹水癌、人卵巢癌肿瘤的药物中的应用。
一、二氨基双吲哚环壬酰亚胺的制备:
本化合物是由吲哚丙烯酸在多聚磷酸作用后,在固相为硅胶,用甲酸、乙酸乙酯、甲醇、氢氧化氨、乙腈、异丙醇、正丁醇、水等薄层层析过程中得到的,该方法包括以下步骤:
1.称取吲哚丙烯酸0.8克加入3.5毫升多聚磷酸在96-98℃搅拌20分钟后加入冷水30毫升,然后用350毫升乙酸乙酯混摇后分出乙酸乙酯溶液,减压浓缩;
2.将上面浓缩物用少量甲醇溶解后用固相为硅胶薄层层析过程中得到该化合物。
2.1用双向薄层层析:
第一向展开剂为甲酸0.4毫升,乙酸乙酯40毫升,甲醇10毫升,水8毫升;第二向展开剂为氢氧化氨11毫升,乙腈10毫升,异丙醇10毫升,正丁醇5毫升,乙酸乙酯15毫升,水1.2毫升,收集并浓缩Rf值0.8和0.95的甲醇洗脱液,减压浓缩;
2.2第二次薄层层析的展开剂为环己环35毫升,丙酮15毫升,甲酸0.4毫升,收集并浓缩Rf值0.22的甲醇洗脱液而得到所要的化合物,即二氨基双吲哚环壬酰亚胺。
用溶剂8%的吐温-80将二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶解,配制成2%的溶液。
二、动物急性毒性试验
昆明种小鼠,雄性,体重20-24g,以0.613g/kg剂量腹腔注射,注射后动物即出现静卧、闭眼,有呼吸困难症状。在其后的六个半小时内,呈现半昏迷状。给药9小时后逐渐恢复。至24小时动物完全恢复正常,一直很活跃,进食也正常。到给药4天后仍很好,处死动物,病理切片,显示各脏器组织结构正常。
三、二氨基双吲哚环壬酰亚胺的抗肿瘤作用
1.体外实验对三种人体癌细胞和三种小鼠癌细胞的杀伤作用
应用MTT法测定二氨基双吲哚环壬酰亚胺对卵巢癌(COC2n)、人早幼粒白血病(HL-60)、人喉癌(Hep2)细胞株及小鼠白血病(L-615)细胞、S180腹水癌细胞和小鼠肝癌腹水(AH22)细胞的细胞毒作用。结果表明二氨基双吲哚环壬酰亚胺对上述六种细胞均有杀伤作用,但敏感度不一样,其中以卵巢癌最敏感。加药保温24小时时其IC50依次为21μg/ml、31μg/ml、94μg/ml及31μg/ml、58μg/ml和76μg/ml。我们用了临床抗卵巢癌的化疗药物顺氨氯铂(CDDP)与二氨基双吲哚环壬酰亚胺比较,在相同实验条件下,对人卵巢癌细胞作用24小时及48小时的IC50,CDDP分别为13μg/ml和11μg/ml;而二氨基双吲哚环壬酰亚胺则分别为21μg/ml和13μg/ml,此结果显示了二氨基双吲哚环壬酰亚胺与CDDP对人卵巢癌细胞株的杀伤能力相近。
注:①该试验,二氨基双吲哚环壬酰亚胺的溶剂为甲醇。
②以单独癌细胞和癌细胞加与实验组同量的甲醇为对照。
2.体内实验
①二氨基双吲哚环壬酰亚胺对艾氏腹水癌(EAC)腹水型癌细胞的抑瘤作用
将EAC癌细胞(1×106/只)腹腔接种于昆明种小鼠体内。24小时后,实验组:小鼠10只,腹腔注入2%二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶液,用量400mg/kg/天,连续10天。对照组:小鼠10只,腹腔注入与实验组同量的8%吐温-80溶液,连续10天,第11天观察各组小鼠存活天数。实验结果:对照组平均存活天数为13.3±1.96,给药组平均存活天数为28.2±14.01,生命延长率为113%,显示二氨基双吲哚环壬酰亚胺对EAC腹水癌细胞有强的抑瘤作用。将实验组中存活58天的小鼠腹水涂片,镜下观察可见大量的富胞质的肿瘤细胞,表明二氨基双吲哚环壬酰亚胺具有降低肿瘤细胞恶性度的作用。
②二氨基双吲哚环壬酰亚胺对EAC移植性肿瘤的抑瘤作用
将EAC腹水细胞(1.2×106/只),对昆明小鼠腋下接种,24小时后;实验组:按腹腔注入2%二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶液用量不同即100mg/kg/天/只、200mg/kg/天/只及400mg/kg/天/只分成三个组(每组小鼠10只),连续注射7天。对照组:(小鼠10只)腹腔注入与实验组同量的8%吐温-80溶液,连续7天,第8天处死小鼠,分别取肿瘤组织称重计算抑瘤率。结果表明二氨基双吲哚环壬酰亚胺对EAC实体瘤的抑制率三个剂量分别为27.6%、38%、40%,P值分别小于0.01、0.001及0.01。另外,对对照组及三个实验组病理组织学观察,对照组与实验组有明显差别。在实验组可见肿瘤组织中出现肿瘤细胞核固缩、细胞凋亡、细胞坏死及坏死面积随二氨基双吲哚环壬酰亚胺的增加而增加。另外,肿瘤组织内出现大量淋巴细胞浸润、成纤维细胞在肿瘤组织内形成“包膜”。实验组三个剂量的小鼠其心、肝、脾、肺和肾的病理组织学观察均正常。
③二氨基双吲哚环壬酰亚胺对移植于裸鼠的人体卵巢癌转移瘤细胞(COC2n)的作用
(i)用人卵巢癌裸鼠转移植瘤细胞(1.5×107/只)。接种于裸鼠腋窝皮下,24小时后;实验组:按腹腔注入2%二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶液用量不同即100mg/kg/天/只、200mg/kg/天/只及400mg/kg/天/只,分成三个组(每组裸鼠8只),连续注射9天。对照组:(裸鼠8只)腹腔注入与实验组同量的溶剂8%吐温-80,连续9天,第10天处死小鼠,取肿瘤组织,分别作病理切片。确认移植于裸鼠生长的人卵巢癌为低分化腺癌,恶性度:III级。二氨基双吲哚环壬酰亚胺对移植于裸鼠生长的人卵巢癌的疗效以肿瘤组织切片中肿瘤组织(细胞)坏死程度分级评价。实验结果表明,实验组中按给药100mg/kg/天、200mg/kg/天及400mg/kg/天各组中组织坏死程度分别为+、++、+++,表明二氨基双吲哚环壬酰亚胺对人卵巢癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,且与二氨基双吲哚环壬酰亚胺的剂量(浓度)相关。另外,从病理组织学观察,在抗(实验)组中,肿瘤组织内除可见大片坏死区外,还可见肿瘤细胞核固缩、核肿大、破碎及成纤维细胞在肿瘤组织内、外形成“包膜”
(ii)实验阳性对照组:以人卵巢癌化疗药顺氨氯铂(CDDP),给药量为1mg/kg/天,实验方法步骤同实验组。结果,无论在肿瘤坏死程度、病理组织学观察结果都与抗组相同,但是顺氨氯铂(CDDP)无“包膜”形成。
3.在试验中,发现实验组中可见肿瘤细胞出现核固缩、细胞凋亡、细胞坏死及坏死面积随二氨基双吲哚环壬酰亚胺剂量的增加而增加。此外,肿瘤组织出现大量淋巴细胞浸润、成纤维细胞在肿瘤组织内形成“包膜”。
以上结果表明,本发明具有下述优点:
1.本发明发掘了化合物二氨基双吲哚环壬酰亚胺的抗肿瘤作用;
2.二氨基双吲哚环壬酰亚胺安全无毒;
3.二氨基双吲哚环壬酰亚胺可使癌细胞核固缩、核肿大、胞膜破碎,从而使癌组织大面积坏死;
4.二氨基双吲哚环壬酰亚胺具有显著的免疫促进作用,加速免疫细胞(淋巴细胞、单核细胞)的分泌,并在肿瘤组织内大量聚集吞噬杀死癌细胞;
5.二氨基双吲哚环壬酰亚胺在肿瘤组织内外形成成纤维细胞包膜,阻止肿瘤细胞向周围组织、器官浸润。
附图说明
图1为艾氏腹水癌对照组放大400倍照片;
图2为艾氏腹水癌用量400mg/kg/天放大400倍照片;
图3为艾氏腹水癌用量200mg/kg/天放大100倍照片;
图4为艾氏腹水癌用量400mg/kg/天放大200倍照片;
图5为移植于裸鼠的人体卵巢癌对照组放大400倍照片;
图6为移植于裸鼠的人体卵巢癌用量400mg/kg/天实验组放大400倍照片;
图7为移植于裸鼠的人体卵巢癌用量100mg/kg/天实验组放大40倍照片;
图8为移植于裸鼠的人体卵巢癌用量200mg/kg/天实验组放大40倍照片
图1、2、3和4反映了二氨基双吲哚环壬酰亚胺对艾氏腹水癌(EAC)小鼠移植性肿瘤的抑瘤作用,其中对照组:8%吐温-80溶液,用量为0.4ml/天/只;实验组:2%二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶液。从图中可知,在没有给二氨基双吲哚环壬酰亚胺的情况下,艾氏腹水癌细胞核浆比例倒置、核大、染色质密集,细胞大小不一(图1),而给药400mg/kg/天的实验组中,癌组织充斥坏死、核固缩、核破坏、细胞凋亡(图2),在给药200mg/kg/天的情况下,在坏死区内淋巴细胞浸润为主(图3),在给药400mg/kg/天的情况下,凋亡细胞、核固缩、坏死细胞增多,淋巴细胞浸润,在癌巢周围成纤维细胞多见且极向较一致(图4)。图5、6、7和8反映了二氨基双吲哚环壬酰亚胺对移植于裸鼠的人体卵巢癌转移瘤细胞(COC2n)的作用,对照组:8%吐温-80溶液,用量为0.4ml/天/只;实验组:2%二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶液。从图中可以看出,在没有给二氨基双吲哚环壬酰亚胺的情况下,COC2n瘤细胞大小不一,核大,分裂较多(图5);而给药400mg/kg/天的实验组中,瘤细胞大部分核固缩、死亡(图6);在给药100mg/kg/天的情况下,癌巢出现坏死,周围形成有一定走向的成纤维细胞“包膜”(图7);在给药200mg/kg/天的情况下,癌瘤组织大部分坏死,瘤组织边沿形成纤维细胞包膜(图8)。
具体实施方式
下面描述本发明的实施例,但本发明的内容不局限于此。
实施例1
以如下步骤制备二氨基双吲哚环壬酰亚胺:
1.取吲哚丙烯酸0.8克加入3.5毫升多聚磷酸在97℃搅拌20分钟后加入冷水30毫升,然后用350毫升乙酸乙酯混摇后分出乙酸乙酯溶液,减压浓缩;
2.将上面浓缩物用少量甲醇溶解后用固相为硅胶薄层层析过程中得到该化合物。
2.1用双向薄层层析:
第一向展开剂为甲酸0.4毫升,乙酸乙酯40毫升,甲醇10毫升,水8毫升;第二向展开剂为氢氧化氨11毫升,乙腈10毫升,乙丙醇10毫升,正丁醇5毫升,乙酸乙酯15毫升,水1.2毫升,收集并浓缩Rf值0.8和0.95的甲醇洗脱液,减压浓缩;
2.2第二次薄层层析的展开剂为环己环35毫升,丙酮15毫升,甲酸0.4毫升,收集并浓缩Rf值0.22的甲醇洗脱液而得到所要的化合物,即二氨基双吲哚环壬酰亚胺。
用溶剂8%吐温-80将二氨基双吲哚环壬酰亚胺溶解,配制成2%的溶液,分装成2ml/支的注射液。

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本发明涉及二氨基双吲哚环壬酰亚胺的用途,特别是在制备抗肿瘤药物中的用途。本药二氨基双吲哚环壬酰亚胺安全无毒,可使癌细胞核固缩、核肿大、胞膜破碎,从而使癌组织大面积坏死;具有显著的免疫促进作用,加速免疫细胞(淋巴细胞、单核细胞)的分泌,并在肿瘤组织内大量聚集吞噬杀死癌细胞;此外,本药还能在肿瘤组织内外形成成纤维细胞包膜,阻止肿瘤细胞向周围组织、器官浸润。 。

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