含有高含量半胱氨酸食物原料的制造方法 [技术领域]
本发明涉及一种制造含有高含量半胱氨酸的食物原料的方法，其特征在于，从含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母细胞中制备酵母提取物，通过控制温度在低至不高于60℃下浓缩提取物来制备固体浓度不少于10％的液体形式的食物原料，并将所得的食物原料保持在70至130℃。
[背景技术]
[专利文献1]国际公开WO00/30474
[专利文献2]日本专利No.2830415
[专利文献3]日本专利No.2903659
[专利文献4]国际公开号WO01/90310
半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸用于改善食物味道。在JP-A-10-136883中，公开了一种将食物浸在含有半胱氨酸和胱氨酸的电解质中以抑制食物颜色变成褐色的方法。根据该发明，公开了在还原电极中胱氨酸被还原成半胱氨酸，以及用半胱氨酸抑制通过由酶氧化作用产生的奎宁所产生的褐色染料。因此，像这样使用胱氨酸以抑制食物变色，通过还原作用生产半胱氨酸的烦杂操作是必须的。在日本专利号3246064中，公开了利用半胱氨酸制造鱼干的技术。根据该发明，有这样的描述，在从原料鱼制成鱼干过程中添加了含硫化合物制成的鱼干中，味道得到提高，味道变质被抑制，并且在半胱氨酸中单位重量的效力高于在胱氨酸中。在国际公开WO93/08274中，公开了通过还原动植物蛋白中含有的氧化型胱氨酸残基制备的半胱氨酸残基用于改善制面包生面团的技术。同样地，半胱氨酸相对于其氧化型的胱氨酸具有广泛的使用范围和较高地效力。
关于制造具有如此广泛应用的半胱氨酸的方法，通过分解蛋白质的方法、半合成方法等都是已知的，目前主要使用的方法是通过分解蛋白质的方法和半合成方法。然而，在使用半胱氨酸用于上述目的的情况下，强烈需要含有高含量半胱氨酸的食物原料，但是到目前为止几乎还未发现含有高含量半胱氨酸的食物原料。
最近，根据国际公开WO00/30474(专利文献1)而清楚可知：当含有γ-谷氨酰半胱氨酸(以下可被缩写成γ-GC)的食物原料在特定条件下进行酶处理或热处理时，产生了含有高含量半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸的食物原料。然而，在专利文献1中，虽然提到了源自γ-GC的半胱氨酸(在下文，可被称为Cys)和其氧化型的二硫化物胱氨酸的总生产率，但没有给出源自γ-GC的单独半胱氨酸的生产率。正如已经提到的，已经知道半胱氨酸相对于胱氨酸具有更广泛的应用和更高的效力，而且以效率高的方式生产半胱氨酸的方法在工业中是有用的。对于通过酶处理制造半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸来说，酶是必需的，并且这样的制造成本高于通过热处理制造半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸。
在这样的情况下，强烈需要一种通过热处理从γ-GC高效地制造半胱氨酸的改进方法。
除上面的专利文献1外，γ-GC的热处理过程也已经在日本专利No.2830415(专利文献2)、日本专利No.2903659(专利文献3)等等中公开了。专利文献2公开了如果将糖类加入γ-GC之中，并随后进行加热，就制备得到一种具有良好风味并且像烤肉味的风味组合物，专利文献3公开了将糖类加入含有一定含量的含硫化合物如谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物之中，并随后在没有脂肪存在的情况下进行加热，就制备得到一种具有烤肉风味的调味剂。然而，即使在那些专利文献2和3中，也没有公开从γ-GC高效率地制备半胱氨酸的这一发现。
[本发明要解决的问题]
在上面提到的关于现有技术的情况下，本发明的目的是提供从γ-GC高效率地生产半胱氨酸的方法，而且提供从酵母提取物制造含有高含量半胱氨酸食物原料的极好的方法。
[发明内容]
顺便提一下，专利文献1公开了当γ-GC被加热时，正如已经提到的，以高产量获得了总量半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸。
现在本发明的发明人通过实验已经证实加热γ-GC的反应是作为一种分子内反应(参见将在后面提到的实验实施例1)进行。因此，通过热分解从γ-GC释放的半胱氨酸和其氧化型的二硫化物的产量不依赖于γ-GC的浓度，而且因此没有必要浓缩含有γ-GC的水溶液。另一方面，在酵母提取物中含有的含硫化合物是丰富的，并且与γ-GC相互作用(参见将在后面提到的实验实施例2)。因此，当γ-GC在食物原料如含有含硫化合物的酵母提取物的溶液中进行热分解时，推测发生了以两个或更多分子反应为特征的分子间反应。因此，γ-GC在食物原料如酵母提取物的溶液中进行热分解的过程，显示出分子内反应和分子间反应竞争的反应机制。当分子内反应和分子间反应照此竞争时，分子间反应能够通过降低反应溶液中反应物的浓度而被抑制。另一方面，分子内反应本身不依赖底物的浓度，并且，即使反应溶液中反应物的浓度被降低，也并不会因而影响反应速度。因此，当反应溶液中反应物的浓度被降低时，分子间反应被抑制，结果分子内反应的效率相对增加。
肽的环化反应可以被列出来作为分子间反应和分子内反应照此竞争反应的例子。当合成环肽时，优先进行分子内环化(分子内反应)，因此，通过高度稀释或通过将反应物溶液滴入溶液，从而降低反应溶液中反应物的浓度来进行反应，并且高产量合成环肽。
在这样的理论背景下，在食物原料如酵母提取物的溶液中所进行的γ-GC热分解中，在食物原料溶液为低固体浓度的条件下所进行的反应有助于提高源自γ-GC的半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸的生产率。在专利文献1中，描述了如果在溶解含有4.5％γ-GC的酵母提取物粉末之后，使产生的水溶液中固体浓度为2％再进行热分解，就获得了含有半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸总量2％的酵母提取物粉末(参见该文献的实施例1)。在当时源自γ-GC的半胱氨酸和其氧化型的二硫化物胱氨酸的生产率不少于90％，显示出正如上述提到的理论一样的非常高的生产率。
与胱氨酸相比，半胱氨酸，如已经提到的，具有广泛的应用并且在应用中具有高效用，因此，有必要证实在那篇文献提到的条件下半胱氨酸的生产率(向半胱氨酸的转化率)。因此，本发明的发明人依照那篇文献的实施例1，将含有γ-GC的酵母提取物粉末制成含有2％固体浓度的水溶液，在相同条件下进行热处理，并测定向半胱氨酸的转化率(即，在热处理后的水溶液中半胱氨酸的摩尔数除以在热处理前水溶液中γ-GC的摩尔数所得的商)，因此从γ-GC到半胱氨酸的转化率约为40％。
为提高γ-GC到半胱氨酸的转化率，本发明的发明人已经进行了深入细致的研究，结果，他们已经发现当含有γ-GC的酵母提取物在浓缩的同时控制不高于60℃的低温，以产生含有不少于10％固体的浓缩物，然后通过保持温度高于上面提到的浓缩温度，在70至130℃下进行热处理，优选在还原糖的存在量不超过0.5％的水溶状态中，优选在酸性条件下或更优选在pH3.5到6条件下，从γ-GC到半胱氨酸的转化率能够被提高到70％，在这样发现的基础上，完成了本发明。这样的结果是预料不到的结果，不同于在γ-GC水溶液中由分子内反应和分子间反应竞争的分解反应中推测的结果。
因此，本发明涉及从含有γ-GC的酵母提取物中高效率地制造含有高含量半胱氨酸食物原料的方法，其包括这样的步骤：经处理酵母细胞制备的酵母提取物在控制到不高于60℃的低温下浓缩，产生固体浓度不少于10％的浓缩物，然后将浓缩物保持高于上述浓缩温度，保持在70至130℃(热处理)，优选70至100℃，或更优选75至100℃，优选在酸性条件下，或更优选在pH3.5到6.0，优选还原糖为低含量或，特别优选不超过1％，或更优选存在不超过0.5％的还原糖。
[附图说明]
[图1A]
这显示γ-GC的分解反应(浓度：10mM)(实验实施例1)。
[图1B]
这显示γ-GC的分解反应(生产Cys)(浓度：10mM)(实验实施例1)。
[图1C]
这显示γ-GC的分解反应(浓度：100mM)(实验实施例1)。
[图1D]
这显示γ-GC的分解反应(生产Cys)(浓度：100mM)(实验实施例1)。
[图2]
这显示γ-GC与氧化型含硫化合物相互作用的机制(实验实施例2)。
[图3]
这显示在GSSG共存和不存在的情况下Cys、γ-GC和GSH的加热反应(实验实施例2)。
[图4]
这显示存在糖时γ-GC的分解反应(Cys的转化率)(实验实施例5)。
[图5]
这显示溶解氧的浓度和γ-GC残留率之间的关系(实验实施例6)。
[图6A]
这显示γ-GC在DM中为3％时的分解反应(实验实施例7)。
[图6B]
这显示γ-GC在DM中为5％时的分解反应(实验实施例7)。
[图6C]
这显示γ-GC在DM中为8％时的分解反应(实验实施例7)。
[图6D]
这显示γ-GC在DM中为10％时的分解反应(实验实施例7)。
[图6E]
这显示γ-GC在DM中为20％时的分解反应(实验实施例7)。
[图6F]
这显示γ-GC在DM中为30％时的分解反应(实验实施例7)。
[具体实施方式]
现在将详细阐明本发明如下。
(1)首先，含有γ-GC的酵母可按如下获得。
只要它是含有γ-GC的酵母，对于本发明中使用的酵母没有特别限制。由于为了使原料含有高含量的Cys，从含有少于1％重量γ-GC的酵母中制备的食物原料闻起来有酵母气味，因此优选使用含有不少于1％重量γ-GC(每单位干细胞重量含有的γ-GC重量)的酵母。由于γ-GC定位在酵母细胞的可溶部分，并且酵母细胞的近1/3重量为可溶部分，因此酵母含有的γ-GC的最大重量(每单位干细胞重量含有的γ-GC重量)不可能多于30％。这样酵母的例子是在国际公开WO00/30474(已经提到的专利文献1)中提到的H4ΔGSH2菌株和在国际公开01/90310(已经提到的专利文献4)中提到的Nα2菌株和Nα3菌株。正如将在后面会提到的，在分解反应中γ-GC与酵母提取物中的具有SH基团的化合物相互作用，由此半胱氨酸的生产率降低，因此，优选使用细胞中谷胱甘肽含量低的酵母，优选在干酵母细胞中不多于0.5％、或更优选不多于0.1％或更优选使用由于细胞生长平衡而仅含有少量谷胱甘肽的菌株。这样菌株的例子是具有谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母，其在387位的甘氨酸残基突变为天冬氨酸残基；具有谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母，其在54位的脯氨酸残基突变为亮氨酸残基；和具有谷胱甘肽合成酶的酿酒酵母，其在370位有精氨酸残基和在其后缺失。
正如已提到的，只要它是含有γ-GC的酵母菌株，对于酵母菌株就没有特别限制，具体的例子是属于酵母属如酿酒酵母，裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母和假丝酵母属如产朊假丝酵母的酵母菌株。顺便提一下，在后面将要提到的实施例1中使用了利用在国际公开WO01/90310(已提到的专利文献4)中提到的方法所制备的二倍体酵母(酿酒酵母)N3菌株，其中谷胱甘肽合成酶的活性被削弱。
(2)接着将阐明从上述制备的酵母中制造酵母提取物的方法。
通过在优选的条件下培养种子酵母，上述制备的酵母的培养产物包含含有预测γ-GC量的酵母细胞。虽然有可能直接从培养产物中制造酵母提取物，当然酵母提取物也能够从曾经被从酵母培养产物中分离的含有γ-GC的酵母细胞制造。只要使用的条件不明显分解γ-GC或Cys，制造酵母提取物的方法就没有特别限制，可仅仅使用一般方法。一个例子是酵母细胞被保留在60至80℃的热水中，使得内容物被提取，提取后的残渣(细胞残渣)被除去。像这样用热水提取方法制造酵母提取物时，酵母提取物中固体浓度通常约为百分之几。用热水提取方法制造酵母提取物时，细胞残渣被除去，因此酵母提取物中含有的每单位固体中γ-GC的含量增加到几倍的程度。例如，用热水从含有1％重量γ-GC的酵母细胞中提取内容物时，酵母提取物中含有的每单位固体中γ-GC的含量增加到约4-8％重量。顺便提一下，虽然该提取的效率较低，但是在提取温度保持在不高于60℃时从酵母细胞或培养的酵母中制造酵母提取物的方法，也不被排除在本发明的实施方案之外。那样的话，它就直接继续下一步的浓缩步骤，因此，温度持续地保持在不高于60℃，直到作为提取物的酵母提取物中的固体浓度达到10％或更多。
(3)根据本发明的方法浓缩上面制备的酵母提取物的方法如下。
因此，由于如上面所述方法制造的酵母提取物的固体浓度通常低至百分之几，有必要在使γ-GC转化为Cys的热处理之前浓缩。虽然优选低温浓缩，但只要γ-GC和Cys不明显分解，浓缩的方法就没有特别限制。在高温条件下的浓缩是不优选的，因为γ-GC和Cys与酵母提取物中的含硫化合物相互作用，由此Cys的产量降低。
因此，在本发明中，酵母提取物在控制不高于60℃的低温下浓缩以制备固体浓度不少于10％的液体形式的食物原料。在低温下浓缩方法的具体例子是真空浓缩和冰冻浓缩。优选浓缩在几乎不含共存溶解氧下进行，例如不超过3ppm、优选不超过2ppm或更优选不超过1ppm。在溶解氧共存下浓缩是不优选的，因为Cys和γ-GC的SH基团被氧化，由此Cys的产量降低。按照在这样条件下进行的低温浓缩，在例如6到15小时内，酵母提取物中的固体浓度变为不少于10％。那样的话，例如也有可能酵母提取物成为固体，但是当成为固体时，在浓缩后，在随后的加热反应中，有必要用水或类似物将固体恢复成液体。因此，考虑到过程控制，优选在浓缩后酵母提取物为液体形式。
(4)接着将阐述如上面方法制备的液体形式的食物原料经受热处理以产生含有高含量半胱氨酸食物原料的方法。
浓缩后的酵母提取物的加热反应(热分解)优选在固体浓度不少于10％的液体形式的食物原料(水溶液)中进行。当热分解在固体浓度少于10％的水溶液中进行时，γ-GC的分解反应不会遵循一级反应进行，会发生不同于分解反应生成Cys的副反应，并且Cys的生产率降低，因此不是优选的。考虑到高效率地生产Cys，优选加热温度在70至130℃之间。当加热反应在低于70℃下进行时，从γ-GC到Cys的分解反应需要一些时间，在该期间，Cys和γ-GC的SH基团被溶解在溶液中的氧所氧化，因此不是优选的。另一方面，当分解反应在高于130℃下进行时，Cys和γ-GC的SH基团被氧化，从而降低了Cys的生产率，因此也不是优选的。按照在这样条件下进行的热处理，在例如30到120分钟内，食物原料成为含有高至2％固体浓度Cys的含有高含量Cys的食物原料。
(a)顺便提一下，在上述(4)中阐明的加热处理时，在液体状态的食物原料中还原糖的存在量如下；
优选在γ-GC热分解过程中不存在还原糖。具体地，如先前阐明的，优选不超过1％、更优选不超过0.5％。那是因为，当还原糖存在时，它会与γ-GC和Cys相互作用而被转化成不同于Cys的物质。由于还原糖的存在影响转化到Cys的转化率，因此如果有可能的话，优选不存在还原糖。能够从酵母培养产物中制备这种还原糖含量在上述范围内的食物原料，其中糖被酵母吸收以使酵母培养物中的残留糖尽可能少。当残留的糖量多时，不会由培养的酵母直接制备酵母提取物，而是从培养的酵母中分离酵母细胞，或者，如果必要的话，用水洗涤被分离的酵母细胞，等等，由此可制备酵母提取物。如果从γ-GC到Cys加热反应(热分解)的过程中存在还原糖，优选在还原糖的存在量不超过1％或者更优选不超过0.5％，并且在酸性条件下，当摩尔当量等被考虑在内时，优选在pH3.5到6的酸性条件下，进行从γ-GC到Cys的转化反应。
(b)加热反应过程中的pH如下。
如将在后面说明的实验实施例1中提到的，通过加热发生的γ-GC到Cys的转化步骤导致在γ-GC羰基的氧原子位点上发生质子化，结果那个位点是发生消除反应的起始点。因此，优选在酸性条件下进行。例如，可以是导致充分质子化的pH3.5到6。
[实施例]
现将通过以下实验实施例和实施例更详细地阐明本发明。
实验实施例1：证实从γ-GC中释放半胱氨酸的反应是分子内反应
当使用MOPAC(Cambridge Soft ChemOffice Ultra，CS MOPAC)对γ-GC进行结构优化计算时，预测到γ-GC的分子结构不是在发生普通的α-键的二肽中观察到的伸展结构，而是弯曲的结构，好像γ-谷氨酰基靠近半胱氨酸(Cys)的氨基(氨基键)。当计算γ-GC的极化电荷时，在γ-位上羰基的氧原子位点上有负电荷。因此，预测在酸性条件下，在γ-GC的这个位点易发生质子化，并且这个位点是发生消除反应的起始点，由此Cys被释放。从γ-GC这样的分子结构中，假定从γ-GC中释放Cys的反应(γ-GC到Cys的分解反应)是依照分子内反应进行的。
之后，为了证实从γ-GC释放Cys的反应是通过分子内反应而不是依赖于底物浓度进行，使用化学动力学的方法进行分析。制备含有γ-GC约10mM和约100mM的两种水溶液，每一种水溶液被加热到50℃，60℃，70℃和80℃，并且测定0到24小时后γ-GC的含量。从结果中计算分解速度常数，并绘制Arrhenius图。
结果显示于图1A至图1D。从结果中注意到加热温度越高，分解速率越高。那表明从γ-GC释放Cys的反应是不依赖底物浓度而是依温度进行的。
从上述结果中已证实从γ-GC释放Cys的反应是通过分子内反应发生的，而不依赖于γ-GC的底物浓度。
实验实施例2：γ-GC与氧化型含硫化合物的相互作用
在食物原料中，γ-GC与其它含硫化合物相互作用。因此，研究了在含有作为氧化型二硫化物的氧化型谷胱甘肽的溶液中γ-GC的分解反应。结果，据估计，在氧化型含硫化合物共存的食物原料中，由于γ-GC的高还原能力，还原了氧化型含硫化合物，然后进行含γ-GC化合物的分解反应。据推测，反应是根据后面将要提到的图2中所显示的反应机制进行的。
现在，研究了Cys，γ-GC和谷胱甘肽(以下可被缩写成GSH)的还原潜力，发现还原能力按Cys、γ-GC和GSH顺序增高。然后，制备加入或不加入10mM GSSG(氧化型谷胱甘肽)的含有10mMγ-GC的水溶液(pH5)，并加热到90℃以定期测定Cys、γ-GC和GSH的含量。
结果显示在图3(a)和图3(b)中。从结果中发现GSSG被γ-GC还原产生GSH，结果产生GS-γ-GC，没有高效率地发生从γ-GC释放Cys。因此，当γ-GC在含有氧化型SH的食物原料中进行热分解时，发生了依赖于其浓度的副反应，由此半胱氨酸的生产率降低。
实验实施例3：含γ-GC酵母提取物和酵母提取物粉末的制备
在下面实验实施例中使用的含γ-GC的酵母提取物粉末制备如下。
(a)含γ-GC酵母N3菌株的制备
通过常规方法从二倍体酿酒酵母野生型菌株制备单倍体Na菌株(MATa)。Na菌株和国际公开WO01/9310(已提到的专利文献4)中提到的单倍体酵母(酿酒酵母)Nα3菌株(MATα gsh2)缀合制得二倍体酵母。二倍体酵母根据常规方法进行孢子形成，制备具有与Nα3菌株相同的突变型谷胱甘肽合成酶基因的单倍体酵母Na3菌株(MATa gsh2)。Nα3菌株缀合到Na3菌株，从产生的二倍体中，在SD培养基中，筛选对数生长期过程中培养的具有同型突变型谷胱甘肽合成酶并且含有不少于1％重量γ-GC的二倍体酵母N3菌株。顺便提一下，也可以使用酿酒酵母FERM P-18546(国际保藏No.BP-8228)代替Nα3菌株制备。
此外，也可以使用二倍体菌株酿酒酵母AJ14861(国际保藏No.FERM BP-08553)代替酵母N3菌株。
(b)含γ-GC酵母细胞的制备
用发酵罐培养如上制备的N3菌株。使用YPD培养基，并且通过供给葡萄糖在30℃进行培养。收集培养产物，并冲洗以制备含γ-GC的酵母细胞。
(c)含γ-GC的酵母提取物和酵母提取物粉末的制备
将如上制备的含γ-GC的酵母细胞悬浮于水中，制成10g/dl浓度，在70℃加热10分钟提取内容物。通过离心分离方法分成酵母细胞残渣和内容物。通过冷冻干燥干燥分离的内容物(酵母提取物：固体浓度：1.7％)制备含量占DM(干物质)8％的含有γ-GC的酵母提取物粉末。
实验实施例4：存在糖(1)时的γ-GC的分解反应
在上述专利文献1和2中，公开了通过在酵母提取物中添加糖到γ-GC中并随之加热，制备一种具有良好烤牛肉风味的风味组合物。现在，测定该反应中Cys的生产率。
因此，制备一种含有30份重量的在实验实施例3中制备的酵母提取物粉末、30份重量的谷氨酸和3份重量的木糖(还原糖)比例的浓度为83％的水溶液(还原糖的存在量：3％)，并且在90℃进行加热处理35分钟。结果，没有产生Cys。据推测是由于产生的Cys与糖发生了相互作用。
实验实施例5：存在糖(2)时的γ-GC的分解反应
将实验实施例3中制备的酵母提取物粉末配制成pH4.5的30％的水溶液，平均分成十份，然后向每份中加入木糖或葡萄糖，使终浓度为0％、0.25％、0.5％、1％和3％。每份水溶液保持在90℃进行加热处理2小时。
结果显示在图4中。结果表明，在酸性条件下，在木糖的浓度是1％或更小时，能高效率地制备Cys。
实验实施例6：浓缩酵母提取物的条件(溶解氧的浓度)
将实验实施例3中制备的含γ-GC的酵母提取物粉末配制成3.4％的水溶液(pH4.5)，在50℃下加热10小时。通过水溶液中溶解的氧浓度来检测γ-GC的残余率(包括产生的Cys)。
结果显示于图5。结果表明，当溶解氧的浓度为1ppm(通过脱气和导入氮气进行控制)时，γ-GC保持在约90％的程度，而当溶解氧的浓度为6ppm时，其减少到约40％。由于6ppm是常压下氧溶解的浓度，真空条件中低温加热的效率也表明没有产生氧化型SH。
之后，在50到70℃范围内真空(120mmHg)加热实验实施例3(c)中制备的酵母细胞提取物(通过离心分离的方法从酵母细胞残渣中分离的内容物)，直到固体浓度达到60％。在浓缩过程中，定期测定酵母细胞提取物中γ-GC和半胱氨酸的含量。结果，γ-GC和半胱氨酸的总量保持在不少于85％。
实验实施例7：依赖于固体浓度的γ-GC分解反应的差别
在控制温度到50℃的真空中(120mmHg)浓缩实验实施例3(c)中制备的酵母细胞提取物(固体浓度：1.7％)，直到固体浓度为2％到6％(例如3％、5％、8％、10％、20％和30％)。每一水溶液通过加入盐酸调节pH至4.5，在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下加热，并定期测定水溶液中γ-GC的含量，由此动态分析γ-GC在每一浓度的分解反应。
结果显示于将在后面显示的图6A至6F。在每一个图中，(a)显示在一定固体浓度γ-GC的分解随时间的变化，(b)显示对应的Arrhenius图。从那些结果中注意到，当在固体浓度不少于10％进行加热处理时，γ-GC的分解反应以分子内反应优于分子间反应的方式进行，并且反应作为温度依赖型一级反应而进行。因此，它表明在含有氧化型SH的食物原料中，在不低于10％的浓度加热处理，对于抑制分子间反应和进行分子内反应以提高Cys的生产率是有效的。
实验实施例8：从γ-GC到Cys的生产率
在控制温度为50℃的真空中(120mmHg)浓缩实验实施例3(c)中制备的酵母细胞提取物(固体浓度：1.7％)，直到固体浓度为10％到60％(10％、20％、30％、40％、50％和60％)，然后加入盐酸调至pH4.5。每一水溶液在90℃加热，并定期测定Cys的生产率。结果是每一固体浓度中Cys的生产率(加热后水溶液中含有的Cys最大摩尔数除以浓缩前溶液中含有的γ-GC摩尔数所得的商)依次为72.5％、77.6％、78.7％、78.1％、77.5％和74％。
实验实施例9：从γ-GC到Cys的生产率
在控制温度为50℃的真空中(120mmHg)浓缩实验实施例3(c)中制备的酵母细胞提取物(固体浓度：1.7％)，直到固体浓度为10％到60％(10％、20％、30％、40％、50％和60％)，然后加入盐酸调至pH3.5或加入氢氧化钠调至pH6.0。每一水溶液在90℃加热，并定期测定Cys的生产率。结果是在pH3.5时，每一固体浓度中Cys的生产率依次为75.8％、79.3％、80.2％、80.1％、76.2％和75.2％。结果是在pH6.0时，每一固体浓度中Cys的生产率依次为71.8％、72.8％、75.8％、76.3％、74.2％和72.2％。
实验实施例10：使用AJ14861菌株的实验实施例
(a)含γ-GC酵母细胞的制备
AJ14861菌株分别接种在YPD培养基中，在30℃摇动培养。获得的培养物接种在含有0.4mg/dl泛酸钙的培养基A中，在30℃摇动培养。在对数生长期收集细胞并以120mg(干酵母重)/dl(培养基)的浓度接种在不含泛酸钙的培养基B中，并在30℃摇动培养一天。(每单位干酵母细胞中γ-GC的含量随时间而增加，在24小时时约为4％。)收集培养产物并冲洗以制得含γ-GC的酵母细胞。
下面举例说明不含泛酸钙的培养基B。成分浓度葡萄糖KH2PO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O尿素生物素肌醇维生素B6锌离子铁离子铜离子3g/dl0.15g/dl0.17g/dl0.03g/dl0.4g/dl1.5ppm100ppm0.05ppm0.3ppm0.3ppm0.05ppm
含有泛酸钙的培养基A是将0.4mg/dl泛酸钙加入到培养基B中。
(b)含γ-GC酵母提取物的制备
在水中悬浮如上制备的含γ-GC的酵母细胞，配制成10g/dl的浓度，70℃加热10分钟提取内容物。通过离心分离方法分离成酵母细胞残渣和内容物。分离的内容物(酵母提取物；固体浓度：2.2％)含有约占DM14％的γ-GC。
(c)从γ-GC到Cys的生产率
在控制温度为50℃的真空中(12mmHg)浓缩上面制备的酵母细胞提取物，直到固体浓度为30％，然后加入盐酸调至pH4.5。在90℃下加热水溶液，并定期测定Cys的生产率。Cys的生产率为82.1％。
实施例1：含有高含量半胱氨酸食物原料的制备
(a)含有高含量半胱氨酸的液体食物原料的制备
在水中悬浮通过实验实施例3中提到的方法制备的含γ-GC的酵母细胞，配制成10g/dl，在70℃下加热10分钟提取内容物。进行离心分离，分离成酵母细胞残渣和内容物。这样制得了10L含γ-GC的内容物(提取物中的固体浓度约为1.7％，固体中含有约8％的γ-GC)。在控制温度为50℃的真空中(120mmHg)浓缩内容物，约10小时后，固体浓度约为30％。加入盐酸调至pH4.5的浓缩物在90℃保持约1小时，以制备含有高含量半胱氨酸的液体食物原料。因此，制得含有占固体3.1％的Cys的食物原料。在那时，γ-GC到Cys的转化率约为80％。
(b)含有高含量半胱氨酸的粉末状食物原料的制备
冷冻干燥上面制备的含有高含量半胱氨酸的液体食物原料，产生占固体3.1％以粉末状形式存在的含有高含量半胱氨酸的食物原料。
[本发明的优点]
根据本发明，能够高效率地从γ-GC制备半胱氨酸，另外，能够容易地从酵母提取物中提供含有高含量半胱氨酸的食物原料。