一种细菌群体感应抑制剂及其抗菌应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种来源广泛的化合物法卡林二醇作为细菌群体感应抑制剂的抗菌应用。
背景技术
细菌的耐药性是世界性的难题。目前的抗菌剂的目的是杀死细菌或抑制细菌生长，在这种巨大的选择压力下，产生了耐药细菌的大量繁殖。因此，传统的抗生素不可能解决耐药性问题。
目前抗菌的另一种策略是抗毒力（anti-virulence）策略，即不以杀死或者抑制细菌的生长为目的和靶点，在不抑制细菌生长的情况下，直接抑制细菌毒力因子的表达，将细菌锁定在无毒力或者低毒力状态，丧失或者降低对于宿主的伤害能力。另一方面，由于不抑制细菌的生长，不易使细菌产生耐药性。细菌的毒力很大程度由细菌的信号系统——细菌群体感应来调控，抑制细菌群体感应，能降低细菌的毒力，减少细菌对于宿主细胞的伤害，并且不易产生耐药性。这种群体感应抑制剂可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。
具有群体感应（Quorum Sensing，QS）调节系统的细菌可以合成并释放一种被称为自诱导物（Auto Inducer，AI）的信号分子。随着细菌密度的增大及信号分子的浓度积累到达一定阈值，信号分子与胞浆受体蛋白结合形成活性调控复合物，调控细菌相关基因的表达，从而使细菌形成一种群体行为。临床病原菌中细菌群体感应调控蛋白同系物及自诱导物的发现使细菌群体感应现象受到了广泛的重视。
细菌信号分子主要分为四类：第一类是革兰氏阴性菌的由AHL介导的QS系统，其信号分子为酰化高丝氨酸内酯（N-aeylhomoserine lactones, AHLs）；第二类是革兰氏阳性菌的由自诱导肽（Autoinducing Peptide, AIP）介导的QS系统，其信号分子为氨基酸或短肽；第三类是革兰氏阴性菌和阳性菌中都存在的一类信号系统，其信号分子为呋喃硼酸二酯（AI-2）；第四类是细菌可利用宿主的跨界信号分子（如去甲肾上腺素和肾上腺素）。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的机会致病菌，其群体感应系统包括基于AHL信号分子的las系统和rhl系统外，还包括以2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮（PQS）为信号分子的假单胞喹诺酮信号系统（Nature, 2000, 406: 959-964）。铜绿假单胞菌多种致病毒力均受到群体感应调控。紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）群体感应信号分子属于高丝氨酸内酯类，其可以调控次生代谢产物紫色菌素等毒力因子的合成，因此，对细菌的感染能力具有重要的调控作用。其他动植物病原如弧菌、农杆菌都具有群体感应系统。
目前发现细菌群体感应调控病原菌的胞外蛋白酶（如弹性蛋白酶）、毒素（如绿脓菌素）、鼠李糖脂等多种致病因子的表达，并调控造成细菌耐药的生物被膜（biofilm）形成有关，并能调控病原菌的运动行为能力。通过抑制细菌的群体感应，也抑制这些细菌群体感应系统调控的毒力，降低细菌对于宿主的危害，达到预治或辅助抗生素治疗细菌感染的目的。因此细菌群体感应抑制剂是在防治细菌感染方面有广阔的应用前景。
法卡林二醇（falcarindiol）是一种在伞形科和五加科植物中广泛存在的聚炔化合物，目前已经在羌活、当归、白芷、海茴香及胡萝卜等中分离得到，并可人工合成，已经商品化。法卡林二醇的安全性较高，具有抗癌、抗炎、镇痛、抑制黑色素瘤生长、抗真菌、抗细菌的作用，但是对于这些活性的检测都不涉及到动物实验。
法卡林二醇对于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，法卡林二醇对于革兰氏阴性细菌分支杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等具有微弱的抑菌作用，但是由于法卡林二醇的最小抑菌浓度相对于目前传统的抗生素太低，因此没有作为抗菌剂的研究。
我们首次发现在不抑制细菌生长的浓度下，法卡林二醇可以抑制细菌群体感应，也有别于抑菌浓度（使用终浓度大于最小抑菌浓度MIC）的法卡林二醇的抑制细菌生长的抗菌应用，是一种新的抗菌应用。
发明内容
本发明所提供小分子化合物法卡林二醇（Falcarindiol，式I）的一种新活性和新用途。，在不抑制细菌生长的浓度下（亚抑菌浓度），对具有N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子，或者喹诺酮类信号分子，或者呋喃酰硼酸二酯类信号分子的细菌群体感应系统具有显著抑制，并且可抑制细菌群体感应调控的毒力因子的表达，降低细菌的毒力，用于防治具有群体感应系统的细菌感染。
![]()
（I），其中1-17为碳原子编号。
本发明中的法卡林二醇是天然提取物，也可以化学合成的化合物。
本发明中法卡林二醇单独制备成抗菌制剂或者与现有的抗菌剂制备成复合的抗菌制剂。
本发明中为了防治病原菌或有害菌产生耐药性，采用的法卡林二醇浓度是不抑制该细菌生长的浓度，抗菌制剂中采用法卡林二醇的有效剂量。
本发明中细菌群体感应抑制剂法卡林二醇的抗菌应用范围为人或动物的体内外微生物的感染的防治，或养殖水体的处理，或对于植物病原菌的防治。
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供细菌群体感应抑制剂法卡林二醇的抗菌新应用方式，法卡林二醇在伞形科及五加科植物中广泛存在，并且含量较高，也可人工合成或者直接购买。因此本发明具有制备原料易获得、化合物分离纯化简单易控、安全性高、使用浓度低和不易产生耐药性等优点。
具体实施方式：
实施例1：中药羌活中法卡林二醇纯化及鉴定
甲醇粗浸膏制备方法：将羌活根茎粉碎后称取10 g粉末，每2.5 g粉末用200 mL甲醇萃取，超声处理1 h后浸泡24 h；滤纸过滤得到浸出液，旋转蒸发仪蒸干滤出液并称重；用30 mL甲醇重新溶解后利用自制棉花滤器过滤除去不溶物；再次蒸干滤出液并称重。
化合物的制备方法：上述浸膏用适量硅胶H搅拌均匀后，用真空液相色谱柱层析进行分离，用不同配比的洗脱液石油醚，二氯甲烷，二氯甲烷:甲醇（100:1），二氯甲烷：甲醇（50:1），二氯甲烷：甲醇（20:1），甲醇分别冲柱，每个洗脱组分以3个柱体积进行洗脱。收集二氯甲烷：甲醇（50:1）洗脱的组分，浓缩后用Sephadex LH-20凝胶柱层析进行分离，100%甲醇为洗脱液进行分离， 利用硅胶板薄层层析TLC技术结合香草醛及通用显色剂进行染色，分析各流出组分，合并活性流份，利用制备型高效液相色谱仪以甲醇：水为70%流动相进行纯化，得到单体法卡林二醇。法卡林二醇和羌活提取物的TLC通用染色剂显色（商品化的法卡林二醇作为对照）确定收集的峰。通过上述方法获得的法卡林二醇的纯度经HPLC分析（商品化的法卡林二醇的保留时间作为对照）。
实验结果：以商品化的法卡林二醇为对照，经过分离纯化的组分在TLC显示单一染色点，并且位置与对照一致，HPLC分析单一峰，与对照保留时间相同，纯度达98%以上。
化合物结构鉴定：利用质谱(MS)、核磁（1HNMR，13C NMR，DEPT）对化合物进行结构鉴定，结合该化合物1H谱和13C谱分析。
实验结果：分子式为C17H24O2；1H NMR和13C NMR（DEPT）核磁谱所得数据与文献（Archives of Biochemistry and Biophysics, 2009,488: 34–41）比较，确定其为化合物：法卡林二醇。
化合物波谱数据：
1H NMR (CDCl3, 600 MHz) δ: 0.85 (3H, t-like, J = 6.8 Hz, 17-H), 1.24 (2H, m, 13, 14, 15, 16-H), 1.30 (2H, m, 12-H), 2.04 (2H, m,11-H), 5.08 (1H, dd, J = 7.7,5.4 Hz, 8-H), 4.83 (1H, dd, J =5.4, 5.4 Hz,3-H), 5.12 (1H, d, J = 10.3,1.7 Hz, 1-Htrans),5.30 (1H, d, J = 17.2,1.6 Hz, 1--Htrans), 5.40 (1H, m, 9-H),5.45 (1H, m, 10-H), 5.85 (1H, ddd, J =17.2, 10.3, 5.1 Hz, 2-H).
13C NMR (CDCl3, 150 MHz) δ：138.0(C-2), 132.3(C-10),130.0(C-9),116.0(C-1), ,82.0(C-4), 80.7(C-7), 69.0(C-5), 67.6(C-6), 62.2(C-3) ,57.5(C-8), 31.9(C-11),29.3(C-12),29.1(C-13), 29.1(C-14),27.5(C-15),22.7(C-16),14.5(C-17).
实施例2：法卡林二醇的抗紫色杆菌群体感应抑制活性测试
紫色杆菌筛选模型CV026成分及方法：19 mL 融化的固体 LB 培养基冷却至 40℃，加入 600 μL 过夜培养的紫色杆菌CV026菌液、15 μL 浓度为500 μmol/L 的信号分子己酰高丝氨酸内酯（C6-HSL）和 15 μL浓度为 30 mg/mL 的卡那霉素，混匀入培养皿中。待平板凝固后，用灭菌的打孔器打孔，每个孔内加 5 μL 化合物，于 30℃ 培养箱培养12h，观察加样孔周围细菌生长情况。若该化合物为群体感应抑制因子，则能抑制紫色菌素的产生，在琼脂板上表现出浑浊但不透明的圆圈；浑浊圈越大证明化合物活性越高。
实验结果：与阳性对照呋喃酮C30（6.5 μg）相比，6.5 μg、13 μg、26 μg及65 μg法卡林二醇均能抑制紫色杆菌紫色菌素的产量，并且随浓度增加而增加，无透明抑菌圈出现。
实施例3：法卡林二醇的抗铜绿假单胞菌的群体感应抑制活性测试
抑制铜绿假单胞菌AHL群体感应系统：
铜绿假单胞菌检测模型QSIS2成分及方法：17.5 mL 融化的固体 LB 培养基冷却至 40℃，加入2 mL浓度为 60%的蔗糖，250 μL 过夜培养的铜绿假单胞菌QSIS2菌液、8 μL 浓度为100 μmol/L 的信号分子3-氧十二烷酰高丝氨酸内酯（3-oxo-C12-HSL），200 μL 浓度为5%（w/v）的活菌染色剂红四氮唑（TTC）和 32 μL 浓度为50 mg/mL 的庆大霉素，混匀后倒入培养皿中。待平板凝固后，用灭菌的打孔器打孔，每个孔内分别加 5 μL不同浓度的化合物，置于 37℃ 培养箱培养，观察加样孔周围菌体生长情况。若化合物具有群体感应抑制活性，则加样孔周围出现红色的细菌生长圈，菌圈直径越大表示化合物抑制群体感应活性越强，
实验结果：与阳性对照C30（6.5 μg）相比，6.5 μg、13 μg、26 μg及65 μg法卡林二醇呈现阳性结果，且成浓度依赖性，并且无透明抑菌圈出现。
抑制假单胞菌喹诺酮信号系统（PQS）群体感应系统抑制活性检测：
PQS群体感应系统信号分子PQS的检测成分和方法：铜绿假单胞菌PAO1单克隆于新鲜5ml LB培养液中，摇床培养至对数生长期，用新鲜LB培养液将菌液1:100稀释, 分装4组，每组3个平行；每组分别加入终浓度为0、12.5μmol/L、25μmol/L和50μmol/L的法卡林二醇，向300μL的培养液上清中加入100μL酸化的乙酸乙酯，充分混匀，吸取有机相于1.5ml离心管中，至于37℃自然干燥；准备薄层板：取薄层板，用10%的KH2PO4溶液活化后置于烘箱中烘干1h，用展开剂进行预展实验后将薄层板继续烘干，以备点样用甲醇溶解后，取5μL点样于准备好的薄层板，彻底吹干，展开体系中进行薄层层析实验后置于UV下观察。
实验结果：铜绿假单胞菌PQS信号分子不但具有调控下游毒力基因表达的作用，而且可以直接对人体细胞产生毒害作用。利用TLC法对法卡林二醇抑制作用下信号分子的产量进行定性检测，加入12.5μmol/L即可抑制信号分子PQS的产生，在50μmol/L浓度下，PQS产量受到抑制作用比较明显，但是未造成抑菌生长现象。
实施例4：法卡林二醇的抗哈维氏弧菌(Vibirio harveyi)AI-2的群体感应抑制活性测试
哈氏弧菌AI-2群体感应筛选模型Vibirio harveyi BB170成分及方法：用AB培养液1:100稀释过夜培养的Vibirio harveyi BB170菌液，加入终浓度为100μg/mL的卡那霉素；将稀释的菌液分装于培养试管中，每管5mL，同时加入终浓度为0μg/mL、26μg/mL、65μg/mL和130μg/mL的法卡林二醇，30℃，140rpm培养18h；在黑暗环境中观察各培养液中菌体发光情况。该化合物在26μg/mL浓度下可以有效降低群体感应调控的发光行为；65μg/mL和130μg/mL浓度下，弧菌发光行为被有效抑制，但该浓度远低于最小抑菌浓度。
实施例5：亚抑菌浓度的法卡林二醇对病原菌毒力因子弹性蛋白酶活性测试
法卡林二醇对野生型铜绿假单胞菌PAOI生长的影响：
挑取野生型铜绿假单胞菌PAO1于新鲜LB培养液中，37℃、140rpm培养至对数期；用新鲜LB将培养至对数期的菌液稀释至OD600≈0.01, 分装5组，分别加入终浓度化合物终浓度0 μg/mL，65 μg/mL，130 μg/mL，260 μg/mL，520 μg/mL ，每组3个平行；37℃、140rpm摇床培养；每隔2小时测定各管OD600吸光值，共测定24h；以培养时间time（h）为横坐标，以600nm处的光吸光度为纵坐标，绘制野生型铜绿假单胞菌PAO1在法卡林二醇作用下的生长曲线。
实验结果：该化合物在0-520μg/mL浓度范围内并不抑制野生型铜绿假单胞菌PAO1的生长，OD600未下降。
亚抑菌浓度的法卡林二醇对病原菌毒力因子弹性蛋白酶活性测试：
挑取野生型铜绿假单胞菌PAO1单克隆接种于新鲜LB培养基中，37 ℃、140 rpm过夜培养；用新鲜LB培养液将菌液1:100稀释，分装于50 mL尖底培养管中，每管5 mL；同时每组分别加入终浓度为的0 μg/mL、6.5 μg/mL、13 μg/mL、26 μg/mL和52 μg/mL的法卡林二醇，每组3个平行；37 ℃，140 rpm培养12 h。
弹性蛋白酶活性测定方法：吸取1 mL培养液于1.5 mL Eppendorf管，4℃、12000 rpm离心15分钟后，吸取上清液，用一次性滤器（0.22 μm）过滤除菌；在2 mL振荡培养管中加入5 mg弹性蛋白酶底物——刚果红（EcR）和l mL反应缓冲液（0.1 M Tris-HCl；1mM CaC12，pH 7.2），加入0.2 mL细菌上清液，37℃、140 rpm振荡反应8小时；加入0.l mL的0.12 mol/L的EDTA终止反应，将反应物置于冰上。4 ℃、12000 rpm离心10 min，去除不可溶的ECR；吸取200 μL上清液在OD495 nm处读取吸光度值。
实验结果：6.5 μg/mL及26 μg/mL法卡林二醇分别对铜绿假单胞菌PAO1弹性蛋白酶产量降低40.5%和70.2% 。
实施例6：亚抑菌浓度的法卡林二醇对病原菌毒力因子绿脓菌素产量测试
挑取铜绿假单胞菌PAO1单克隆于新鲜5 mL的 LB培养液中，37 ℃，140 rpm过夜培养；用新鲜LB培养液将菌液1:100稀释，分装于50 mL尖底培养管中，每管5mL；同时每组分别加入终浓度为的0 μg/mL、6.5 μg/mL、13 μg/mL、26 μg/mL和52 μg/mL的法卡林二醇，每组3个平行；37 ℃，140rpm培养12h。
绿脓菌素定量方法：吸取1 mL培养液于1.5 mL Eppendorf管，以4℃、12000 rpm离心培养液15 min，轻柔吸取培养液上清；用氯仿以5:3的比例萃取培养液上清中绿脓菌素，利用涡旋混合器使萃取过程更彻底；将萃取混合液以12000 rpm离心2 min，有机相与水相彻底分离；吸取有机相并向其中以3:1的比例加入盐酸（0.2 N），37℃摇床孵育以使其充分反应；将混合液以12000 rpm离心2 min使有机相与水相彻底分离；吸取200 μL水相于520 nm处测定吸光值。
实验结果：法卡林二醇对绿脓菌素的产量具有明显的抑制作用，在6.5 μg/mL时抑制作用达到50%，而在26 μg/mL的浓度下抑制程度为70%。
实施例7：亚抑菌浓度的法卡林二醇对于细菌生物膜的抑制
挑取铜绿假单胞菌PAO1单克隆于新鲜5 mL的 LB培养液中，37 ℃，140 rpm过夜培养；用新鲜LB培养液将菌液1:100稀释，分成4组每组6个平行，分别加入不同终浓度法卡林二醇；37℃摇床培养2 h后分装于96孔板中，200ul/孔，置于37℃恒温培养箱静置培养12 h，24 h和36h；
用移液器缓慢吸出菌液后用250 μL PBS（pH7.2，0.01mM）洗涤2-3次彻底去除菌体并静置晾干；加入250 μL结晶紫（0.01%）染色15 min，再次用250 μL无菌的PBS轻轻洗涤2-3次出去浮色，静置晾干；加入200 μL冰乙酸（33%）溶解生物膜，在595nm测定光吸收值。
实验结果：法卡林二醇对于在上述浓度下生物被膜的形成有明显的抑制，其中在20uM浓度下抑制程度约为60%。
实施例8：亚抑菌浓度的法卡林二醇对于移植感染动物的抗感染应用
挑取铜绿假单胞菌PAOI，培养18-20h；3000rpm离心10min,收集菌体，用0.9%的NaCl将菌液稀释OD600=0.1；将剪好的5mm×5mm硅胶置于0.5%NaClO溶液中浸泡过夜，用无菌水润洗后，用无菌的0.9%的NaCl浸泡；每10个硅胶片放入20ml的菌液中；37℃，110rpm培养20h，使细菌附着在硅胶片上；取出硅胶片，在2ml无菌水中涡旋振荡1min,取液体稀释涂布在蓝色琼脂培养基中，选择在10-3浓度下，大约有50-300个单克隆的硅胶片建模。用手术刀在雌性昆明小鼠腹股沟处切开大约1cm的切口，将小硅胶片移入到腹膜内移植后，用灭菌的棉线，将伤口缝合。动物分组为：PAO1野生菌感染对照组（等量的乙醇-NaCl溶液），P呋喃酮C30阳性化合物治疗组（1.2μg/g），法卡林二醇治疗组（1.2μg/g），法卡林二醇（2.4μg/g），法卡林二醇（6μg/g），法卡林二醇（12μg/g）个10只，腹腔注射给药：每24h给一次。
实验结果：在感染初期，各组小鼠体重均减少4%—8%，经过3天后，除了C30阳性化合物治疗组，其余小鼠体重皆开始上升。到感染后期，PAO1野生菌感染对照组体重恢复到了实验前，C30阳性化合物治疗组体重低于实验前，其余法卡林二醇治疗组体重皆高于实验前，说明呋喃酮C30在小鼠体内有弱毒性。
取出移入体内的硅胶片，将硅胶片用无菌剪刀剪成相等的两部分（沿对角线剪），一部分用于观察其硅胶片上的生物被膜情况，另一部分用于统计硅胶片上的菌落数情况（菌落数情况方法同菌体准备中的方法）；并根据生物被膜的情况，计算出硅胶片上生物被膜的厚度及生物量。在感染4天时，阳性化合物C30的菌落数比PAOI感染组减少3倍，法卡林二醇在1.2μg/g—12μg/g范围内，硅胶片上的菌落数比PAOI感染组少2-6倍。在感染7天时，阳性化合物C30的菌落数比PAOI感染组少90倍，法卡林二醇最好的一组也达到硅胶片上的菌落数比PAOI感染组减少50-100倍。法卡林二醇在1.2μg/g—12μg/g范围内能够有效抑制硅胶片上生物量30-80%，比阳性化合物C30的抑制率高20%。
解剖小鼠，取其肝脏，法卡林二醇组无结晶出现，法卡林二醇能够使每克肝脏中的菌落数减少2-10倍。
取小鼠血液，小鼠血象显示PAOI野生菌感染对照组的小鼠白细胞数量较正常小鼠白细胞数量增加1.5倍，而法卡林二醇治疗组，在治疗初期使白细胞数目比正常组增加了2-4倍，显示了法卡林二醇不是通过抗炎活性达到治疗效果，而是通过减低病原菌毒力，使宿主能够识别了病原菌，诱导了宿主对于病原菌的清除。
实施例9：亚抑菌浓度的法卡林二醇对于烫伤感染动物的抗感染应用
挑取铜绿假单胞菌PAOI单克隆，培养过夜；按1%比例转接，将菌株培养至OD600=0.6，稀释100倍，取100μl涂布，此时接菌量为1.24×104。动物分组如实施例8。烫伤处理：脱毛前每只小鼠腹腔内注射1%戊巴比妥钠(5μl/g)；用剃须刀将其背部脱毛处理；三角铁在酒精灯下灼烧20秒后立即对已脱毛的小鼠背部烫伤5秒造成烫伤，造成III级烧伤（从表皮到皮下均遭到破坏）。同时每组随机取2只小鼠的烫伤皮肤进行组织切片鉴定烫伤级别。造模后皮下注射0.3mL生理盐水。取100μl菌液涂布，待菌液吸收后，涂布100μl待测化合物，对照组涂布0.9%生理盐水；待化合物倍吸收后，用三层无菌纱布包扎伤口，烫伤小鼠置室温25℃的环境中分笼饲养，自由进食水。每隔48h，换一次药物，重新包扎好伤口；
实验结果：从48h测定各组小鼠的死亡率；法卡林二醇治疗组能够使小鼠烫伤感染的死亡率减少10-50%，使小鼠每克肝脏的菌落数照感染组减少10-50%。感染组的小鼠胸腺、脾脏指数都照正常组小鼠减小50%，法卡林二醇组可使胸腺、脾脏指数都照正常组小鼠减小40%。法卡林二醇治疗组，能够使小鼠小鼠烫伤表面细菌毒力基因的表达量减少30-70%。
实施例10：亚抑菌浓度的法卡林二醇与现有抗菌剂联用治疗细菌感染
采用铜绿假单胞菌进行动物移植感染实验步骤如实施例8，但分组不同：PAOI野生菌感染对照组（等量的乙醇-NaCl溶液），法卡林二醇（2.4μg/g），庆大霉素组（0.2μg/g），法卡林二醇+庆大霉素组各10只，给药方式为腹腔注射：每24h给一次。在第4、7分别每组处死3只小鼠，分别取硅胶片做细菌学检查、生物被膜检测，眼球取血做血象分析。
实验结果：感染前、中期庆大霉素处理组约减少10倍和150倍硅胶片菌落，法卡林二醇与庆大霉素联用后则基本无法观察到菌落生长。小鼠血象指标定量测定：初期感染：法卡林二醇在初期感染中使白细胞数目照正常组增加了3倍，法卡林二醇与庆大霉素联用组白细胞数目也增加3倍左右，但是单用庆大霉素组白细胞数目为正常范围，说明庆大霉素直接抑制细菌生长，与细菌群体感应抑制剂法卡林二醇不同，没有上调白细胞的作用。而法卡林二醇的抗菌应用机理与庆大霉素不同，是一种新型的抗菌应用。