黄花杓兰种子制备与快速筛选方法.pdf

黄花杓兰(Cypripedium flavum)是中国特有的兰科花卉植物，具有极高的观赏和开发价值。黄花杓兰的种子细小，数量巨大，一个蒴果的种子量可达4万粒，利用种子进行无菌萌发是目前杓兰幼苗快繁的主要途径。种子的质量是杓兰幼苗规模化快繁成功的保障，由于自然状态下黄花杓兰自然结实率低(0.1－3％)，受植株生理状态和环境变化的影响，自然结实的种子质量难以稳定，不能保证种子无菌萌发的需要。本发明针对这一必须解决的技术问题，提供了一种黄花杓兰优质种子培育与快速筛选方法。该方法为实现工厂化快繁而设计，具有稳定获得充足生产所用，质量优良的种子，种子质量检测快速，节约生产成本的优点。

1、  黄花杓兰种子制备与快速筛选方法，其特征在于选择3年内未结实，植株粗壮，生长态势好的黄花杓兰开花植株，花开后第2-3天进行人工异花授粉，授粉120天后采收果实取出种子，浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗温育72小时，选取胚活力70％以上的种子作为幼苗快繁的材料。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于TTC溶液的配制采用先称量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常温下溶于蒸馏水，同时加入0.5ml的吐温-20，定容为100ml，配制成1％的TTC溶液，摇匀，避光保存。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子取出后，置于滤纸中间，折叠，将滤纸浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗温育72小时，然后将滤纸取出用清水冲洗约1分钟。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于种子胚活力＝胚红数/种子有胚率×100％。

5、  根据权利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于选择3年内未结实，植株粗壮，生长态势好的黄花杓兰开花植株，花开后第2-3天进行人工异花授粉，授粉120天后采收果实取出种子，置于滤纸中间，折叠，将滤纸浸入1％的TTC溶液中，TTC溶液的配制采用先称量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常温下溶于蒸馏水中，同时加入0.5ml的吐温-20，定容为100ml，配制成1％的TTC溶液，摇匀即可，种子在25℃黑暗温育72小时后，将滤纸取出用清水冲洗约1分钟，选取胚活力70％以上的种子作为幼苗快繁的材料，种子胚活力＝胚红数/种子有胚率×100％。

黄花杓兰种子制备与快速筛选方法。
技术领域：本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及植物黄花杓兰(Cypripedium flavum)种子的制备与快速筛选方法。
背景技术：杓兰属(Cypripedium)是兰科重要的观赏属之一，杓兰花色艳丽，花型奇特，其唇瓣呈拖鞋状，故有“拖鞋兰”之称，具有很高的观赏和开发价值。黄花杓兰(C.flavum)是中国特有的兰科花卉植物，是中国杓兰属花卉植物中唯一的黄花种类。黄花杓兰具有淡黄或金黄色的花朵，唇瓣内有紫色小斑点，花大，有幽香，观赏价值极高，深得欧美国家兰花爱好者的喜爱。在国际市场上，杓兰的一年生幼苗售价约5-30美元，成年开花植株为25-300美元。美丽奇特的观赏性状及不菲的市场价值导致了无节制的滥采滥挖，加上自身繁殖和生长缓慢的生理特性，杓兰属植物野生资源已近枯竭。近年来欧美国家通过种子萌发技术获得一些杓兰种类的实生苗，但生产主体多为业余爱好者，栽培和繁育的种苗有限，未形成规模化繁殖。这和优质种子制备技术、种子无菌萌发率低，萌发整齐度差等技术瓶颈尚未解决有直接的关系。目前杓兰幼苗繁育在国际上常采用野生植株的果实作为种子来源，由于受生长环境因素如传粉媒介、病虫害或植株生理状态等的影响以及常常遭受人为采集、放牧破环因素的影响，杓兰结实率及种子活力稳定性很差，有时可能结实率高，种子活力也好，但大多数时候是颗粒无收，根本不能保障获得规模化生产所需的高质量种子。
发明内容：本发明针对上述现有技术中存在的不足，针对种子制备的关键问题，提供了符合黄花杓兰幼苗规模化快繁需要的优质种子制备和筛选方法。该方法可获得生产幼苗所需的高质量的种子，同时对生产所用的种子质量进行早期检测和筛选，避免盲目生产造成的资源浪费，大大节约生产成本，具有重要的实际意义。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
黄花杓兰种子制备与快速筛选方法，选择3年内未结实，植株粗壮，生长态势好的黄花杓兰开花植株，花开后第2-3天进行人工异花授粉，授粉120天后采收果实取出种子，浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗温育72小时，选取胚活力70％以上的种子作为幼苗快繁的材料。
上述方法TTC溶液的配制采用先称量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常温下溶于蒸馏水中，同时加入0.5ml的吐温-20，定容为100ml，配制成1％的TTC溶液，摇匀，避光保存。
上述方法当种子取出后，置于滤纸中间，折叠，将滤纸浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗温育72小时，然后将滤纸取出用清水冲洗约1分钟。
所说的种子胚活力＝胚红数/种子有胚率×100％。
具体地，本发明的方法先选择3年内未结实，植株粗壮，生长态势好的黄花杓兰开花植株，花开后第2-3天进行人工异花授粉，授粉120天后采收果实取出种子，置于滤纸中间，折叠，将滤纸浸入1％的TTC溶液中，TTC溶液的配制采用先称量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常温下溶于蒸馏水中，同时加入0.5ml的吐温-20，定容为100ml，配制成1％的TTC溶液，摇匀即可，种子在25℃黑暗温育72小时后，将滤纸取出用清水冲洗约1分钟，选取胚活力70％以上的种子作为幼苗快繁的材料，种子胚活力的计算方法是胚红数/种子有胚率×100％。
附图说明：
图1为胚活力和萌发率的相关性示意图。
具体实施方式：为了更好地理解本发明，下面结合附图用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：
先选择3年内未结实，植株粗壮，生长态势好的黄花杓兰开花植株，花开后第2-3天进行人工异花授粉，授粉120天后采收果实取出种子，置于滤纸中间，折叠，将滤纸浸入1％的TTC溶液中，TTC溶液的配制采用先称量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常温下溶于蒸馏水中，同时加入0.5ml的吐温-20，定容为100ml，配制成1％的TTC溶液，摇匀即可，种子在25℃黑暗温育72小时后，将滤纸取出用清水冲洗约1分钟，选取胚活力70％以上的种子作为幼苗快繁的材料，种子胚活力的计算方法是胚红数/种子有胚率×100％。具体地，采用下述步骤和方法：
1、材料与方法
1.1优质种子制备
选择3年内未结实，植株粗壮，生长态势良好的黄花杓兰(Cypripedium flavum)开花植株，于开花后第2天分别进行人工自花授粉和人工异花授粉。授粉120天后采收果实(果实已完全成熟)，以蒴果体积、单果种子数量、种子有胚率、种子活力(TTC法)和进行无菌萌发获得的种子萌发率等衡量种子质量的优劣，并以此确定培育优质种子最佳的授粉方式。
授粉时间采用异花授粉方式于花开前3天，花开后1-3天，花开后4-6天，花开后7-9天，花开10天后五个时段进行人工授粉。授粉120天后采收果实(果实已完全成熟)，以蒴果体积、单果种子数量、种子有胚率、种子活力(TTC法)和进行无菌萌发获得的种子萌发率等等衡量种子质量的优劣，并以此确定培育优质种子最佳的授粉时间。
1.2优质种子快速筛选(TTC快速筛选法)
步骤一：TTC溶液的配制
称量1gTTC(triphenyltetrazolium chloride氯化三苯基四氮唑)，于常温下溶于蒸馏水中，同时加入0.5ml的吐温-20，定容为100ml，配制成1％的TTC溶液，摇匀，避光保存备用。
步骤二：种子胚活力测定
在需要测量种子活力的黄花杓兰蒴果中取出300粒左右地种子置于干净滤纸(3cm×3cm)中间，折叠成1cm²的方形纸块。将滤纸浸入1％的TTC溶液中，25℃黑暗温育72小时。将滤纸取出置于自来水中冲洗1分钟，展开滤纸后在解剖镜下统计种子胚变红情况：种子胚活力＝胚红数/种子有胚率×100％
步骤三：胚活力测定方法的验证
在经TTC法检测种子活力的黄花杓兰蒴果中随机选取25个，取出部分种子无菌播种于培养基表面(方法另文报道)，经3个月的培养后统计种子萌发率，种子萌发率＝萌发数/种子有胚率×100％，其结果和TTC法检测的种子活力进行对比。以此验证TTC快速筛选法的可行性。
2、结果与讨论：
2.1授粉方式对黄花杓兰种子质量的影响
在黄花杓兰花开后第2天分别进行人工自花授粉和人工异花授粉，并将结果和自然结实的统计数据进行对比。实验结果表明，人工授粉结实率达100％，显著高于自然授粉率(2.0％)；自花授粉方式在结实率、蒴果体积、单果种子数和有胚率等项指标上与异花授粉方式所得结果基本相同，但种子胚活力则远低于异花授粉方式；自然结实的结实率和种子活力等指标最低(见表一)。种子胚活力和萌发率是种子质量中很重要的指标，因此，人工异花授粉方式优于人工自花授粉方式。
表一：授粉方式对黄花杓兰种子质量的影响