新化合物 【发明领域】
本发明涉及在哺乳动物中治疗其中发生不适宜的、过度或不需要的血管生成和/或其中出现过度的Tie2受体活性的疾病。
【发明背景】
慢性增殖性疾病经常伴随发生极度的血管生成，这种血管生成能够促进或维持炎性和/或增殖状态，或者它可导致通过血管侵袭增殖造成的组织破坏。(Folkman，EXS 79：1-8，1997；Folkman，NatureMedicine 1：27-31，1995；Folkman和Shing，J.Biol.Chem.267：10931，1992)。
血管生成一般用于描述新的或替代血管的发生或新生血管形成。它是必要和生理的正常过程，通过该过程得以在胚胎中建立脉管结构。通常，在除排卵、月经和伤口愈合部位以外的大多数正常成人组织中，血管生成并不发生。然而，许多疾病的特征在于持续的和不受控制的血管生成。例如，在关节炎中，新的毛细血管侵袭关节并破坏软骨(Colville-Nash和Scott，Ann.Rheum.Dis.，51，919，1992)。在糖尿病(和在许多不同的眼疾)中，新生血管侵袭视网膜黄斑或视网膜或其它的眼结构，并可引起视觉缺失(Brooks等，Cell，79，1157，1994)。动脉粥样硬化的过程与血管生成有联系(Kahlon等，Can.J.Cardiol.8，60，1992)。已发现肿瘤生长和转移是依赖血管生成的(Folkman，Cancer Biol，3，65，1992；Denekamp，Br.J.Rad.66：181，1993；Fidler和Ellis，Cell，79，185，1994)。
为鉴定和开发血管生成抑制剂，通过研究已完成血管生成在主要疾病中参与地认识。这些抑制剂通常根据对如下血管生成级联中分开的靶的应答分类：例如内皮细胞经血管生成信号活化、裂解酶的合成和释放、内皮细胞迁移、内皮细胞增殖和毛细血管形成。因此，血管生成发生在多个阶段，发现和开发在多个这样的阶段起阻断血管生成作用的化合物的尝试正在进行中。
有出版物描述了血管生成抑制剂，它们通过不同的机制发挥作用，在以下疾病中是有益的，包括：例如癌症和肿瘤转移(O’Reilly等，Cell，79，315，1994 Ingber等，Nature，348：555，1990)、眼部疾病(Friedlander等，Science，270，1500，1995)、关节炎(Peacock等，Exp.Med.175，1135，1992；Peacock等，Cell.Immun.160，178，1995)和血管瘤(Taraboletti等，J.Natl.Cancer Inst.87：293，1995)。
血管生成信号产生于特异性配体与其受体的相互作用。Tie1和Tie2受体为单跨膜酪氨酸激酶受体(Tie代表具有免疫球蛋白(immunoglobulin)和EGF同源区的酪氨酸激酶受体(Tyrosine kinasereceptors))。最近，这两种受体被克隆且由几个小组给予了报道(Dumont等，Oncogene 8：1293-1301，1993；Partanen等，Mol.Cell Biol.12：1698-1707，1992；Sato等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9355-9358，1993)。
基于Tie2受体在血管生成中的重要性，预期抑制Tie2激酶活性可中断血管生成，提供对疾病的特异性治疗作用。最近，Lin等(J.Clin.Invest.100：2072-2078，1997)已表明外原性给予可溶解的Tie2受体可抑制动物模型中的血管生成和肿瘤生长。因此期待通过其它方法，例如抑制Tie2受体激酶活性抑制Tie2受体在涉及血管生成的增殖性疾病中具有治疗益处。
本申请描述新的发现，即特殊结构的化合物能够抑制Tie2受体的激酶活性，阻断其信号传导，因此可通过抑制血管生成的信号有效用于增殖性疾病。
发明概述
本发明涉及新的式(I)化合物和包含式(I)化合物和药学上可接受的稀释剂或载体的药用组合物。
本发明的另一方面为式(I)化合物作为Tie2受体激酶抑制剂的用途。Tie2受体激酶抑制剂在需要它们的哺乳动物中可用于抑制血管生成、慢性炎性或增殖性或血管生成疾病或紊乱的治疗(包括预防)，这些疾病通过过度的或不适宜的血管生成引发。
新的式(I)化合物或其药学上可接受的盐由下面的结构表示：
其中
V为CH或N；
Ar为萘-2-基、萘-1-基、二环或三环杂芳环，其中环可任选被取代；
Y为NR10R11、NR10C(Z)NR10R11、NR10C(Z)NR10C(Z)OR11、NR10COOR11或NR10SO2R11；
n为0、1、2、3或4；
X为O、CH2、S或NH；
Z为氧或硫；
R1独立为氢、X-R4、卤素、羟基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷基亚硫酰基、CH2OR5、氨基、一或二-C1-6烷基氨基、N(R6)C(O)R7、N(R6)S(O)2R8、或任选包含另一个选自O、S和NR9的杂原子的5-7元N-杂环基环；
R2和R3独立表示任选取代的C1-6烷基，或R2和R3与它们连接的碳原子一起形成任选取代的C3-7环烷基或C5-7环烯基环，或R2和R3与它们连接的碳原子一起形成包含最多可达3个选自N、O和S的杂原子的任选取代的5-7元杂环基环；
R4独立为C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基部分，且其中这些部分中的任一部分可任选被取代；
R5为氢、C(Z)R12或任选取代的C1-6烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基C1-6烷基或S(O)2R8；
R6为氢或C1-6烷基；
R7为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基、杂芳基C1-6烷基、杂环基或杂环基C1-6烷基；
R8为C1-6烷基、C3-7环烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基、杂芳基C1-6烷基、杂环基或杂环基C1-6烷基；
R9为氢、C1-4烷基、C3-7环烷基或芳基；
R10和R12独立选自氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、杂芳基和杂芳基C1-6烷基，其中任何一个可任选被取代；和
R11为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基，其中任一个可任选被取代；或R10和R11与氮一起可形成任选包含另一个选自O、S或NR9的杂原子的5-7元环。
发明详述
本发明涉及能够抑制Tie2激酶的新化合物，以及这些化合物在需要此种治疗的哺乳动物中治疗慢性炎性疾病或增殖性疾病或血管生成的疾病中抑制血管生成的用途，所述疾病由过度的或不合适的血管生成引起。
在式(I)化合物中，V适宜为CH或N，优选为碳。
吡啶或嘧啶环适宜独立由R1任选独立取代一至两次。
R1适宜独立为氢、X-R4、卤素、羟基、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C1-6烷基亚硫酰基、CH2OR5、氨基、一或二-C1-6烷基氨基、N(R6)C(O)R7、N(R6)S(O)2R8、或其中任选包含另一个选自O、S和NR9的杂原子的5-7元N-杂环基环。吡啶基或嘧啶优选在2-位被取代。R1优选为氢或X-R4。
X适宜为O、CH2、S或NH。X优选为氧或氮。
R4独立为C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基部分，且其中这些部分中的任一部分可任选被取代。R4优选为任选取代的烷基、芳基或芳基烷基。
当R4为芳基时，它优选为任选取代的苯基。当R4为芳基烷基时，它优选为任选取代的苄基或苯乙基。
这些R4部分可独立由以下基团任选取代一或多次，优选取代1-3次，包括：卤素、C1-4烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基，卤代烷基例如CF3，羟基，羟基取代的C1-4烷基，C1-4烷氧基例如甲氧基或乙氧基，S(O)m烷基和S(O)m芳基(其中m为0、1或2)，C(O)OR11例如C(O)C1-6烷基或C(O)OH部分C(O)R11，OC(O)R8，O-(CH2)s-O-，如在缩酮或二氧基亚烷基桥(s为具有值1-5的数字)、氨基、一-和二-C1-6烷基取代的氨基、N(R10)C(O)R7、C(O)NR10R11、氰基、硝基或具有5-7元环且任选包含另一个选自氧、硫或NR9的杂原子的N-杂环基环、任选取代的芳基例如苯基、任选取代的芳基烷基例如苄基或苯乙基、芳氧基例如苯氧基，或芳基烷氧基例如苄氧基；这些芳基和芳基烷基部分可用卤素、烷基、烷氧基、S(O)m烷基、氨基或一-和二-C1-6烷基取代的氨基取代。
优选R4部分由氨基、一-或二-C1-6烷基取代的氨基或具有5-7元环且任选包含另一个选自氧、硫或NR9的杂原子的N-杂环基环取代。
R2和R3适宜独立表示任选取代的C1-6烷基，或R2和R3与它们连接的碳原子一起形成任选取代的C3-7环烷基或C5-7环烯基环，或R2和R3与它们连接的碳原子一起形成包含最多可达3个选自N、O和S的杂原子的任选取代的5-7元杂环基环。R2和R3优选独立表示任选取代的C1-6烷基。
n适宜为0、1、2、3或4。n优选为1。
Y适宜为NR10R11、NR10C(Z)NR10R11、NR10C(Z)NR10C(Z)OR11、NR10COOR11或NR10SO2R11。
R11适宜为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基，其中任一个可任选被取代；或R10和R11与它们连接的氮一起形成任选包含另一个选自O、S或NR9的杂原子的5-7元杂环基环。
当R11如在说明书中定义被任选取代时，它优选为未取代或取代的烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基。烷基如果被取代，则优选由以下基团取代一或多次，包括：卤素例如CF3、CH2CF3、(CH2)2Cl，或(CH2)3Cl，或由C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基亚硫酰基或C1-6烷基磺酰基取代；如果R11为C3-7环烷基C1-6烷基，它优选为5或6元环，例如环己基甲基；如果R11为杂环基C1-6烷基，它优选为吗啉基C1-6烷基、或哌啶C1-6烷基；或者如果是杂芳基C1-6烷基部分，则优选为任选取代的异噁唑基。
R10和R12适宜独立选自氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C3-7环烷基C1-6烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基，杂芳基或杂芳基C1-6烷基，其中任一个可任选被取代。R10基团和R12部分可如在烷基术语中定义那样被任选取代。
R5适宜为氢、C(Z)R12或任选取代的C1-6烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基C1-6烷基或S(O)2R8。
R6适宜为氢或C1-6烷基。
R7适宜为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基、杂芳基C1-6烷基、杂环基或杂环基C1-6烷基。
R8适宜为C1-6烷基、C3-7环烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基、杂芳基C1-6烷基、杂环基或杂环基C1-6烷基。
R9适宜为氢、C1-4烷基、C3-7环烷基或芳基。
R10和R12适宜独立选自氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、杂环基、杂环基C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、杂芳基或杂芳基C1-6烷基，其中任一个可任选被取代。
Z适宜为氧或硫。
Ar适宜为萘-2-基、萘-1-基、二环或三环杂芳环，所述环可在任何环上任选被取代。二环或三环杂芳环系统为可包含碳环的稠合环系。这样环系的实例包括喹啉、异喹啉、苯并咪唑、苯并噻吩或苯并呋喃、苯并噁唑、苯并噻唑、二苯并呋喃、二苯并噻吩、苯并噻二唑、苯并三唑或吲哚基。
Ar环可独立在任何环上任选被取代一或多次，优选1-3次。适宜的取代基包括卤素、C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、环烷基、环烷基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、卤代C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基、(CR13R14)tOR12、硝基、氰基、(CR13R14)tNR10R11、(CR13R14)tNR10C(Z)R12、(CR13R14)tC(Z)NR10R11、(CR13R14)tCOR12、(CR13R14)tZC(Z)R12、(CR13R14)tC(Z)OR12、(CR13R14)tC(O)NR10R11、(CR13R14)tNR10C(Z)NR10R11、(CR13R14)tNR10C(＝NH)NR10R11、(CR13R14)tC(＝NH)-NR10R11、(CR13R14)tNR10S(O)2R8、(CR13R14)tS(O)2NR10R11、(CR13R14)tS(O)mR12、杂环基、杂芳基、杂环基C1-6烷基或杂芳基C1-6烷基。
t适宜为0或具有值1-10的整数。t优选为0或1，更优选为0。
R13和R14适宜独立为氢或C1-6烷基。
Ar优选由以下基团取代一或多次，包括：卤代基、氰基、(CR13R14)tC(Z)NR10R11、(CR13R14)tC(Z)OR12、(CR13R14)tCOR12、(CR13R14)tS(O)mR12、(CR13R14)tOR12、卤代C1-6烷基、C1-6烷基、(CR13R14)tNR10C(Z)R12、(CR13R14)tNR10S(O)2R8、(CR13R14)tS(O)2NR10R11、(CR13R14)tZC(Z)R12或(CR13R14)tNR10R11。
Ar环优选由以下基团取代一或多次，包括：卤代基、羟基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基和C1-6烷氧基。更优选取代基为C1-6烷氧基例如甲氧基、C1-6烷基例如甲基，或卤素例如氟或氯。
Ar环优选为萘环，更优选为萘-2-基环。如果Ar为二环杂芳环，则它优选为苯并噻吩或苯并呋喃环。对萘-2-基环优选环取代位置为6-位。
在此使用的术语“烷基”和“链烯基”各自或作为更大基团例如“烷氧基”的部分时，可为包含最多可达6个碳原子的直形或分支链基团，除非另外限定，包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基等。如在此定义那样，烷基和链烯基可任选被取代。
在此使用的“环烷基”包括具有3-8个环碳原子的环状基团，包括(但不限于)环丙基、环戊基、环己基等。如在此定义那样，环烷基可任选被取代。
在此使用的“环烯基”包括具有至少一个键的环状基团，优选5-8个碳，包括(但不限于)环戊烯基、环己烯基等。如在此定义那样，环烯基可任选被取代。
在此使用的术语“芳基”(在其本身或其任何组合上，例如“芳烷基”或“芳氧基”)包括单环或稠合环系，每环适宜包含4-7个，优选5或6个环原子，这些环每一个可为未取代的或独立由例如最多可达三个取代基取代。稠合环系可包括脂环，例如饱和或部分饱和的环，且需要时仅包括一个芳环。适宜的芳基包括苯基和萘基例如1-萘基或2-萘基。除非另外指明，如在此定义那样，芳环可任选被取代。
除非另外指明，在此使用的术语“杂环基”(在其本身或其任何组合上，例如“杂环基烷基”或“杂环基氧基”)适宜包括非芳族的、单环和稠合环，每个环适宜包含最多可达4个杂原子，每个杂原子独立选自O、N和S，且这些环可为未取代的或独立由例如最多可达三个取代基取代。每个杂环适宜具有4-7个，优选5或6个环原子。稠合杂环系统可包括碳环且需要时仅包括一个杂环。杂环基的实例包括吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、咪唑烷和吡唑烷。除非另外指明，如在此定义那样，杂环基和杂环可任选被取代。
当在此使用时，除非另外定义，术语“杂芳基”(在其本身或其任何组合上，例如“杂芳氧基”或“杂芳基烷基”)适宜包括包含最多可达4个，优选1或2个独立选自O、N和S的杂原子的一-和二环杂芳环系。每环可具有4-7个，优选5或6个环原子。二环杂芳环系可包括碳环。杂芳基的实例包括吡咯、喹啉、异喹啉、吡啶、嘧啶、噁唑、噻唑、噻二唑、三唑、咪唑、苯并咪唑、异噁唑、噻吩、苯并噻吩、呋喃和苯并呋喃。除非另外指明，如在此定义那样，杂芳环可任选被取代。
适宜地，当在此使用术语“任选被取代”时，除非另外定义，例如在烷基、链烯基、环烷基、环烯基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环烷基、杂芳基和杂芳基烷基上，应指基团可任选取代一或多次，优选由1-3个取代基取代，每一个独立选自卤素、C1-6烷基、芳基、芳基C1-6烷基、环烷基、环烷基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、卤代C1-6烷基、芳基C1-6烷氧基、(CR13R14)tOR12、硝基、氰基、(CR13R14)tNR10R11、(CR13R14)tNR10C(Z)R12、(CR13R14)tC(Z)NR10R11、(CR13R14)tCOR12、(CR13R14)tZC(Z)R12、(CR13R14)tC(Z)OR12、(CR13R14)tC(O)NR10R11、(CR13R14)tNR10C(Z)NR10R11、(CR13R14)tNR10C(＝NH)NR10R11、(CR13R14)tC(＝NH)-NR10R11、(CR13R14)tNR10S(O)2R8、(CR13R14)tS(O)2NR10R11、S(O)mR12、杂环基、杂芳基、杂环基C1-6烷基或杂芳基C1-6烷基。另外，两个相邻的环碳原子可连接形成二环系。
根据本发明的具体化合物包括那些在实施例中提及的化合物及其药学上可接受的盐。
应该意识到，用于药物的式(I)化合物的盐应为药学上可接受的。适宜的药学上可接受的盐应对本领域技术人员是显而易见的且包括那些在J.Pharm.Sci.，1977，66，1-19中描述的盐，例如与以下无机酸形成的酸加成盐，包括：例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸；和与有机酸形成的酸加成盐，包括：例如琥珀酸、马来酸、乙酸、富马酸、枸橼酸、酒石酸、苯甲酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸或萘磺酸。其它的盐例如草酸盐可在例如式(I)化合物的分离中使用，且包括在本发明范围内。
本发明化合物可以结晶或非结晶形式存在，如果结晶，可任选为水合物或溶剂合物。本发明在其范围内包括化学计量的水合物以及包含不同量的水的化合物。
本发明拓展至包括式(I)化合物的立体异构体和几何异构体在内的所有的异构体形式，包括对映体和其混合物例如外消旋体。通过常规方法，可将一种不同的异构体形式与其它异构体形式分离或拆分，或通过常规合成方法或通过立体特异性或不对称合成可得到任何所给定的异构体。
因为式(I)化合物打算用于药用组合物，容易理解它们的每一个优选以基本上纯的形式提供，例如至少60％纯度，更适宜至少75％纯度且优选至少85％，特别是至少98％纯度(％为基于重量计的重量)。不纯化合物的制备可用于制备在药用组合物中使用的更纯的形式。
式(I)化合物为咪唑衍生物，它们可使用本领域技术人员熟知的方法和例如在Comprehensive Heterocyclic Chemistry，编辑者Katritzky和Rees，Pergamon Press，1984，5，457-497中描述的方法，从市场上可得到的起始原料或能够用与熟知的方法类似的方法从这样的原料制备的起始原料而容易地制备。在许多这样的合成中关键步骤是中心咪唑核的形成，以得到式(I)化合物。这些专利描述α-酮肟(ketooximes)和α-羟基酮(苯偶姻)的合成及其随后在制备咪唑和N-羟基咪唑中的用途。此后，使用常规官能团互变方法，通过以基团HetAr、Ar和Y1中任一个处理取代基，可得到其它的式(I)化合物。
具体地说，在第一个方法中，通过使式(II)α-二酮：
HetArCOCOAr(II)
其中Ar如式(I)所定义，或为其等价物且HetAr定义为式(I)的片段
(应该注意到，在以下流程中R1表示为X-R4，仅为了举例说明的目的)，与式(III)的醛缩合，
其中Y1为可转化为Y的基团且R2和R3如在上文所定义或为其等价物，如果必要，在咪唑环形成条件下与氨或其来源缩合，可制备式(I)化合物。
在这些流程中使用的基团Y1是可转化为Y的基团。使用易于得到的技术，转化为Y对本领域技术人员是熟知的。例如，Y1可为保护的胺，例如CBZ或/和S-BOC胺，其脱除保护且转化为Y；或者Y1可为羧酸或羧酸酯，它可经熟知的方法转化为胺、溴化物或叠氮化物(即a1碳降解)且进一步官能化；或者Y1可为保护的醇，且使用标准官能团互换转化为胺，例如叠氮化物并经还原等转化为基团Y。
α-二酮适宜的等价物为本领域技术人员熟知的且包括相应的α-酮基-肟和α-二肟。式(III)醛的适宜等价物为本领域技术人员熟知的且包括相应的肟和缩酮。
氨或其来源优选过量使用，在α-二酮的情况下使用至少两摩尔的量和在α-酮基-肟的情况下使用至少等摩尔的量。
适宜的氨源包括有机羧酸的铵盐如三氟乙酸铵、或C1-6链烷酸铵，例如乙酸铵和甲酸铵，优选乙酸铵，以及羧酰胺特别是甲酸的酰胺，例如甲酰胺。通常以大过量使用铵盐且在酸例如其中酸也可用作反应溶剂的C1-6羧酸存在下使用。如果使用甲酰胺，它作为反应溶剂可过量使用。可使用其它的溶剂如乙醇或二甲基亚砜(Lantos等，JHet Chem，19，1375，1982)。也可使用另外的溶剂，例如二甲基甲酰胺可与甲酰胺一起使用。一般在升高的温度下，例如在回流条件下进行反应，如果需要，任选在压力和/或惰性气氛如氮气中于密封管中进行。在熔融的盐含有氨源的盐，例如三氟乙酸铵中，在升高的温度下，进行该反应也是可能的。
胺另外的适宜来源为羟胺，其中最初形成的咪唑为N-羟基-N-氧化物咪唑。然后，按照Akange和Allan，Chem and Ind.1975年1月5日，38的方法，在合适的溶剂例如甲醇中，通过用适宜的还原剂例如硼氢化钠处理可将其还原为相应的N-羟基咪唑。通过用常规脱氧合剂例如三氯化钛、三氯化磷或亚磷酸三烷基酯如亚磷酸三甲基酯或亚磷酸三乙基酯处理，可将N-羟基咪唑依次转化为式(I)咪唑。在质子催化下，通过用具有大约2当量羟胺或相应醛肟和大约1当量羟胺的式(III)醛处理式(II)α-二酮，可易于得到N-羟基-N-氧化物咪唑。或者，通过相应的α-二肟或α-酮基-肟与式(III)醛的醛肟的酸催化的缩合，可得到N-氧化物。
当以上式(II)化合物为α-酮基-肟衍生物时，应意识到最初得到的产物应为式(I)化合物，其中咪唑被N-羟基化且如上描述的那样可转化为式(I)化合物。
本领域技术人员将意识到在一些情况下，提供分开的氨源是不必要的，因为α-二酮或醛等价物可能已经包含这样的来源。这样的实例包括α-二肟或α-酮基-肟和醛肟。
在流程I-III中概述了制备本发明化合物的优选方法。
在流程I中，经用强碱例如二-异丙基氨化锂处理，从1(具体实例为V＝CH，X＝S，R1＝Me)制备的阴离子与芳醛缩合，除去保护基团后得到二醇2。然后通过Swern氧化，可将其转变为α-二酮3，其中任何数量的潜在的有用的变体(variations)为已知并可以使用。在作为氨源的乙酸铵和合适的溶剂例如乙酸或DMSO的混合物中，通过使3与式(III)的取代醛一起加热，那么可将α-二酮3环合为咪唑4。使用常规官能团互换方法，可将具有基团Y1的咪唑4转化为基团Y，得到式I化合物咪唑5。官能团转化在本领域中是熟知的并在以下文献中有描述，包括：例如Comprehensive Organic Functional GroupTransformations，编辑者A.R.Katritzky，O.Meth-Cohn和C.W.Rees(Elsevier Science Ltd.Oxford，1995)，Comprehensive Organic Chemistry，编辑者D.Barton和W.D.Ollis(Pergamon Press，Oxford，1979)和Comprehensive Organic Transformations，R.C.larock(VCH PublishersInc.，纽约，1989)。优选Y1基团的实例为CH2NH2或其保护形式，例如CH2NHBoc。流程I也阐述保护的α-羟基酮6的制备，即通过使1的阴离子与合适的取代苯甲酰胺的活化羰基衍生物如N-甲氧基-N-甲酰胺缩合，得到保护的α-羟基酮。然后使用作为氧化剂的铜(II)盐例如乙酸铜(II)和作为氨源的乙酸铵的组合，将加成物6直接转变为咪唑4。α-羟基酮6也可脱除保护，然后经氧化，例如采用Swern氧化反应得到α-二酮3。
流程I
流程II阐述α-酮基-肟制备式(I)化合物的用途。通过将2-甲硫基-6-甲基嘧啶阴离子(经用烷基锂例如正丁基锂处理制备)加入到N-烷基-O-烷氧基苯甲酰胺中，可制备杂环酮7(例如，V＝N，X＝S，R1＝Me)。或者，所述阴离子可与苯甲醛缩合，得到醇，然后将其氧化为酮7。然后，使用标准条件，例如与亚硝酸钠反应，从7制备α-酮基-肟8，之后，可使其与式(III)醛反应，得到N-羟基咪唑9。通过用脱氧合剂例如三氯化钛、三氯化磷或亚磷酸三烷基酯如亚磷酸三甲基酯或亚磷酸三乙基酯处理，可使其转变为10。然后可使用官能团互换转变为10的Y1，得到具有如上文定义的Y的式(I)化合物11。此外，5或11的硫(X＝S)经氧化为亚砜或砜，随后用氧、氮或硫亲核试剂经亲核置换，得到式I化合物(X＝O，N或S；在流程I和II中的化合物5和11)。
流程II
如在流程I或II中那样，但用4-甲基-2-氯吡啶或4-甲基-2-氟吡啶代替起始的2-甲硫基-6-甲基嘧啶或吡啶(1)，可制备通式(V＝CH，X＝O、N、S)的化合物(Gallagher等，Bioorg.Med.Chem.5，49，1997)。按照在美国专利5,670,527中描述的方法，可进行生成的2-卤代吡啶基咪唑的亲核取代。或者，硫(X＝S)经氧化为亚砜或砜，随后用氧、氮或硫亲核试剂经亲核置换，得到式I化合物(在流程I和II中的化合物5和11)。
如在流程III中那样，可制备另外的化合物，其中Ar基团最后加入。(X、R2、R3和Y如对式(I)那样定义且Y1为可转化为Y的基团)。
流程III
用亚硝酸钠氧化4-乙酰基取代的吡啶衍生物(V＝CH，X＝S，R1＝Me)得到酮肟。在乙酸中将该产物与烷基醛和乙酸铵一起加热，可得到咪唑核。伴随与亚磷酸三烷基酯一起加热或在环境温度下与三氯化钛一起搅拌，可实现羟基咪唑的还原。用N-碘代琥珀酰亚胺处理咪唑得到碘代咪唑，然后在钯催化剂下可与各种硼酸反应，得到芳基或杂芳基咪唑。也可使用其它的联芳基偶合反应。
在合成式(I)化合物期间，中间体化合物中的不稳定的官能团，例如羟基、羧基和氨基可受到保护。在例如有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)，T.W.Greene和P.G.M Wuts，(Wiley-Interscience，纽约，第2版，1991)中给出其中各种不稳定的官能团可被保护和裂解生成的保护衍生物的方法的综合讨论。
可单独或作为包含至少两个式(I)化合物，例如5-1000个化合物且更优选10-100个式(I)化合物的化合物库(libraries)制备式(I)化合物。通过本领域技术人员已知的方法，使用液相或固相化学经组合的“分开和混合(split and mix)”法或经多平行合成(multiple parallelsynthesis)，可制备式(I)化合物库。
因此，本发明另一方面提供包含至少两个式(I)化合物或其药学上可接受的盐的化合物库。
通过与合适的酸或酸衍生物反应，可常规制备药学上可接受的盐。
治疗方法
Tie受体为大约125kDa的蛋白，具有单一推定的跨膜区域。这些受体的细胞外功能域分为几个区域：在EGF样功能域发现三个区域具有半胱氨酸表达模式；有两个区域具有与免疫球蛋白样功能域的一些弱的同源性和结构特性；以及有三个区域与纤连蛋白III重复结构的同源性。这种细胞外功能域的特殊组合对Tie受体是独特的。Tie2的细胞内部分与FGF-R1、PDGF-R和c-kit的激酶功能域是最密切相关的(～40％同一性)。Tie2的细胞内部分包含酪氨酸激酶的所有特征，包括GXGXXG ATP结合位点共有序列和一般酪氨酸激酶基元(即HRDLAARN和DFGL)。
由于它们是仅有的受体酪氨酸激酶，而非血管内皮细胞生长因子(VEGF)的那些受体，即在其表达中很大程度上受限于内皮细胞，这些受体已引起兴趣。在以下段落中详述的几种证据显示Tie2在血管生成中是重要的。
a.Tie1和Tie2受体定位
i.胚胎学血管发育
大批研究者使用原位杂交研究Tie受体在胚胎中的定位。Korhonen等(Blood 80：2548-2555，1992)显示Tie受体的mRNA定位在所有形成血管的内皮细胞和小鼠胚胎的心内膜中。在胚胎发育期间，在成血管细胞和所有发育的维管结构中观察到Tie受体的表达。在小鼠胚胎发生期间，主要VEGF受体、Flk-1表达12-24小时后Tie受体表达，或许提示这些受体系统连续和不同的作用(Schnurch和Risau，Development 119：957-968，1993)。Tie2的1.2Kb基因组5’侧翼区的克隆偶合于lacZ基因且在转基因小鼠中表达，证实胚胎发育期间在内皮细胞中表达的选择模式(Schlaeger等，Development 121：1089-1098，1995)。因此，Tie2启动子起作用确保内皮细胞特异性表达Tie2。
ii.在成人组织中
胚胎血管生成与病理血管生成之间的相似性得到假设，例如在肿瘤或慢性炎性疾病中阻断Tie2功能，可阻断血管生成，因此可阻断进一步的细胞增殖并提供治疗益处。除在激活伤口愈合部位以外，在成人皮肤中不能观察到Tie mRNA，其中肉芽组织中的增殖毛细管包含丰富的Tie mRNA(Korhonen等，Blood 80：2548-2555，1992)。从正常皮肤的cDNA的PCR扩增无法显示Tie受体的信号(Kaipainen等，Cancer Res.54：6571-6577，1994)。相反，用来自转移黑素瘤的cDNA观察到强烈的信号，其中原位研究将该信号定位在血管内皮上。当Tie受体表达在已建立的维管结构中向下调节时，在排卵期间的卵巢、伤口和肿瘤(乳腺癌、黑素瘤和肾细胞瘤)的维管结构中发生血管生成向上调节，这与当前流行的观点，即在成人中的血管生成借用了胚胎血管生成的机制相一致。
b.Tie剔除动物
具有Tie2剔除或携带转基因编码的“显性失活的”Tie2受体的同型接合小鼠证实Tie2受体对胚胎发育是至关重要的(Dumont等，Genes Dev.8：1897-1909，1994；Sato等，Nature 376：70-74，1995)。由于血管机能不全和内皮细胞数目的显著减少，在这些小鼠中发生胚胎死亡。血管生成-即内皮细胞分化和就地形成血管-在缺乏Tie2的小鼠中似乎相对正常。在Tie2突变型小鼠胚胎中，导致血管分支形成(血管生成)的萌发和再造显著地减少。这种萌发的缺乏和血管生成导致实际上的生长停滞，具体地说就是脑、神经管和心脏，导致生存力缺乏。这例证性地说明了Tie2在血管生成中至关重要的作用。当血管生成受到多种生长因子调节时，这是很明显的。令人感兴趣的是，在比Tie2破坏的那些小鼠更早发生的血管生成中Flk1(VEGF受体)剔除小鼠呈现胚胎的致死缺损。破坏Tie1受体产生更大的差异，之后得到缺损的表型；由于另外良好形成的维管结构的整体性缺损导致的出血，小鼠胚胎在发育中终究会死亡。这些研究共同提示VEGF/Flk1和Tie系统以序贯方式操作，而Tie2在血管生成中具有至关重要的作用。
c.Tie2配体
最近，已报道了Tie2受体的两个配体。血管形成素(angiopoietin)-1结合并诱导Tie2的酪氨酸磷酸化，其体内表达与生长的血管密切相关(Davis等，Cell 87：1161-1169，1996)。经基因工程改造的缺乏血管形成素-1的小鼠呈现血管生成的不足，这使人联想起先前在缺乏Tie2受体的小鼠中观察到的那些结果，证实血管形成素-1为Tie2的主要生理学配体且Tie2对体内血管生成作用是至关重要的(Suri等，Cell87：1171-1180，1996)。血管形成素-2经同源性筛查鉴定并显示为一种天然来源的Tie2受体拮抗剂。血管形成素-2的转基因过度表达破坏在小鼠胚胎中的血管形成(Maisonpierre等，Science 277：55-60，1997)。这些结果共同支持Tie2受体在血管生成中的作用。
为在治疗中使用式(I)化合物，通常将它们配制成符合标准药学实践的药用组合物。
本发明另一方面提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药用组合物。
当以如上提及的剂量范围给予式(I)化合物时，表明/期望无毒理学作用。
通过任何常规用于给予药物的途径，例如口服、局部、非肠道或经吸入，可便利给予式(I)化合物、其药学上可接受的盐和包含这样物质的药用组合物。按照常规方法，通过使式(I)化合物与标准药用载体混合，可以以如此制备的常规剂型给予式(I)化合物。也可以与已知的第二种治疗活性化合物联合的常规剂型给予式(I)化合物。这些方法可包括将成分适当混合、制粒和压制或溶解为所需的制剂。应该意识到药学上可接受的载体或稀释剂的形式和性质由与之联合给予的活性成分的量、给药途径和其它的已知变量确定。在与制剂的其它成分相适配的意义上，这些载体必须是“可接受的”且对其接受者无害。
所使用的药用载体可例如为固体或液体。固体载体的实例为乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，载体或稀释剂可包括本领域熟知的时间延迟材料，例如单独或含有蜡的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
能够使用各种药物形式。因此，如果使用固体载体，制剂可以为压片，以粉末或小丸的形式放入硬明胶胶囊中或为糖锭剂或锭剂的形式。固体载体的量将在宽范围内变化，但优选为大约25mg至大约1g。当使用液体载体时，制剂将为糖浆剂、乳剂、软明胶胶囊剂、灭菌注射液例如安瓿或非水液体混悬剂的形式。
式(I)化合物可以局部给药，即通过非全身给药。这包括式(I)化合物外用于表皮或口腔，及将这样的化合物滴注到耳、眼和鼻中，以使化合物不明显进入到血流中。相反，全身给药指的是口服、静脉、腹膜内和肌内给药。
适用于局部给药的制剂包括适用于穿透皮肤到达炎症部位的液体或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、霜剂、软膏剂或糊剂和适用于给予眼、耳或鼻的滴剂。为局部给药，活性成分可包含0.001％-10％w/w，例如1％-2％重量的制剂。然而，活性成分可包括多达10％w/w，但将优选包含小于5％w/w，更优选0.1％-1％w/w的制剂。
本发明的洗剂包括那些适用于皮肤或眼睛的制剂。眼洗剂可包含灭菌水溶液，其中任选包含杀菌剂并可经制备滴剂相似的方法制备。用于皮肤的洗剂或搽剂也可包含迅速干燥和冷却皮肤的试剂，例如乙醇或丙酮，和/或润湿剂，例如甘油或油例如蓖麻油或花生油。
本发明的霜剂、软膏剂或糊剂为外部使用的活性成分的半固体制剂。在合适的机械辅助下，使用油脂性或非油脂性基质，单独或在水或非水流体中的溶液或悬浮液中，通过使以细分散的或粉末形式的活性成分混合可制备它们。基质可包括烃类例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂，胶浆，天然来源的油例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油，羊毛脂或其衍生物或脂肪酸如硬脂酸或与醇例如丙二醇或大粒凝胶一起的油酸。制剂可掺入任何适宜的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂如脱水山梨醇酯或其多氧乙烯衍生物。也可包括悬浮剂例如天然胶类、纤维素衍生物或无机材料如硅胶(silicaceous silicas)和其它的成分如羊毛脂。
本发明的滴剂可包含灭菌水或油溶液或混悬液，且可通过将活性成分溶于杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适防腐剂的合适的水溶液中制备，且优选包含表面活性剂。然后，生成的溶液可经过滤澄清、转移至合适的容器中，之后把容器密封并经高压灭菌法或在98-100℃下维持半小时灭菌。或者，经过滤可将溶液灭菌并通过无菌技术转移至容器中。适用于包含在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯基汞或乙酸苯基汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和乙酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的合适的溶剂包括甘油、稀乙醇和丙二醇。
可经非肠道给予式(I)化合物，即通过静脉、肌内、皮下、鼻内、直肠内、阴道内或腹膜内给药。非肠道给药的皮下和肌内形式通常为优选。通过常规技术可制备用于这样给药的合适剂型。通过吸入，即通过鼻内和口腔吸入给药，也可给予式(I)化合物。通过常规技术可制备用于这样给药的合适剂型，例如气溶胶制剂或计量剂量吸入剂。
式(I)化合物也可局部使用以治疗或预防经过度或不适宜的血管生成恶化的疾病。
以足以抑制Tie2受体活性的量给予式(I)化合物以向下调节其至正常水平，或在一些情况下调节至低于正常的水平，以便改善或预防疾病。
具有不合适的血管生成成分的慢性疾病为各种眼的新血管生成，例如糖尿病视网膜病和黄斑退化。
具有维管结构过度或增加的增殖的其它慢性疾病为肿瘤生长和转移、动脉粥样硬化和一些关节炎疾病。因此，Tie2酪氨酸激酶受体抑制剂具有阻断这些疾病状态的血管生成成分的用途。
在此使用的术语“维管结构不适宜的血管生成过度或增加的增殖”包括(但不限于)其特征在于血管瘤和眼病的疾病。在此使用的术语“不适宜的血管生成”包括(但不限于)其特征在于伴随组织增生的血管增殖，例如发生于癌症、肿瘤转移、关节炎、牛皮癣和动脉粥样硬化中的血管增殖的疾病。
对在此公开的所有用于式(I)化合物的方法，每天口服剂量方案将优选为总体重的大约0.1-大约80mg/kg，优选为大约0.2-30mg/kg，更优选为大约0.5mg-15mg。每天非肠道剂量方案将为总体重的大约0.1-大约80mg，优选为大约0.2-大约30mg/kg，且更优选为大约0.5mg-15mg/kg。每天局部剂量方案将优选为大约0.1mg-大约150mg，每天给药1-4次，优选2或3次。每天吸入剂量方案将优选为每天大约0.01mg/kg-大约1mg/kg。本领域技术人员也将意识到根据受治疗疾病的性质和程度、给药形式、途径及部位、和受治疗的具体患者确定式(I)化合物或其药学上可接受的盐的个体给药的最适量和间隔，并且通过常规技术能够测定这样的最适量。本领域技术人员也将意识到使用治疗测定试验常规方法本领域技术人员能够确定治疗的最适疗程，即在所定义的天数内每天给予式(I)化合物或其药学上可接受的盐的剂量数。
药理试验方法
A.Tie2激酶活性的测量
使用Tie2受体的部分cDNA克隆制备用于Tie激酶研究的蛋白质。为建立初步筛选试验，构成杆状病毒表达的Tie2激酶功能域的GST融合并使用商业载体pAcG1(Pharmingen)表达。
将最终构成物(construct)转染至用于筛选试验的杆状病毒和可溶性的GST融合产物。前期工作已证实杆状病毒表达的GST融合用于鼠Tie2激酶功能域以筛选候选靶/信号分子的用途(Huang等，Oncogene 11：2097-2103，1995)。
Tie2激酶活性测定：一般以如下描述的两种方法之一进行Tie2激酶活性测定。测定中的微小变化给出相似结果。
1.自动磷酸化闪烁板(flashplate)试验
材料：
激酶缓冲液(最终20mM Tris-HCl，pH7.0，100mM NaCl，12mMMgCl2，1mM DTT)。
Gamma 33p-ATP(一般最终量为0.5-1uCi/孔)
ATP(最终30uM，或其它所需浓度)
闪烁板(具有塑料闪烁剂包衣孔的96孔聚苯乙烯微量培养板)
TopCount(微量培养板闪烁计数器)
方法：
开动震荡培养器并将温度调至30℃。
向闪烁板每孔加入20ul的3×激酶缓冲液
除背景外每孔加入20ul蛋白。在1-2ul下加入一般在DMSO储备液中的化合物。
每孔加入20ul的gamma 33p-ATP和冷的ATP混合物。
总体积为60ul。
用透明的聚酯薄膜覆盖。
在30℃下，于震荡器上孵育2小时或所需的时间。
从震荡器上取出闪烁板，冲洗5次(例如，每孔用300ul在1×PBS中的10uM ATP冲洗)。
在TopCount或其它的计数装置上读板。计算作为％抑制率的结果和使用正常计算方法计算IC50。
在测定中，发现式(I)的代表性化合物(实施例1)为活性的，具有＜1uM的IC50。
2.Tie2激酶的荧光极化
最终测定条件：
50mM HEPES pH7.5
2％DMSO(当筛选化合物时)
250uM ATP
2mM MgCl2
1mM DTT
50uM 钒酸(Vanidate)钠
10uM 肽底物
活化的tie2激酶*参见以下活化方法
肽底物：
RFWKYEFWR-OH
MW(TFA盐)＝1873Da
制备1mM肽储备液并在-20℃下贮存。
临用前稀释至100uM。
9×激酶缓冲液：
450mM HEPES pH7.5
900mM NaCl
450uM 钒酸钠
18mM MgCl2
100mM DTT
可以提前制备并以等分试样于-20℃贮存。
ATP储备液：
制备25mM ATP储备液并在-20℃下以等分试样贮存直到需要。
临用前稀释至2.5mM
方法：
将50ul反应液加入到以下96孔半面暗色区域(black half-area)的板(Costar，编号3694)上
1.在20％DMSO中的5ul化合物。
2.5ul 9×激酶缓冲液。
3.5ul 2.5mM ATP。
4.5ul 100uM肽底物。
5.25ul PTK检测混合物(Panvera，P-2652，50ml-UK分配器为Cambridge Bioscience)
6.在1×缓冲液中稀释5ul活化的tie2激酶(方法如下)以启动反应。
7.在FP装置上，于30-50分钟的周期内读取与酶活性相一致的极化。
在该荧光测定中，发现式(I)的代表性化合物(实施例1)是有活性的，具有＜1uM的IC50。
Tie2激酶活化方法：
最终缓冲液条件：
20mM Tris-HCl，pH7.5
12mM MgCl2
100mM NaCl
20uM 钒酸钠
1mM DTT
300uM ATP
方法：
1.在300uM ATP和以上描述的缓冲条件下，孵育5uM的Tie2激酶。
2.在27℃下，孵育2小时。
3.向在20mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl中预先平衡的NAP-25脱盐柱(Pharmacia Biotech目录号17-0852-02)中加入2.5ml反应液，以从酶中分离ATP。
4.用5.0ml的20mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl稀释酶，在此点蛋白浓度应为2.5uM。
5.将酶等分且尽快在-80℃下贮存。
B.Tie2受体信号传导的测量-细胞测定
在用2mM谷氨酰胺和10％FBS作为悬浮培养物补充的RPMI-1640培养基中，于1-5×105ml下培养HEL细胞(ATCC#TIB180)。实验前16-36小时，将必需数量的细胞传代到0.5％FBS/RPMI培养基中。实验当天，收获细胞且在0.5％FBS RPMI中于0.5-1.0×107个细胞ml的密度下重悬浮，并在6孔板中以2-3ml/孔接种。
或者，人脐内静脉内皮细胞(HUVECs)(Clonetics-Walkersville，MD)可用于这个测定。以每孔2×105-1×106个细胞，将传代2-12代之间的HUVECs铺到EGM(Clonetics)补充的6孔板中。24小时后，将培养基更换为包含3％BSA(Clonetics)的EBM，培养细胞过夜并用于第二天的测定。
用在合适浓度下的抑制化合物将细胞处理30-45分钟。在振荡器上，短时间(大约30秒)内将孔中内容物混合，然后在37℃下孵育。然后，用天然配体源例如血浆或成纤维细胞条件培养基处理细胞10分钟。
在10分钟的孵育期结束时，将板放置于冰上。收获细胞且移去培养基。在变性样品缓冲液(Invitrogen-Carlsbad，CA)中，将细胞溶解。在培养基设定(medium setting)下将悬浮液超声处理5个脉冲且返回至冰上。如以下所描述(Harlow，E.和Lane，D.P.，Antibodies-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press：纽约，1988.)的那样，经抗-磷酸-Tie2抗体蛋白质印迹法和检测，测定Tie2受体的磷酸化状态。将30ul赖氨酸盐通过7.5％SDS/聚丙烯酰胺凝胶。然后把凝胶转移至硝基纤维素或PVDF膜上，每一种方法参照制造商说明书的蛋白质印迹法。
用-20之间的PBS(0.05％)冲洗印迹，然后在室温下用3％BSA/PBS/Tween阻断1小时。之后在PBS/0.05％Tween中，将所述印迹与1ug/ml抗磷酸-Tie2抗体(SmithKline Beecham)一起孵育1小时。用PBS/Tween将印迹冲洗四次，每次5分钟。在PBS/Tween中，于制造商推荐的稀释浓度下，将抗-鼠-HRP缀合二次抗体与印迹孵育1小时。在PBS/Tween中把印迹冲洗四次，每次5分钟。最后一次冲洗后，经ECL方法(Amersham)或一些等价方法展开印迹。
使用光密度计或图像程序(例如ImageQuant-MolecularDynamics)，扫描每一个印迹。分离Tie2带并“框注出(boxed out)”每一电泳泳道。分析每一个样品的象素体积(pixel volume)或可比较测量。也测定每一个样品相同大小的合适的背景区。调整背景后，磷酸化表达为相对于未处理对照组的磷酸酪氨酸染色的比率。
血管生成体内模型
体内血管生成测量-小鼠气囊(air pouch)肉芽肿模型：
以下描述的炎性血管生成模型用于显示：抑制Tie2将停止血管过度或不适宜的增殖的组织损伤。慢性炎症的鼠气囊肉芽肿模型(Kimura等，1985，J.Pharmacobio-Dyn.，8：393-400；Colville-Nash等，1995，J.Pharm.and Exp.Ther，274：1463-1472)特征在于炎性细胞内流、纤维组织增生和广泛的血管生成，其公开的全部内容通过引用结合到本文中。这是典型的炎性血管生成并证实生血管成分可在药理学上不受肉芽肿的生长和大小的调节。另外，通过血管灌制(casting)方法能够对血管生成准确地定量。
第1天，使用Aerrane(异氟烷)气体(5％)或其它允许的方法麻醉小鼠，之后，使用27g的针将3ml空气注射到背部皮下组织中。使小鼠恢复。
第0天，使用Aerrane或其它允许的方法再次麻醉小鼠，一旦麻醉，将0.5ml含有0.1％(v/v)巴豆油的弗氏完全佐剂注射到前1天(Day-1)形成的气囊中。使动物局部接受在0.2ml的N，N-二甲基乙酰乙酰胺(DMA)(Sigma，St.Louis，Mo)/Cremephor E1(Sigma，St.Louis，Mo)、盐水(10/10/80)或其它合适的媒介物中的化合物，也可开始对动物的给药方案(天数取决于研究)。使动物恢复且在没有麻醉的情况下对动物进行所有的后续给药。
第1-5天，按照时间表对动物给药。
在第6天，再次麻醉动物，此后进行血管灌制(Kimura等，1986，J.Pharmacobio-Dyn.，9：442-446)；这包括尾静脉静脉注射1ml胭脂红(10％)(Sigma，St.Louis，Mo.)/明胶(5％)(Sigma，St.Louis，Mo.)溶液。然后通过给予致死剂量的麻醉剂处死动物，在取出肉芽肿组织之前在4℃下冷却2小时。
当取出肉芽肿组织时，称重，然后在45℃下干燥3天并再次称重。然后，在57℃下，于0.9ml的0.05M含有12U/ml-1木瓜蛋白酶(Sigma，St.Louis，Mo.)和0.33g/L-1的N-乙酰基-1-半胱氨酸(Sigma，St.Louis，Mo.)的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，将干燥的组织消化3天。消化3天后，经加入0.1ml的5mM NaOH溶解胭脂红。离心样品，然后用0.2um acrodiscs过滤。然后对照从非胭脂红治疗的动物提取的组织中生成的胭脂红标准曲线(0.5-2mg/ml)测定胭脂红含量并在490nm下读取数据。一般使用DeltaSoft Elisa分析软件(Biometallics公司，Princeton，NJ)测定样品和标准值。然后将胭脂红含量用于测定各种治疗的血管指数，血管指数是mg胭脂红染料/gm干组织。
诱发肉芽肿后，通常测量6天内的化合物对血管密度的作用。测定该时间点处于或接近血管生成的峰值。使用甲羟孕酮，一种血管扩张甾体药物(angiostatic ateroid)(Gross等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1176-1180)，作为阳性对照，其公开的全部内容通过引用结合到本文中。在这个模型中，该对照组证实最大50％的减少。如干重测量那样，甲羟孕酮对肉芽肿大小无作用。
血管生成模型-体内
体内血管生成测量-Matrigel模型
通过将细胞外基质凝胶置于小鼠皮肤下约一周，建立体内血管生成模型，然后使用几次测量对凝胶的生血管的侵袭作用进行定量(Biancone，L等，Development of Inflammatory Angiogenesis by LocalStimulation of Fas In Vivo.J.Exp.Med.186：147，1997)。简言之，还原性生长因子，无内毒素的Matrigel(Becton-Dickinson，Bedford，MA)在低温下为凝胶。将抗体或血管生成剂与凝胶混合，以使它们不构成总体积的2％以上。通过冷却的注射器经背侧皮下注射给予8周龄或更大的C57雌性小鼠0.5ml的Matrigel。在生理温度下，液体Matrigel迅速形成固体和粘结凝胶(cohesive gel)。在实验过程期间，小鼠接受如上描述的给予的试验化合物或对照品。6天后，处死小鼠且回收Matrigel柱。按照Drabkin的方法(Drabkin，DL和Austin，JH：Spectrophotometric Studies II.Preparations from washed blood cells；nitric oxide hemoglobin and sulfhemoglobin.J Biol Chem 112；51，1935)(Sigma，St.Louis，MO)，通过分析凝胶中血红蛋白的含量，或如上描述那样通过用CD31染色剂染色和对血管定量，对血管生成进行定量。
合成化学
现在通过参照以下实施例来描述本发明，这些实施例仅为举例说明，并不构成对本发明范围的限制。除非另外指明，所有温度以摄氏度给出，所有溶剂为可得到的最高纯度并且所有反应在氩气氛中，于无水条件下进行。
在实施例中，所有温度以摄氏度(℃)表示。除非另外指明，使用快速原子轰击，在VG Zab质谱仪上进行质谱。使用Bruker AM 250或Am 400光谱仪，在250MHz下记录1H-NMR(下文为“NMR”)谱。指定的多重性为：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰和br表示宽峰信号。Sat.表示饱和溶液，eq表示相对于主要反应剂的试剂的摩尔当量的比例。
快速层析法在Merck硅胶60(230-400目)上进行。
实施例1
(2-(4-(6-甲氧基萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-氨基甲酸叔丁基酯
a)6-甲氧基-萘-2-羧酸-N-甲氧基-N-甲基-酰胺
将6-甲氧基萘甲酸(10.95克(此后为“g”)，0.05摩尔(此后为“mol”))、三乙胺(29.8毫升(此后为“mL”或“ml”)，0.2mol)在二氯甲烷(150ml)中的悬浮液冷却至0℃并缓慢加入亚硫酰氯(4.35ml)，期间溶液变成棕色并均匀。移去冰浴并在室温下继续搅拌大约1小时(此后为“h”)，在此T点时加入甲氧基甲胺盐酸盐(7.02g，0.06mol)。在室温下搅拌混合物3小时。浓缩该溶液并在二氯甲烷和饱和碳酸钾溶液之间分配残余物。分离有机层，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到为棕色固体的标题化合物(9.65g，73％)；MS(ES)m/e 246[M+H]+。
b)4-叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基吡啶
将4-吡啶基甲醇(8.5g，0.08mol)溶于N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的9∶1混合物(150ml)中。加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(13g，0.09mol)和咪唑(6.4g，0.09mol)并在室温下搅拌溶液12小时。减压浓缩反应混合物并在乙酸乙酯和水之间分配残余物。分离有机层，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到为无色油的标题化合物(17.4g，92％)；MS(ES)m/e 244[M+H]+。
c)1-(叔丁基-二甲基甲硅烷氧基)-2-(6-甲氧基-萘-2-基)-1-吡啶-4-基-乙-2-酮
在0℃下，向搅拌着的二异丙基胺(5.01mL，0.035mol)的四氢呋喃(50ml)溶液中加入正丁基锂(15.5mL，0.039mol)以就地生成二异丙基氨化锂。向冷却的-78℃LDA溶液中加入4-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基吡啶(7.84g，0.035mol)并继续搅拌30分钟，此时加入6-甲氧基萘-2-羧酸-N-甲氧基-N-甲基-酰胺(5.51g，0.023mol)。使反应物逐渐温热至室温。用乙酸乙酯提取反应混合物并合并有机层，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，经快速层析法纯化并分离出为黄色固体的标题化合物；MS(ES)m/e 377[M+H]+。
d)(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-氨基甲酸叔丁基酯
将乙酸(15ml)加入到(2，2-二甲基-3-氧代-丙基)-氨基甲酸叔丁基酯(Y.Guindon等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，9289)(0.26g，1.2mmol)、乙酸铵(0.98g，12.0mmol)，和2-(叔丁基-二甲基硅烷基氧基)-2-(6-甲氧基-萘-2-基)-1-吡啶-4-基-乙酮(0.26g，0.6mmol)的混合物中。在90℃下，把生成的溶液加热过夜，然后冷却至0℃，并伴随搅拌下向溶液中缓慢加入NH4OH。过滤生成的沉淀，干燥得到标题化合物；MS(ES)m/e 472[M+H]+。
实施例2
2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基胺
将实施例1的产物(200毫克(此后为“mg”)，0.4毫摩尔(此后为“mmol”))溶于三氟乙酸和二氯甲烷的1∶1混合物(5mL)中并在室温下搅拌4小时。减压浓缩溶剂。经柱层析法纯化粗产物，得到标题化合物(50mg，32％)；MS(ES)m/e 373[M+H]+。
实施例3
正丙基-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-(3-甲硫基-丙基)-胺
用碳酸钾(10mg，0.07mmol)和1-溴代丙烷(9mg，0.07mmol)处理实施例2(20mg，0.05mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(2ml)中的溶液。在室温下，搅拌溶液4小时。用水稀释混合物并用乙酸乙酯提取。分离水层并用另外的乙酸乙酯提取，合并有机层，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。在Gilson HPLC上层析残余物，得到为黄色固体的标题化合物(3mg，13％)；MS(ES+)m/e 415[M+H]+。
实施例4
(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-甲磺酰胺
将实施例2的产物(15mg，0.04mmol)在含有Hunig’s碱(9μL，0.05mmol)的四氢呋喃和二氯甲烷的1∶1混合物(2mL)中的溶液用甲磺酰氯(4μL，0.05mmol)处理并在室温下搅拌8小时。用水稀释混合物并用二氯甲烷提取。分离水层并用另外的二氯甲烷提取，合并有机层，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。在Gilson HPLC上层析残余物，得到为黄色固体的标题化合物(8mg，44％)；MS(ES)m/e451[M+H]+。
实施例5
1，1，1-三氟-N-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-甲磺酰胺
使用在实施例4中描述的方法，从实施例2的产物和1，1，1-三氟甲磺酰氯开始制备标题化合物(9mg，33％)；MS(ES)m/e 505[M+H]+。
实施例6
2，2，2-三氟-N-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-乙磺酰胺
使用在实施例4中描述的方法，从实施例2的产物和2，2，2-三氟乙磺酰氯开始制备标题化合物(12mg，43％)；MS(ES)m/e 519[M+H]+。
实施例7
(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-丙磺酰胺
使用在实施例4中描述的方法，从实施例2的产物和丙磺酰氯开始制备标题化合物(7mg，27％)；MS(ES)m/e 479[M+H]+。
实施例8
3-氯-N-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-丙磺酰胺
使用在实施例4中描述的方法，从实施例2的产物和3-氯-丙磺酰氯开始制备标题化合物(11mg，40％)；MS(ES)m/e 514[M+H]+。
实施例9
(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-丁磺酰胺
使用在实施例4中描述的方法，从实施例2的产物和丁磺酰氯开始制备标题化合物(8mg，30％)；MS(ES)m/e 493[M+H]+。
实施例10
1-乙基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
将实施例2的产物(20mg，0.05mmol)在含有Hunig’s碱(10μL，0.07mmol)的二氯甲烷(2mL)中的溶液用异氰酸乙酯(6μL，0.07mmol)处理并在室温下搅拌8小时。用水稀释混合物并用二氯甲烷提取。分离水层并用另外的二氯甲烷提取，合并有机层，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。在Gilson HPLC上层析残余物，得到为黄色固体的标题化合物(12mg，50％)；MS(ES)m/e 444[M+H]+。
实施例11
1-(2-氯乙基)-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和异氰酸3-氯乙酯开始制备标题化合物(13mg，51％)；MS(ES)m/e 478[M+H]+。
实施例12
1-正丙基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和异氰酸正丙酯开始制备标题化合物(12mg，49％)；MS(ES)m/e 458[M+H]+。
实施例13
1-异丙基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和异氰酸正丙酯开始制备标题化合物(12mg，49％)；MS(ES)m/e 458[M+H]+。
实施例14
1-叔丁基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和异氰酸叔丁酯开始制备标题化合物(10mg，39％)；MS(ES)m/e 472[M+H]+。
实施例15
1-甲基甲酰基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
使用在实施例4中描述的方法，从实施例2的产物和甲基甲酰基异氰酸酯开始制备标题化合物(13mg，51％)；MS(ES)m/e 474[M+H]+。
实施例16
1-(3，5-二甲基-异噁唑-4-基)-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和异氰酸叔丁酯开始制备标题化合物(11mg，40％)；MS(ES)m/e 511[M+H]+。
实施例17
1-正丙基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和硫代异氰酸(thioisocyanate)正丙酯开始制备标题化合物(7mg，28％)；MS(ES)m/e 474[M+H]+。
实施例18
1-正丁基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和硫代异氰酸正丁基酯开始制备标题化合物(8mg，31％)；MS(ES)m/e 488[M+H]+。
实施例19
1-异丙基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，从实施例2的产物和硫代异氰酸仲丁酯开始制备标题化合物(6mg，23％)；MS(ES)m/e 488[M+H]+。
实施例20
1-乙基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，由实施例2的产物和硫代异氰酸乙酯制备标题化合物(12mg，49％)；MS(ES+)m/e 460[M+H]+。
实施例21
1-甲基-3-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，由实施例2的产物和硫代异氰酸甲酯制备标题化合物(8mg，30％)；MS(ES+)m/e 446[M+H]+。
实施例22
1-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-3-(2-甲氧基乙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，由实施例2的产物和异硫氰酸2-甲氧基乙酯制备标题化合物(7mg，27％)；MS(ES+)m/e 490[M+H]+。
实施例23
1-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-3-(2-吗啉-4-基-乙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，由实施例2的产物和硫代异氰酸仲丁酯制备标题化合物(10mg，34％)；MS(ES+)m/e 545[M+H]+。
实施例24
1-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-3-(2-哌啶-4-基-乙基)-硫脲
使用在实施例10中描述的方法，由实施例2的产物和硫代异氰酸仲丁酯制备标题化合物(9mg，31％)；MS(ES+)m/e 543[M+H]+。
实施例25
环己基甲基-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-胺
用环己醛(3mg，0.07mmol)和三甲氧基硼氢化钠(9mg，0.07mmol)处理实施例2的产物(20mg，0.05mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液。在室温下搅拌该溶液4小时。用水稀释混合物并用乙酸乙酯提取。分离水层并用另外的乙酸乙酯提取，合并有机层，经无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。在Gilson HPLC上层析残余物，得到为黄色固体的标题化合物(10mg，40％)；MS(ES)m/e 469[M+H]+。
实施例26
双正丁基-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和丁醛开始制备标题化合物(12mg，47％)；MS(ES)m/e 485[M+H]+。
实施例27
双环己基甲基-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和环己醛开始制备标题化合物(4mg，13％)；MS(ES)m/e 565[M+H]+。
实施例28
(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-(3-甲硫基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和1-甲硫基丙醛开始制备标题化合物(4mg，16％)；MS(ES)m/e 461[M+H]+。
实施例29
(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-双-(3-甲硫基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和1-甲硫基丙醛开始制备标题化合物(11mg，46％)；MS(ES)m/e 549[M+H]+。
实施例30
异丁基-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-(3-甲硫基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和异丙醛开始制备标题化合物(11mg，48％)；MS(ES)m/e 429[M+H]+。
实施例31
双-异丁基-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-(3-甲硫基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和异丙醛开始制备标题化合物(11mg，42％)；MS(ES)m/e 485[M+H]+。
实施例32
(2，2-二甲基丙基)-(2-(4-(6-甲氧基-萘-2-基)-5-吡啶-4-基-1H-咪唑-2-基)-2-甲基-丙基)-(3-甲硫基-丙基)-胺
使用在实施例25中描述的方法，从实施例2的产物和叔丁醛开始制备标题化合物(16mg，67％)；MS(ES)m/e 443[M+H]+。
所有的出版物，包括(但不局限于)在本说明书中引用的专利和专利申请，通过引用结合到本文中，好象每一个单独的出版物被专门和分别指定通过引用其全部内容而结合到本文中。
以上描述充分公开了本发明，包括其优选实施方案。在此具体公开的实施方案的修饰和改进处于以下权利要求的范围内。不需进一步的详尽阐述，应确信本领域技术人员可采用先前的描述、最大限度地充分利用本发明。因此，本文的实施例将仅作为举例说明，并且无论如何不以任何方式构成对本发明范围的限制。其中独占权或优先权要求得到保护的本发明实施方案定义如下。