神经突增生做为增强记忆化合物的测定法 相关申请
本申请要求 2007 年 12 月 27 日提交的美国临时申请 NO.61/017,134 的优先权， 通 过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
本发明涉及使用神经突增生 (neurite outgrowth) 测定作为增强和改善记忆功能 化合物的筛选法。 背景技术 日益增长的证据表明成年的大脑中神经元仍继续增生 (Arsenijevic， Y. 等， Exp. Neurol.， 170 ： 48-62(2001) ； Vescovi， A.L 等， Biomed.Pharmacother.， 55 ： 201-205(2001) ； Cameron， H.A. 和 McKay， R.D.， J.Comp.Neurol， 435 ： 406-417(2001) ； 以 及 Geuna， S 等， Anat.Rec.， 265 ： 132-141(2001))。 目前进行中的实验策略是将神经元干细胞移植到成年大
脑中用于多种治疗适应征 (Kurimoto， Y 等， Neurosci.Lett.， 306 ： 57-60(2001) ； Singh， G.， Neuropathology， 21 ： 110-114(2001) 和 Cameron， H.A. 和 McKay， R.D.， Nat.Neurosci.， 2： 894-897(1999))。对于发育胚胎期的神经发生已经了解了很多 (Saitoe， M. 和 Tully， T。 ， “Making Connection between synaptic and behavioralplasticity in Drosophila” ， In Toward a Theory of Neuroplasticity， J McEachemand C.Shaw， Eds(New York ： Psychology Press)， pp.193-220(2000))。神经元分化， 神经轴延伸和初始突触靶标识别， 看起来均以活性非依赖性的形式发生。
无论在成年人还是在年轻人中， 起改善学习和记忆作用的化合物会在市场中得到 迅速的接受和使用。
本申请探索了增强神经突增生及其对记忆的作用的化合物的交集。
发明概述
长期记忆可以用刺激 CREB 途径活性和增强神经突增生的化合物来进行增强。本 发明的一个实施方案涉及鉴定增强记忆的化合物的方法， 包含 ： 从文库中选择诱导神经突 增生并且也增强 CREB 途径功能的候选化合物， 其中既促进神经突增生又增强 CREB 途径功 能的化合物被鉴定为增强记忆的化合物。选择诱导神经突增生的候选化合物的步骤包括， 向神经突宿主细胞提供候选化合物或对照化合物 ； 测试细胞生长对候选化合物和对照化合 物的反应 ； 以及观察候选化合物和对照化合物之间的细胞生长差异 ； 其中导致细胞生长中 的阳性变化的候选化合物被鉴定为增强神经突增生的化合物。 该方法中使用的神经突宿主 细胞可以是 Neuroscreen 1 细胞， 小鼠海马神经元， 或成神经细胞瘤 Neuro2a 细胞。该宿主 细胞可以进一步包含 CREB 报道构建物， 并且候选化合物也上调 CREB 报道构建物。
在实施方案的一个方面， 选择增强 CREB 途径功能的候选化合物的步骤包含 ： 使包 含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的宿主细胞与候选化合物进行接触， 从而产生测 试样品 ； 使该测试样品与亚适量的 CREB 功能刺激剂接触 ； 确定已经与所述测试化合物和所述 CREB 功能刺激剂接触的所述宿主细胞内的指示物活性 ； 将该指示物活性和对照细胞内 的指示物活性进行比较， 所述对照细胞已经接触了所述 CREB 功能刺激剂而未接触所述测 试化合物 ； 如果 1) 相对于接触了所述 CREB 功能刺激剂而未接触所述测试化合物的所述对 照细胞内的指示物活性， 步骤 c) 中所确定的指示物活性升高 ； 以及 2) 相对于未接触所述 CREB 功能刺激剂和未接触所述测试化合物的对照细胞中的指示物活性， 未接触所述 CREB 功能刺激剂而接触了所述测试化合物的对照细胞内的指示物活性没有显著不同， 则选择所 述测试化合物。
在实施方案的另一个方面， 进一步包含 ： 使用步骤 e) 中所选择的所述测试化合物 一个范围的不同浓度来重复步骤 a) 到 e) 的步骤 ； 如果 ： 1) 相对于已经接触了所述 CREB 功 能刺激剂而未接触所述测试化合物的所述对照细胞内的指示物活性， 在该范围的不同浓度 的所述测试化合物中的指示物活性升高 ； 和 2) 相对于未接触所述 CREB 途径功能刺激剂和 未接触所述测试化合物的对照细胞内的指示物活性， 未接触所述 CREB 功能刺激剂而被引 入了所述范围的不同浓度的所述测试化合物的对照细胞内的指示物活性没有显著不同， 则 选择所述测试化合物， 从而选出候选化合物 ； 使神经来源的细胞与步骤 g) 中所选择的所述 候选化合物以及与亚适量的 CREB 功能刺激剂进行接触 ； 在接触了所述候选化合物和所述 CREB 功能刺激剂的细胞内对内源 CREB 依赖性基因表达进行评估 ； 将步骤 i) 中所评估的内 源 CREB 依赖性基因表达与已经接触了所述 CREB 功能刺激剂而未接触所述候选化合物的对 照细胞中的内源 CREB 依赖性基因表达进行对比 ； 如果 ： 相对于已经接触了所述 CREB 功能 刺激剂而未接触所述候选化合物的对照细胞中的内源 CREB 依赖性基因表达， 步骤 i) 中所 评估的内源 CREB 依赖性基因表达升高 ； 以及 2) 相对于未接触所述 CREB 功能刺激剂和未接 触所述候选化合物的对照细胞内的 CREB 依赖性基因表达， 未接触所述 CREB 功能刺激剂而 接触了所述候选化合物的对照细胞内的内源 CREB 依赖性基因表达没有显著不同， 则选择 所述候选化合物， 从而选出经确认的候选化合物 ； 1) 将步骤 k) 中所选出的所述经确认的候 选化合物施用于动物 ； 在适合于在所述动物内产生长期记忆形成的条件下， 对被施用了所 述经确认的候选化合物的所述动物进行训练 ； 对步骤 m) 中训练的所述动物体内的长期记 忆形成进行评估 ； 以及将步骤 n) 中评估的长期记忆形成与未施用所述经确认的候选化合 物的对照动物内所产生的长期记忆形成进行对比。在另一个方面， 宿主细胞是人成神经细 胞瘤细胞而所述神经来源的细胞是神经元。神经元也可以是原代海马细胞。指示基因可以 编码荧光素酶。在另一个方面， CREB 功能刺激剂是毛喉素， 以步骤 e) 中选择的所述测试化 合物的一个范围的四种不同浓度来重复步骤 a) 到 e)， 或动物可以是哺乳动物。 附图说明 图 1A-C 显示了条柱图， 其表明了以相对光单位 (RLU) 测定的 CREB 过表达以及咯 利普兰对 CRE- 荧光素酶报道基因的作用。
图 2A-B 显示了条柱图， 其表明了 CREB 的增强减少了获得最大长期记忆所要求的 训练。
图 3A-C 显示了条柱图， 表明 CREB 增强剂对神经突长度的影响。
图 4A-B 显示了 HT-2175 和新 CREB 增强剂对小鼠海马神经元内神经突的增生以及 对海马记忆的作用。
图 5A-C 显示了条柱图， 表明 Gpr12 siRNA 对神经突增生和记忆的作用。
图 6A-D 显示了线图和条柱图， 表明 GalR3 受体拮抗剂 HT-2157 对神经突增生和情 景记忆 (contextual memory) 的作用。
图 7A-B 显示了条柱图， 表示出 GABA- 受体 (HT-1974) 和单胺氧化酶 B(HT-1060) 抑制剂对 NS1 细胞中神经突增生的作用
发明详述
本发明涉及基于细胞的筛选测定法， 其用于鉴定在正常和记忆受损个体中增强记 忆的化合物。分子研究已经开始解释生化记忆。记忆通常可以分为长期记忆 (LTM) 或巩固 记忆 (consolidated memory) 和短期记忆 (STM) 或工作记忆。该两种类型记忆间的一个显 著表型差异是 LTM 涉及新蛋白的合成。因而， 长期记忆的产生涉及与 STM 中所利用的那些 不同的生化途径。
本发明使用多步骤的筛选方法快速鉴定具有针对 LTM 获取中所涉及的生化途径 的活性的化合物。通过这些筛选方法所鉴定的化合物能够增强正常个体、 记忆受损个体或 两者的记忆。
本文描述的方法利用了在增强的记忆、 环腺苷酸 (cAMP) 应答元件结合 (CREB) 系 统以及神经突增生之间所观察到的相互关联。激活 CREB 途径和诱导神经突增生的化合物 被设想具有增强记忆， 尤其是 LTM 的效用。 CREB 途径测定
所述筛选方法的一个步骤涉及使用环腺苷酸 (CAMP) 应答元件结合 (CREB) 筛选系 统。任何能够监测或报告 CREB 途径活性升高的系统都可以用于所公开的方法。示例性的 系统在 U.S. 专利申请 No.10/527,950 名称为 “认知增强剂筛选方法” 的申请中有描述， 通 过引用将其全部内容并入本文。
在该方法中， 将包含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的宿主细胞与测试化 合物进行接触， 从而产生测试样品。该测试样品接着与亚适量的 CREB 功能刺激剂进行接 触， 并通过将宿主细胞中的指示物活性与对照细胞中的指示物活性进行比较来确定宿主细 胞中指示物的活性。
本文所述的方法可以用于鉴定或筛选增强 CREB 途径和促进神经突增生的化合 物， 其在本文中被称作记忆增强剂。所述的方法提供了基于细胞的高通量方法 ( 测定法 )， 以用于鉴定或筛选通过提高 CREB 途径功能而起作用的记忆增强剂。
记忆增强剂可以通过各种机制提高、 增强或改善 CREB 途径功能。例如， 记忆增强 剂可以影响信号转导途径， 其引起 CREB- 依赖性基因表达的诱导。CREB- 依赖性基因表达 的诱导可以通过例如上调 CREB 功能的正效应物和 / 或下调 CREB 功能的负效应物而实现。 CREB 功能的正效应物包括腺苷酸环化酶和 CREB 激活剂。CREB 功能的负效应物包括 cAMP 磷酸二酯酶 (cAMP PDE) 和 CREB 阻抑物。
记忆增强剂可以通过直接作用于 CREB 蛋白的激活剂或阻抑物形式和 / 或包含 CREB 蛋白的转录复合体， 或者生化作用于上述的上游， 来提高、 增强或改善 CREB 途径功能。 例如， CREB 途径功能可以通过以下方式而受到影响 ： 通过转录提高， 转录后提高或既转录 提高又转录后提高 CREB 蛋白水平 ； 通过改变 CREB 蛋白对转录复合体的其它必要组分如 CREB- 结合蛋白 (CBP 蛋白 ) 的亲和力 ； 通过改变包含 CREB 蛋白的转录复合体对启动子区内
DNA CREB 应答元件的亲和力， 或通过诱导针对 CREB 蛋白同种型的被动或主动免疫。 记忆增 强剂提高、 增强或改善 CREB 途径功能的特定机制对于实施本公开的方法并不是决定性的。
“提高 CREB 途径功能” 或 “增强 CREB 途径功能” 意思是提高、 增强或改善 CREB- 依 赖性基因表达的能力。 “调节 CREB 途径功能”意思是调节 CREB- 依赖性基因表达的能 力。CREB- 依赖性基因表达可以通过提高内源 CREB 产量而提高、 增强或改善， 例如通 过直接或间接刺激内源基因而产生升高的量的 CREB， 或者通过提高功能性的 ( 生物活 性 的 )CREB。 参 见， 例 如， U.S.Pat.No.5,929,223 ； U.S.Pat.No.6,051559 ； 和国际公开 No.WO96/11270(1996 年 4 月 18 号公开 )， 通过引用将其全部内容并入本文。 “提高功能性 的 ( 生物活性的 )CREB” 意思是包括提高 DNA 结合能力、 磷酸化状态、 蛋白稳定性， 亚细胞定 位等的能力。CREB- 依赖性基因表达可以通过提高或降低内源 CREB 的产生来进行调节， 例 如通过直接或间接刺激内源基因以产生升高的或降低的量的 CREB， 或通过提高或降低功能 性的 ( 生物活性的 )CREB。
在用于鉴定或筛选记忆增强剂的优选方法中包含基于细胞的方法， 其用于鉴定作 为记忆增强剂的候选化合物。
此种筛选的一个实例包含 ： (a) 使包含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的 宿主细胞， 与测试化合物以及与亚适量的刺激剂进行接触， 所述刺激剂将信号途径活化至 CREB 上 ； (b) 对接触了所述测试化合物和刺激剂的宿主细胞中的指示物活性进行确定 ； (c) 将步骤 (b) 中确定的指示物活性与接触了刺激剂而未接触测试化合物的对照细胞 ( 只接触 了刺激剂的对照细胞 ) 内的指示物活性进行比较 ； (d) 如果 (1) 相对于步骤 (c) 中对照细 胞内的指示物活性， 步骤 (b) 中确定的指示物活性在统计学上显著升高 ； 和 (2) 相对于既未 接触刺激剂也未接触测试化合物的对照细胞 ( 未接触任何试剂的对照细胞 ) 内的指示物活 性， 未接触刺激剂而接触了测试化合物的对照细胞 ( 只接触测试化合物的对照细胞 ) 内的 指示物活性没有统计学上的显著差异， 则选择该测试化合物 ； (e) 用步骤 (d) 中选择的测试 化合物以一个范围的不同浓度重复步骤 (a) 到 (d) ； 以及 (f) 如果 ： (1) 相对于只接触刺激 剂的对照细胞内的指示物活性， 所述测试化合物的该范围的不同浓度中的指示物活性成比 例地在统计学上显著升高 ； 和 (2) 相对于既未接触刺激剂也未接触测试化合物的对照细胞 内的指示物活性， 只引入一个范围的不同浓度的测试化合物的对照细胞内的指示物活性没 有显著差异， 则选择该测试化合物， 其中该测试化合物被鉴定为候选化合物。 在特定的实施 方案中， 如果 (1) 在测试化合物不同浓度的线性范围内， 指示物活性成比例地显著升高 ； 和 (2) 相对于既未接触刺激剂也未接触测试化合物的对照细胞内的指示物活性， 只引入所述 范围的不同浓度测试化合物的对照细胞内的指示物活性没有显著不同， 则在步骤 (f) 中选 择该测试化合物。 在另外一个实施方案中， 宿主细胞在接触刺激剂之前与测试化合物接触。
在一个可作替代的实施方案中， 筛选包括 ： (a) 使宿主细胞与测试化合物以及与 亚适量的刺激剂接触， 所述刺激剂将信号途径活化至 CREB 上 ； (b) 评估已经接触了测试化 合物和刺激剂的宿主细胞中内源的 CREB- 依赖性基因表达 ； (c) 将步骤 (b) 中评估的内源 CREB- 依赖性基因表达与接触了刺激剂而未接触测试化合物的对照细胞 ( 只接触了刺激剂 的对照细胞 ) 中的内源 CREB- 依赖性基因表达进行比较 ； (d) 如果 (1) 相对于步骤 (c) 中 的对照细胞内的内源 CREB- 依赖性基因表达， 步骤 (b) 中确定的内源 CREB- 依赖性基因表 达在统计学上显著地升高 ； 和 (2) 相对于既未接触刺激剂也未接触测试化合物的对照细胞( 未接触任何试剂的对照细胞 ) 内的 CREB- 依赖性基因表达， 未接触刺激剂而接触了测试 化合物的对照细胞 ( 只接触了测试化合物的对照细胞 ) 内的 CREB- 依赖性基因表达没有统 计学上的显著差异， 则选择该测试化合物 ； (e) 用步骤 (d) 中选择的测试化合物以一个范围 的不同浓度重复步骤 (a) 到 (d) ； 以及 (f) 如果 ： (1) 相对于只接触了刺激剂的对照细胞内 的 CREB- 依赖性基因表达， 一个范围的不同浓度的所述测试化合物的 CREB- 依赖性基因表 达成比例地在统计学上显著升高 ； 和 (2) 相对于既未接触刺激剂也未接触测试化合物的对 照细胞内的 CREB- 依赖性基因表达， 只引入了所述范围的不同浓度的测试化合物的对照细 胞内的 CREB- 依赖性基因表达没有显著地差异， 则选择该测试化合物， 其中该测试化合物 被鉴定为候选化合物。在特定的实施方案中， 如果 (1)CREB- 依赖性基因表达在测试化合物 不同浓度的线性范围成比例地显著升高 ； 和 (2) 相对于既未接触刺激剂也未接触测试化合 物的对照细胞内的 CREB- 依赖性基因表达， 只引入所述范围的不同浓度的测试化合物的对 照细胞内的 CREB- 依赖性基因表达没有显著差异， 则在步骤 (f) 中选择该测试化合物。在 另一个实施方案中， 宿主细胞在接触刺激剂之前与测试化合物接触。
优选地， 在初级筛选中使用的 “将信号途径活化至 CREB 上的刺激剂” 是 CREB 功能 刺激剂。CREB 功能刺激剂是能够刺激 CREB 途径功能的试剂。 “刺激 CREB 途径功能” 意思 是通过刺激内源 CREB 的产生而对 CREB- 依赖性基因表达进行刺激的能力， 例如通过直接或 间接刺激内源基因产生升高的量的 CREB， 或通过提高功能性的 ( 生物活性的 )CREB。参见， 例 如， U.S.Pat.NO.5,929,223 ； U.S.Pat.No.6,051559 ； 和 国 际 公 开 No.WO96/11270(1996 年 4 月 18 日公开 )， 通过引用将其全部内容并入本文。 “CREB 功能刺激剂” 包括药物， 化合 物， 离子化合物， 有机化合物， 有机配体， 包括辅因子， 糖类， 重组和合成肽， 蛋白， 拟肽， 核酸 序列， 包括基因， 核酸产物， 和其它分子以及组合物。CREB 功能刺激剂可以是腺甘酸环化酶 1(AC1) 的激活剂 ( 例如， 毛喉素 ) ； 细胞透膜体 cAWP 类似物 ( 例如， 8- 溴 cAW) ； 影响 G- 蛋 白偶联受体的试剂 ( 神经递质 )， 例如但不限于肾上腺素能受体和阿片样物质受体及其配 体 ( 例如， 异丙肾上腺素， 苯乙胺类 ) ； 细胞内钙浓度调节剂 ( 例如， 氯化钾， 毒胡萝卜内酯， N- 甲基 -D- 天冬氨酸 (NMDA) 受体激动剂 ) ； 负责 cAMP 分解的磷酸二酯酶的抑制剂 ( 拮抗 剂 )( 例如， 咯利普兰 ( 其抑制磷酸二酯酶 4)， 异丁基 - 甲基黄嘌呤 (IBMX)( 其抑制磷酸二酯 酶 1 和 2)。蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调节剂 ( 激动剂 )， 其介导 CREB 蛋白活化和 CREB- 依 赖性基因表达。CREB 功能刺激剂也可以是能够在中枢神经系统 (CNS) 中增强 CREB 功能的 化合物。这样的化合物包括但不限于， 影响膜稳定性和流动性以及特异的免疫刺激的化合 物。
活化至 CREB 上的信号途径包括促细胞分裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 信号途径和蛋 白激酶 A(PKA)。因而， 将信号途径活化至 CREB 上的刺激剂包括 MAPK/Erk 激酶 (MEK) 的抑 制剂。其它将信号途径活化至 CREB 上的刺激剂是已知的， 并且对于本领域技术人员是容易 获得的。
在另外一个实施方案中， CREB 途径筛选可以由使用果蝇的筛选方法代替， 其中所 述的筛选方法包括 ： (a) 将测试化合物施用于具有可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因 的果蝇 ； (b) 评估已经被施用了测试化合物的果蝇体内的指示物活性 ； 以及 (c) 将步骤 (b) 中评估的指示物活性和没有被施用测试化合物的对照果蝇体内的指示物活性进行对比。 相 比于未被施用测试化合物的对照果蝇体内的指示物活性， 步骤 (b) 中的指示物活性在统计学上具有显著差异， 则将该测试化合物鉴定为候选化合物。
包含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的宿主细胞， 可以通过将包含可操 纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的 DNA 构建物导入细胞而进行制备。DNA 构建物可以 依照本领域已知的方法导入细胞 ( 例如， 转化， 直接摄取， 磷酸钙沉淀， 电穿孔， 粒子轰击 法， 使用脂质体 )。这些方法在， 例如， Sambrook 等的 Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第 2 版 (NewYork ： Cold Spring Harbor University Press)(1989) 和 Ausubel 等 的 CurrentProtocols in Molecular Biology(New York ： John Wiley&Sons)(1998) 中有更 详细的描述。
如本文中所用的细胞指的是动物细胞。该细胞可以是干细胞或体细胞。合适的动 物细胞是， 例如， 哺乳动物来源的。哺乳动物细胞的例子包括人 ( 例如 HeLa 细胞 )， 牛， 羊， 猪， 啮齿动物 ( 例如大鼠， 鼠 ( 例如胚胎干细胞 )， 兔等 ) 和猴 ( 例如 COS1 细胞 ) 细胞。 优选 的， 所述细胞是神经来源的 ( 例如成神经细胞瘤， 神经元， 神经干细胞， 神经胶质细胞等 )。 所述细胞也可以是胚胎细胞， 骨髓干细胞或其它祖细胞。 当细胞是体细胞时， 所述细胞可以 是， 例如， 上皮细胞， 成纤维细胞， 平滑肌细胞， 血细胞 ( 包括造血细胞， 红细胞， T 细胞， B细 胞等 )， 肿瘤细胞， 心肌细胞， 巨噬细胞， 树突细胞， 神经元细胞 ( 例如神经胶质细胞或星形 胶质细胞 ) 或经病原体感染的细胞 ( 例如， 感染了细菌， 病毒， 拟病毒， 寄生虫或朊病毒的那 些 )。所述细胞可以由商业获得或来自保藏机构或直接从动物获得， 例如活检。
包含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的果蝇可以如 Belvin 等在 Neuron， 22(4) ： 777-787(1999) 中描述的那样产生。
包含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的 DNA 构建物可以如， 例如， Ausubel 等在 Current Protocols in Molecular Biology(New York ： JohnWiley&Sons)(1998) 和 Sambrook 等的 Molecular Cloning ： A LaboratoryManual， 第 2 版 (New York ： Cold Spring Harbor University Press) 中描述的那样制备。
如本文中所用的术语 “启动子” 指的是通常在结构基因的编码区上游 (5’ ) 的 DNA 序列， 其通过为 RNA 聚合酶和转录起始可能需要的其它因子提供识别和结合位点来控制编 码区的表达。CRE 启动子是本领域已知的。
如本文中所用的术语 “指示基因” ， 指的是其产物易于测定的核酸序列， 例如， 通 过比色法作为酶反应的产物如编码荧光素酶的基因。广泛使用的指示基因的其它例子包 括编码酶的那些， 例如 β- 半乳糖苷酶， β- 葡糖苷酸酶和 β- 葡糖苷酶 ； 发光分子， 例如 绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶 ； 以及营养缺陷标记， 例如， His3p 和 Ura3p。参见， 例如， Ausubel 等， CurrentProtocols in Molecular Biology(New York ： John Wiley&Sons)， 第 九章 (1998)。
接触测试化合物和 / 或 CREB 功能刺激剂的细胞 ( 例如， 宿主细胞， 神经来源的细 胞， 等 ) 将摄取所述测试化合物和 / 或 CREB 功能刺激剂。
“CREB 功能刺激剂的亚适量” 的意思是将 CREB 途径功能刺激 ( 诱导 ) 到内源 ( 基 态 ) 水平以上所需的 CREB 功能刺激剂的量或剂量， 从而可以测定由记忆增强剂诱导的 CREB 途径功能进一步在统计学上的显著升高， 并且该测定并不归因于天然细胞波动或作为天然 细胞波动结果的变异。CREB 功能刺激剂的亚适量是这样的剂量或浓度， 其中效应量 ( 指示 物活性， CREB- 依赖性基因表达 ) 与该剂量或浓度成比例， 并且当该剂量或浓度变化时， 效应量不变。CREB 功能刺激剂的亚适量凭经验确定并根据多种因素发生变化， 包括特定 CREB 功能刺激剂的药物动力学特征以及所要接触的特定细胞。例如， 确定 CREB 功能刺激剂的亚 适量可以通过 (a) 使包含可操纵地连接于 CRE 启动子的指示基因的宿主细胞的不同样品与 不同浓度的 CREB 功能刺激剂进行接触 ； 以及 (b) 通过评估宿主细胞样品中的指示物活性来 确定影响指示物活性从基态到最大反应所需的 CREB 功能刺激剂的浓度范围。CREB 功能刺 激剂的亚适量可以是产生 (1) 指示物最大活性的 50％或更少和 (2) 天然细胞波动以上的 指示物活性的任何浓度。对 CREB 功能刺激剂的亚适量的确定是在本领域技术人员的能力 范围内的。 “将信号途径活化至 CREB 上的刺激剂亚适量” 意思是刺激 ( 诱导 ) 信号途径至 CREB 上所需的刺激剂的量或剂量。
“测试化合物的不同浓度的范围” 意思是测试化合物的 2 个或更多 ( 即， 2、 3、 4、 5 等 ) 不同浓度。选择的浓度范围通常在初步筛选步骤 (a) 中的测试化合物浓度的两侧。 “( 不同 ) 浓度的线性范围” 意思是这样的浓度， 其中在效应不再随浓度变化而变化之前， 其 效应 ( 指示物活性， CREB- 依赖的基因表达 ) 随浓度而升高。选择浓度范围在本领域技术 人员的能力范围内。
“功能性的 ( 生物活性的 )CREB” 意思是包括蛋白的 DNA 结合能力、 磷酸化状态、 蛋 白稳定性、 亚细胞定位等。 “CREB- 依赖性基因表达”在本文中也指 “CRE- 介导的基因表达” 。CREB- 依赖 性基因表达可以通过本领域已知的方法 ( 例如， RNA 印迹， 蛋白质印迹 ) 来确定。这样的 方 法 在， 例 如， Ausubel 等， Current Protocols InMolecular Biology(New York ： John Wiley&Sons)(1998) 和 Sambrook 等， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 第2版 (New York ： Cold SpringHarbor University Press(1989) 中有详细描述。
“内 源 CRE- 介 导 的 基 因”在 本 文 中 也 指 “内 源 的 CREB- 依 赖 性 基 因” 。这样 的基因在本领域是已知的， 并包括， 例如， c-fos， 前强啡肽， tPA 和脑源神经营养因子 (BDNF)(Barco， A. 等， Cell， 108(5) ： 689-703(2002))。CRE- 介 导 的 基 因 也 可 以 由 本 领 域技术人员使用本领域已知的和容易获得的方法进行鉴定 ( 参见， 例如， Ausubel 等， Current Protocols In MolecularBiology(New York ： John Wiley&Sons)(1998) 和 Sambrook 等， MolecularCloning ： A Laboratory Manual， 第 2 版 (New York ： Cold Spring HarborUniversity Press(1989))。
本发明的方法进一步包括使用附加的或次级筛选， 例如使用神经来源的宿主细胞 与 CREB 途径筛选中鉴定的候选化合物。在一个实施方案中， CREB 途径筛选中的宿主细胞 是正在增生的细胞， 例如成神经细胞瘤细胞， 而次级筛选中的细胞是非增殖， 已分化的神经 来源细胞 ( 如神经元 ( 例如， 原代海马细胞 ) 和神经胶质细胞 )。在特定的实施方案中， 初 级筛选中的 CRE- 介导的基因是 CRE- 介导的指示基因 (CRE- 介导的转基因 )， 而次级筛选中 的 CRE- 介导的基因是内源的 CRE- 介导基因。
在含有报道系统的宿主细胞内观察到的激活 CREB 途径的化合物被称为 “经确认 的活性化合物” 或 “候选化合物” 。候选化合物对内源的， CRE- 介导的基因表达 ( 内源的 CREB- 依赖性基因表达 ) 的作用可以通过例如以下方法来进行评估或评价 ： (a) 使神经元 ( 特别是海马细胞 ) 与经确认的活性化合物 ( 或候选化合物 ) 进行接触， 从而产生样品 ； (b) 使所述样品与亚适量的 CREB 功能刺激剂接触 ； (c) 对接触了经确认的活性化合物 ( 或候选
化合物 ) 以及 CREB 功能刺激剂的神经元中内源 CREB- 依赖性基因表达进行评估 ； 和 (d) 将 步骤 (c) 中评估的内源 CREB- 依赖性基因表达与接触了 CREB 功能刺激剂而未接触经确认 的活性化合物 ( 或候选化合物 ) 的对照神经元中的内源 CREB- 依赖性基因表达进行对比。 与对照细胞中的 CREB- 依赖性基因表达相比， 步骤 (c) 中评估的 CREB- 依赖性基因表达在 统计学上的显著差异将经确认的活性化合物 ( 或候选化合物 ) 鉴定为是对 CREB- 依赖性基 因表达有影响的， 并将其鉴定为确认的候选化合物。优选地， 相对于既未接触 CREB 功能刺 激剂也未接触经确认的活性化合物 ( 候选化合物 ) 的对照细胞 ( 未接触任何试剂的对照细 胞 ) 中的 CREB- 依赖性基因表达， 未接触 CREB 功能刺激剂而接触了经确认的活性化合物 ( 或候选化合物 ) 的对照细胞 ( 只接触了经确认的活性化合物 ( 或候选化合物 ) 的对照细 胞 ) 中 CREB- 依赖性基因表达没有获得显著差异。
如本文所述， 来自几种化学品类别的经确认的候选化合物和记忆增强剂通过记忆 形成的体内模型进行了改进。
要对其增强 CREB 途径功能的能力进行评价或评估的化合物， 例如药用制剂， 药 物， 化合物， 离子化合物， 有机化合物， 有机配体， 包括辅因子， 糖类， 重组和合成肽， 蛋白， 拟 肽， 核酸序列， 包括基因， 核酸产物和其它的分子和组合物， 可以依照本文的方法对其增强 CREB 途径功能的能力进行单独筛选， 或者一个或多个化合物可以同时进行测试。当测试化 合物的混合物时， 通过所述方法选择的化合物可以通过合适的方法 ( 例如， 色谱法， 测序， PCR) 进行分离 ( 视情况而定 ) 和鉴定。 也可以按照这些方法来确定在测试样品中存在具有 增强 CREB 途径功能能力的一个或多个化合物。要对其增强 CREB 途径功能能力进行筛选的 化合物的通常浓度为从约 10-9M 到约 10-3M。 通过组合化学合成或其它方法产生的化合物 ( 例如， 有机化合物， 重组和合成肽， 类肽， 核酸 ) 的大规模组合文库可以被测试 ( 参见例如， Zuckerman， R.N. 等， J.Med.Chem， 37 ： 2678-2685(1994)， 和其中引用的参考文献 ； 也参见， Ohlmeyer， M.H.J. 等， Proc.Natl. Acad.Sci.USA， 90 ： 10922-10926(1993) 和 De Witt， S.H. 等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90 ： 6909-6913(1993)， 涉及经标签标记的化合物 ； Rutter， W.J. 等， U.S.Pat.No.5,010,175 ； Huebner， V.D. 等， U.S.Pat.No.5,182,366 和 Geysen， H.M.U.S.Pat.No.4,833,092)。这些 文献通过引用将其全部内容并入本文。当从组合文库中筛选的化合物携带特定标签时， 通 过色谱方法鉴定个别化合物是可能的。
依照本文的方法， 也可以对化学品文库， 微生物培养基和噬菌体展示文库来进行 测试 ( 筛选 ) 其中能够增强 CREB 途径功能的一个或多个化合物的存在。
也对经确认的候选化合物进行评估以评价神经突增生。
神经突增生测定
筛选过程的另一个步骤涉及对经确认活性或候选化合物能力的确定， 所述能力显 示 CREB 途径活性以诱导神经突增生。多种神经突增生测定是本领域已知的， 其测定神经 突细胞突起所增加的长度。例如， U.S.PatentNo.7,282340 和 7,452,863， 通过引用将其全 部内容并入本文， 描述了神经突增生测定。 多种不同的细胞类型可以在所述测定中使用， 例 如， 源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的 PC12 细胞。 PC12 细胞已知为用作神经元分化的模型 系统。神经突增生测定的一个实施方案使用成神经细胞瘤细胞， 已知当其暴露于特定化合 物如 NGF 时， 发展出长轴突 - 样突起。
长期记忆形成
鉴定为提高 CREB 途径活性和诱导神经突增生的化合物继而被测试其影响长期记 忆形成的能力。 情景恐惧条件作用是评估 LTM 的方法的一个例子。 典型地来说， 长期记忆形 成测试使用动物模型进行， 包括 ： (a) 将上文讨论的测定中鉴定的有效量的经确认的候选 化合物施用给动物 ( 例如， 人类， 其它哺乳动物， 脊椎动物或无脊椎动物 ) ； (b) 在适合在动 物内产生长期记忆形成的条件下， 对施用了经确认的候选化合物的动物进行训练 ； (c) 评 估步骤 (b) 中训练的动物内的长期记忆形成 ； 和 (d) 将步骤 (c) 中评估的长期记忆形成与 未被施用经确认的候选化合物的对照动物内产生的长期记忆形成进行对比。 如果相对于对 照动物内所评估的长期记忆形成， 用经确认的候选化合物处理的动物内所评估的长期记忆 形成的增强是显著的， 则该经确认的候选化合物被鉴定为记忆增强剂。使用用于其它认知 功能障碍的行为方法 ( 模型 )， 用类似方法进行长期记忆筛选是可行的。
这些测定的组合使得可以鉴定出既刺激神经突增生也影响 CREB 途径的化合物。 能够影响这两个系统的化合物将会改善正常个体和患有各种记忆不足的个体的记忆。
提供下面的实施例用以说明， 但不限制本发明。
实施例 1 CREB 测定
构建了 CREB 活性测定。使用标准分子生物学技术， 用 CREB 表达或对照载体转染 Neuro2A 细胞。在存在或不存在毛喉素 (PKA 激活剂 ) 的情况下， 监测 CRE- 荧光素酶活性。 本实验的数据在图 1A 中显示。CREB 过表达导致 CRE- 报道构建物活化的升高 ( 每组 n ＝ * 3， 表明 p ＜ 0.05)。CRE- 荧光素酶报道分子因而测定了 CREB 途径的活化。在图 1B 中， 显示了咯利普兰对 CREB- 活化的作用。用 PDE4 抑制剂咯利普兰处理 Neuro2A 细胞， 并通过 CRE- 荧光素酶活化来监测 CREB 的活化。 咯利普兰激活 CREB- 依赖性转录， 将其鉴定为 CREB 增强剂 ( 每组 n ＝ 8， p ＜ 0.001)。
在 0.5μM 毛喉素存在的情况下， 测定了咯利普兰对 CREB- 活化的作用。用 PDE4 抑制剂咯利普兰处理 Neuro2A 细胞， 并在在 0.5μM 毛喉素存在的情况下， 通过 CRE- 荧光素 酶活化监测 CREB 的活化。再次， 以及与 CREB 过表达类似 ( 图 1A)， 咯利普兰激活 CREB- 依 赖性转录 ( 载体液 (vehicle)n ＝ 7， 咯利普兰 n ＝ 8， p ＜ 0.001)。这些数据将咯利普兰鉴 定为 CREB 增强剂。
实施例 2
CREB 增强和长期记忆
检测了施用 CREB 增强化合物对长期记忆 (LTM) 的作用。
将成年的年轻 (10-12 周大 )C57BL/6 雄性小鼠 (Taconic， NY) 用于生化和行为 实验。到达时， 将小鼠在标准实验室笼中分组居住 (5 只小鼠 )， 并维持 12 ∶ 12 小时的光 照 - 黑暗循环。实验总是在该循环的光照阶段进行。实验开始的前一天， 将小鼠在个别的 笼子中单独居住并维持到实验结束。除了训练和测试时间外， 小鼠随意进食水。
为评估情景记忆， 使用了经标准化的情景恐惧条件作用的任务 (Bourtchuladze 等， Cell 79(1) ： 59-68(1994))。在训练日， 开始非条件刺激 (US) 即持续 2 秒钟的 0.5mA 足电击之前， 小鼠被置于条件作用室 (MedAssociates， Inc.， VA) 中 2 分钟。在电击之间以 具有 1 分钟的试验间隔的方式重复 US。最后的训练试验后， 使小鼠在条件作用室中另外停
留 30 秒， 并继而被放置回它们原来的笼子。在训练后一天或四天测试记忆的保持。两个 时间点的结果相同。将小鼠置于同样的训练室内， 并通过定义为运动完全缺失的木僵行为 (freezing behavior) 评分来对条件作用进行评价。总测试时间持续 3 分钟。拍摄了每个 实验的进程。在每个实验对象之后， 实验仪器用 75％乙醇， 水彻底清洗， 干燥， 和通风。
小鼠用一个， 两个， 五个或十个情景条件作用的试验来进行训练。 4 天之后， 通过木 僵行为评分测试情景记忆。数据在图 2A 中显示。当与单独试验后的记忆相比时， 具有多重 试验的训练显著促进了情景记忆。5 次训练试验获得最大的记忆。接着， 小鼠接受弱训练 ( 两次试验 ) 来诱导次最大记忆， 或强训练 (5 次试验 ) 来诱导最大记忆。CREB 增强剂咯利 普兰或载体液在训练后立即被注射到海马内。训练之后 4 天通过木僵行为评分测试情景记 忆。 CREB- 增强剂咯利普兰剂量依赖性地促进弱训练之后的次最大化情景记忆， 但对强训练 后的最大记忆没有影响。因而， CREB 增强足以促进亚适度训练后的记忆形成， 但不影响最 大化记忆。
实施例 3
CREB 增强剂和神经突增生
测 定 了 CREB 增 强 剂 在 NS1 细 胞 内 对 神 经 突 赠 生 的 作 用。 On-targetsiRNA(Dharmacon Inc.Lafayette， USA) 用于体外测试 (NS1 细胞内的神经突增 生 )。根据产品说明书， 使用 Dharmafect 3 转染 Neuroscreen 1(NS1) 细胞 (Cellomics Inc.)。
将 Neuroscreen 1(NS1) 细胞在增湿的， 37℃， 5％ CO2 的培养箱内由 I 型胶原包被 2 的 75cm 塑料烧瓶 (Biocoat， Becton Dickinson) 中进行培养。将细胞在添加了 10％热失 活马血清 (Invitrogen)、 5％热失活胎牛血清 (Cellgro) 和 2mM L- 谷氨酰胺 (Cambrex) 的 RPIM 完全细胞培养基 (Cambrex) 中进行培养。为扩增， 将细胞用胰蛋白酶消化并在 80％融 合时分瓶。每 2 到 3 天更换细胞培养基。
如 同 其 正 被 传 代 一 样 来 收 获 NS1 细 胞， 并 接 着 使 用 库 耳 特 计 数 器 (Becton Dickinson Coulter Z1) 计数。将细胞以 200μl 体积的每孔 2000 个细胞的密度接种到由 I 型胶原包被的 96 孔板中。RPMI 培养基添加了 200ng/ml 的神经生长因子 (NGFβ， Sigma)。 NS1 细胞被温育 72 小时以允许分化为神经元表型。 NGFβ 接着被稀释到 50ng/ml， 并且将细 胞分别用指示剂量的 siRNA 或化合物处理。
使用 Cellomics ArrayScan II Vti HCS 扫描器对神经突增生进行测定。根据说 明书， 细胞使用 HitKitTMHCS 反应物试剂盒 (Cellomics) 染色。该测定基于免疫荧光， 使用 已经验证特异地标记神经突和神经元细胞体的抗体。简短地， 细胞在 3.7％的甲醛中固定， 并且细胞核用烟酸己可碱染料染色。细胞接着在神经突增生缓冲液中清洗， 并且神经突由 用于神经突增生高含量筛选的 Cellomics′专用初级抗体进行染色。与该初级抗体温育 1 小时后， 细胞再次被清洗， 接着与荧光标记的二抗溶液温育 1 小时。抗体染色的 96 孔板在 黑暗中储存于 4℃直至扫描。使用 Cellomics ArrayScan II Vti HCS 扫描器扫描平板。该 神经突增生测定使用两个通道进行扫描。通道 1 探测烟酸己可碱染料并通过软件鉴定细胞 以及用于自动聚焦来进行使用。通道 2 探测二抗的 FITC 荧光并通过软件来计算关于神经 突所产生的所有数据而进行使用。
在第一组实验中， 检测了针对 PDE4d( 咯利普兰靶标 ) 的 siRNA 对于 NS1 细胞中神经突增生的作用。NS1 细胞用单独载体液 (Dharmafect 3)、 非靶向对照 siRNA、 或 PDE4d siRNA 来进行处理， 并在 48 小时后测定神经突长度。这些实验的数据在图 3A 中显示。相较 于单独载体液， 用 PDE4dsiRNA 处理的 NS1 细胞具有显著更长的神经突。相反， 非靶向对照 siRNA 对神经突增生没有影响。这些发现表明击倒 PDE4d(CREB 增强剂咯利普兰的靶标 )， 促进了神经突的增生。
下一组实验检测了 CREB 增强剂咯利普兰在 NS 细胞中对神经突增生的作用。在 5μM 毛喉素存在情况下， NS1 细胞用载体液或增量的咯利普兰处理。结果在图 3B 中显示。 咯利普兰剂量依赖性地提高神经突增生， 其通过 NS1 细胞中神经突的长度增加来测量。
CREB 增强剂咯利普兰在 NS 细胞中对神经突增生的作用。 在 5μM 毛喉素存在的情 况下， NS1 细胞用载体液或增量的咯利普兰进行处理。咯利普兰剂量依赖性地提高神经突 增生， 其通过 NS1 细胞中神经突分支点的增加来测量。所有的实验都显示 8 个实验重复孔 ( 每个测量至少 100 个 NS1 细胞的神经突长度 ) 的 MEAN+/-SEM。
实施例 4
CREB 增强剂对小鼠海马神经元中神经突增生以及对海马记忆的作用
为了海马体内咯利普兰注射或 Cpr12siRNA 处理， 小鼠用 20mg/kg 的三溴乙醇麻 醉并用 33- 口径 (gauge) 的引导插管 (guide cannula) 双侧植入背侧海马体 ( 坐标 ： A ＝ -1.8mm， L ＝ +/-1.5mm 至 1.2mm 的深度 )(Franklin 和 Paxinos， 1997)。手术恢复后 5 到 9 天， 动物被注射药物或载体液对照。使用通过聚乙烯管连接于微型注射器的输注插管， 将 2μl 药物或载体液注射入每个海马体。整个输注流程耗时约 2 分钟， 并且轻柔地处理动物 以使应激最小化。
将 HT2175 溶解于载体液并在训练前 20 分钟以指示的剂量腹腔内施用 (I.P.)。 对 照动物只接受载体液。对于每个训练和药物注射过程， 使用未接受实验的动物组。对于海 马体内咯利普兰的注射， 将 1μl 指示剂量的咯利普兰 ( 溶于 0.1％ DMSO 的 PBS 中 ) 在行为 训练之后立即注射。
为评估情景记忆， 使用经标准化的情景恐惧条件作用任务 (Bourtchuladze 等， Cell 79(1) ： 59-68(1994)。在训练日， 在进行非条件刺激 (US) 即持续 2 秒钟的 0.5mA 足电 击之前， 小鼠被置于条件作用室中 (Med Associates Inc.， VA)2 分钟。电击之间以具有 1 分钟的实验间隔的方式重复 US。在最后的训练试验后， 使小鼠在条件作用室中另外停留 30 秒， 并继而被放置回它们原来的笼子。在训练后一天或四天测试记忆的保持。两个时间点 的结果相同。将小鼠置于同样的训练室内， 并通过定义为运动完全缺失的木僵行为评分来 对条件作用进行评价。总测试时间持续 3 分钟。拍摄了每个试验的进程。在每个实验对象 之后， 实验仪器用 75％乙醇， 水彻底清洗， 干燥， 和通风。
所有的行为实验都以平衡形式设计和实施， 意思是 (i) 对于每种实验条件 ( 例如， 特定的剂量 - 效应 )， 我们使用相同数目的实验和对照小鼠 ； (ii) 每种实验条件重复几次， 并且重复的日子相加以产生受试个体的最终数目。每个工作时段的过程都被拍摄下来。在 每个实验中， 实验者不知道 ( 盲的 ) 训练和测试过程中对个体的处理方式。使用软件包 (StatView 5.0.1 ； SAS Institute， Inc) 通过 Student’ s 非配对 t 检验分析数据。生化数 据通过 ANOVA 进行分析。除非另有指明， 文本和附图中的所有值都表示为 MEAN+SEM。
图 4A-B 显示了 HT-2175 和一种新的 CREB 增强剂对小鼠海马神经元中神经突增生长以及对海马记忆的作用。图 A 显示了咯利普兰和 HT-2175 对海马神经元中的神经突增生 的作用。小鼠海马神经元培养 3 天， 并继而用 HT-2175 或咯利普兰处理 24 小时。HT-2175 和咯利普兰促进神经突增生， 其通过每个神经突的分支点的显著增加来测量。显示了 8 个 实验重复孔 ( 每个测量至少 100 个神经元的神经突长度 ) 的 MEAN+/-SEM。图 4B 显示了 HT-2175 对弱行为训练 ( 两次试验 ) 诱导的情景记忆的作用。小鼠用 HT-2175 或载体液处 理， 并继而在情景条件作用中进行训练。如通过其对小鼠海马神经元中神经突增生的作用 所预期的那样， HT-2175 剂量依赖性地促进情景记忆。
实施例 5
Gpr12 siRNA 对神经突增生和记忆的作用
体内 siRNA 注射用于研究 Gpr12 siRNA 对神经突增生和记忆的作用。体内等级 的 siSTABLE siRNA(Dharmacon Inc.， Lafayette， USA) 被用于评估 Gpr12 在小鼠 CNS 中 的功能。siRNA’ s 被化学修饰以增强稳定性。21 聚体的 siSTABLE 非靶向 siRNA 被用作 对照。开始的测试使用 bDNA 测定 (QuantiGene bDNAassay 试剂盒， Bayer)， 几个未修饰的 (siGENOME) 针对 Gpr12 的 siRNA， 在体外利用 Neuro2a 细胞进行。siRNA 使用多组分合理设 计算法 (Reynolds 等， 2004) 进行设计， 并通过 BLAST 检索控制其针对 Gpr12 的特异性。下 面的 siRNA 被选择出来用于进一步在体内鉴别 ： Grp12 siRNA2 有义链 GAGGCACGCCCAUCAGAUAUU(SEQ IDNO ： 1)
Grp12 siRNA2 反义链 UAUCUGAUGGGCGUGCCUCUU(SEQ IDNO ： 2)
非靶向 siRNA 正义链 UAGCGACUAAACACAUCAAUU(SEQ IDNO ： 3) 和
非靶向 siRNA 反义链 UUGAUGUGUUUAGUCGCUAUU(SEQ IDNO ： 4)
针对 Gpr12 的 siSTABLE siRNA 和非靶向对照 siRNA 在 5 ％葡萄糖中被稀释到 0.5μg/μl， 并与 6 当量 22kDa 的线性聚乙烯亚胺 (Fermentas) 混合。在室温温育 10 分 钟后， 使用通过聚乙烯管连接于微型注射器的输注插管， 将 2μl 注射入每个海马体。整个 输注过程耗时约 2 分钟， 并且轻柔处理动物以使应激最小化。在 3 天的时间内总共提供了 siRNA 的 3 次输注 ( 每个海马体每天 1μg siRNA)。
NS1 细胞用 Gpr12 siRNA 或非靶向对照 siRNA 处理 48 小时。将神经突长度与 经载体液单独处理的细胞和未处理细胞进行比较。当以增加的神经突长度来测量时， Grp12siRNA 显著增强了神经突增生。非靶向对照 siRNA 或单独的载体液对神经突长度没 有影响。该结果在图 5A 中显示。显示了 8 个实验重复孔 ( 每个测量至少 100 个 NS1 细胞 的神经突长度 ) 的 MEAN+/-SEM。图 5B 显示了 Gpr12siRNA 对分支点的作用。NS1 细胞用 Gpr12siRNA 或非靶向对照 siRNA 处理 48 小时。将神经突长度与载体液单独处理的细胞以 及未处理细胞进行比较。当以增加的分支点数目来测量时， Gpr12siRNA 显著增强了神经突 增生。非靶向对照 siRNA 或单独的载体液对分支点没有影响。显示了 8 个实验重复孔 ( 每 个测量至少 100 个 NS1 细胞的神经突长度 ) 的 MEAN+/-SEM。图 5C 显示了 Gpr12siRNA 对记 忆的作用。小鼠被重复注射 Gpr12siRNA(n ＝ 20) 或对照 siRNA(n ＝ 19) 到海马体内， 接着 使用弱训练样式 ( 两次试验 ) 在情景恐惧条件作用中进行训练。 24 小时后通过木僵行为评 分来评估记忆。正如从其对神经突增生的作用所预期的那样， Gpr12siRNA 促进情景记忆。
实施例 6
GalR3 受体拮抗剂 HT-2157 对神经突增生以及情景记忆的作用
显 示 了 每 个 药 物 剂 量 的 8 个 实 验 重 复 孔 和 每 个 载 体 液 的 16 个 实 验 重 复 的 MEAN+/-sem。对于每个实验， 测量了最少 100 个细胞中的神经突增生。图 6A 显示了定量化 HT-2157 对 NS1 细胞内神经轴增生作用的数据。与 CREB 增强剂咯利普兰相似， HT-2157 促 进神经突增生， 其由每个细胞总神经突长度的增加来表明。图 6B 显示了定量化 HT-2157 对 NS1 细胞内神经轴增生作用的数据。HT-2157 促进神经突增生， 其由每个树突的分支点数目 的增加来表明。图 6C 显示了定量化 HT-2157 对小鼠海马神经元中神经突增生作用的数据， HT-2157 剂量依赖性地促进神经突增生， 其由分支点数目的增加来表明。图 6D 显示了关于 HT-2157 对情景记忆的作用的数据。 小鼠用指定剂量的 HT-2157 或用对照载体液处理， 并在 情景恐惧条件作用中以两次试验进行训练。 如从神经突增生测定中所预期的那样， HT-2157 剂量依赖性地促进情景记忆。
实施例 7
GABA- 受体和单胺氧化酶 B 抑制剂对 NS1 细胞中神经突增生的作用
冷冻保存的 NS1 神经元购自 Ottawa 大学。神经元在由多聚 -D- 赖氨酸包被的 96 孔板中， 于添加了 2％ B27， 500μM L- 谷氨酰胺和 1mM 丙酮酸盐的无血清 Neurobasal 培养 基中培养。 铺板密度为每孔 20,000 个神经元。 为了神经突增生测定， 将神经元培养 2-3 天， 并继而用咯利普兰， HT-2175 或 HT-2157 分别处理 24 小时。 图 7A 显示了特异性针对 GABA 受体 α5 亚单元的反激动剂 HT-1974 对 NS1 细胞中 的神经突长度的作用的定量化。 HT-1974 促进神经突增生， 其由 0.03μm HT-1974 的浓度下 神经突长度的增加来表明。图 7B 显示了单胺氧化酶抑制剂 HT-1060 对 NS1 细胞中神经突 长度的作用的定量化。 HT-1060 促进神经突增生， 其由神经突长度的增加来表明。 显示了每 个药物剂量和的 2 个实验重复以及载体液 (0.2％ DMSO) 的 MEAN+/-sem。对于每个实验重 复， 最少对 250 个细胞中的神经突增生进行测量。