抗人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域的单克隆抗体 及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及微生物工程领域，特别涉及一种人P-选择素凝集素-表皮生长因子(Lectin-EGF，L-EGF)功能域的单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
P-选择素(P-selectin)是一种分子量为140kD的I型膜糖蛋白，定位于血小板的α颗粒和内皮细胞Weibel-Palade小体内，全长由789个氨基酸残基组成。其N末端730个氨基酸构成胞外区，包括1个凝集素(Lectin)结构域、1个表皮生长因子(EGF)结构域和9个补体调节蛋白重复序列(SCR)结构域；C末端24个氨基酸构成跨膜区。此外35个氨基酸构成胞浆短尾(Johnston GI，Cook RG，McEver RP.Cloning of GMP-140，a granulemembrane protein of platelets and endothelium：sequence similarity to proteins involved in celladhesion and inflammation.Cell，1989，56(6)：1033-1044)。P-选择素属细胞粘附分子的选择素家族，其作为血小板/内皮细胞活化的标志和粘附受体，可介导白细胞与活化内皮细胞等最初粘附，是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。其正常情况下不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表达，使原先不表达的脏器也出现表达，故P-选择素参与免疫炎症损伤、血栓形成及肿瘤转移等多种病理生理过程，其过度或持续表达可成为某些脏器病变的标志，与诸多临床疾病有十分密切的关系。实验表明，抑制其表达及其细胞粘附已取得良好的抗炎、抗肿瘤转移等防治效果。为进一步探讨P-选择素的生物学功能及其在炎症等疾病机制中的作用，以及针对其抗粘附治疗意义，近年来P-选择素的分子结构与功能关系研究已引起人们重视。一般认为其胞外区Lectin结构域是P-选择素识别配基并介导细胞间粘附的主要活性部位，但还需胞外区中EGF结构域对其构型的稳定和调节，增强其粘附亲和力与特异性。故Lectin与EGF的共同区域Lectin-EGF可能是P-选择素分子识别和粘附的功能结构域(Mehta，P，Cummings，R.D，andMcEver，R，P.Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoproteinligand-1.J.Biol.Chem.1998，273：32506)，但目前尚未制得识别该功能域片段的特异性抗体，不能直接研究和证实Lectin-EGF(L-EGF)区域的功能。
【发明内容】
本发明地目的是为了解决上述课题，提供一种人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域的单克隆抗体；本发明的另一目的是提供其制备方法，尤其是生产该单克隆抗体的杂交瘤；本发明的再一目的是提供该单克隆抗体的应用。
本发明的特异性抗人P-选择素L-EGF功能域的单克隆抗体(PsL-EGFmAb)可按下述方法制得。
利用特异引物，通过RT-PCR从外周血血小板中扩增出人P-选择素的Lectin-EGF功能域基因，将其克隆至载体中，测序验证后转染大肠杆菌，经诱导表达了C端融合6×His的蛋白质；融合蛋白质经分离纯化后作为抗原，用该抗原免疫哺乳动物，应用杂交瘤技术，筛选阳性克隆，制备腹水及获得目的抗体。
其中，上述基因克隆所用的载体一般选用质粒，诸如pET42b(+)；转染的大肠杆菌可选用BL21。
上述杂交瘤技术包括按照常规方法免疫，例如皮内注射上述抗原蛋白来免疫哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞与哺乳动物如小鼠的骨髓瘤细胞融合。其中，所说的抗原免疫的哺乳动物较好选择那些在细胞融合中对将要使用的骨髓瘤细胞有适应性的动物，如小鼠，可选用Balb/c小鼠；而骨髓瘤细胞选用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；将上述免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，通过间接ELISA筛选阳性克隆；获得3株可稳定分泌抗L-EGF功能域单抗的杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1、F3和H5，其亚型分别为IgG2、IgG1和IgG3，轻链均为κ型，其中细胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1已于2003年10月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，获得保藏号为CCTCC-C2003012。
对本发明所获单抗的特性和功能进行了鉴定与检测表明：该单抗对LPS刺激活化的人脐静脉内皮细胞均有特异性结合反应，并可在体外阻断凝血酶激活的血小板与中性粒细胞间的粘附，表明本发明的单抗可特异性识别结合天然P-选择素，具有体外抗活化血小板与中性粒细胞粘附的功能；再深入研究表明所述的单抗对肾缺血再灌注损伤有一定的防治功能，为进一步应用此单抗进行揭示P-选择素的结构与功能关系，阐明P-选择素的生理、病理意义，进而为针对其的抗粘附调节与治疗提供手段。
另外，该抗体特异性针对人P-选择素L-EGF功能域，与现有抗P-选择素全长的单克隆抗体PsmAb相比，更具有免疫特异性，其抗粘附作用也更强。
本发明中的杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1于2003年10月4日保藏在位于中国武汉大学(邮编为430072)内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，获得保藏号为CCTCC-C2003012。
【附图说明】
图1为L-EGF基因的RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定的图谱，
M：标准分子量(maker)；1、2、3：L-EGF基因的RT-PCR产物。
图2为酶切和PCR扩增后的重组质粒的分析图谱，
M：DNA标准分子量；1：酶切后的重组质粒产物；2：PCR扩增鉴定的产物；3：pET42b(+)空质粒。
图3A为重组质粒在大肠杆菌中的表达产物的SDS-PAGE检测图谱；
M：蛋白标准分子量；1：IPTG前的菌样品；2：IPTG后的菌样品；3：经缓冲液C纯化后的蛋白；4：经缓冲液D纯化后的蛋白；5：经缓冲液E纯化后的蛋白；
图3B为纯化后的蛋白经Western blot的分析结果。
图4A为未刺激的血小板和中性粒细胞的状态图(400×)；
图4B为凝血酶刺激后的血小板和中性粒细胞的粘附状态图(400×)；
图4C为经凝血酶刺激的血小板预先用对照单抗处理后和中性粒细胞的粘附状态图(400×)；
图4D为经凝血酶刺激的血小板预先用本发明的单抗处理后和中性粒细胞的粘附状态图(400×)。
图5为生理盐水对照组肾缺血再灌注6h的组织照片(HE，×100)。
图6为PsmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(HE，×100)。
图7为PsL-EGFmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(HE，×100)。
图8为生理盐水对照组肾缺血再灌注6h的组织照片(×10,000)。
图9为PsmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(×10,000)。
图10为PsL-EGFmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(×10,000)。
图11为生理盐水对照组肾缺血再灌注6h P-selectin表达的免疫组化照片(×400)。
图12为PsL-EGFmAb组肾缺血再灌注6h P-selectin表达的免疫组化照片(×200)。
图13为重组质粒pET42b(+)-Lectin-EGF(pET42b(+)-L-E)构建示意图。
【具体实施方式】
在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。
1、下面所述实施例中的材料为：
1)质粒、菌株及主要制剂 质粒pET42b(+)为Novagen公司产品。大肠杆菌DH5α、BL21均为上海瑞金医院实验室保存；限制性内切酶(NdeI、HindIII)、T4 DNA连接酶、dNTP均为Promega公司产品；Pfu DNA聚合酶，DNA maker、琼脂糖为上海生工生物公司产品；FITC标记的羊抗鼠IgG、RNA抽提液Trizol、逆转录试剂盒、DMEM培养基、胎牛血清、完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂、PEG、HAT、HT均为GibcoBRL公司产品；鼠抗6×His单克隆抗体、PCR产物回收试剂盒及质粒纯化试剂盒，Ni2+-NTAsuperflow树脂为QIAGEN公司产品；HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为博亚公司产品；实验对照抗P-选择素全长单克隆抗体(PsmAb)获自中科院生物化学与细胞生物学研究所；ConA、LPS、TNF-α、胰酶、凝血酶购自华美生物技术公司；6％Dextran购自Sigma公司；2.5％戊巴比妥钠溶液购自上海化学试剂厂；BUN、Scr检测试剂购自上海医用化学研究所；免疫组化P-选择素单抗、链菌素抗生物素蛋白-生物素酶标法(labelled streptavidinbiotin，LSAB)试剂盒购自DAKO公司；3H-TdR、三氯醋酸、闪烁液、硝基氯化四氮唑蓝(NBT)、氧化型辅酶I(NAD+)、吩嗪二甲硫酸盐(PMS)购自上海仕博生物技术有限公司；乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、甲醛、戊二醛、IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇(PEG)、二硫苏糖醇(DTT)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)；3，3-二氨基联苯胺(DAB)等其他常规试剂均为市售进口或国产分析纯。
2)动物与细胞株8～12周龄Balb/c小鼠，雌性，20～25g/只，购自中科院上海动物实验中心；Wistar大鼠，均为雄性，体重为200～250g，购自中国科学院上海实验动物中心，实验前于本院动物房专人饲养1周，正常饮食；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0由上海市免疫研究所提供；脐静脉内皮细胞株ECV-304购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。
3) 自配试剂
(1)细胞培养液 将RPMI 1640补充20％灭活胎牛血清，加抗生素(青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml、二性霉素25mg/ml)，谷氨酰胺(200mmol/L)及丙酮酸钠(100mmol/L)配成完全培养液。
(2)次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷(HT)储存液(100×)
次黄嘌呤 136.1mg
胸腺嘧啶核苷 38.7mg
加双蒸水至100ml，在45～50℃水浴中溶解。过滤除菌，分装-20℃保存。
(3)氨基嘌呤(A)储存液(100×)
氨基嘌呤 1.76mg
双蒸水 90ml
1mol/L NaOH 0.50ml
加双蒸水至100ml，过滤除菌，分装-20℃保存。
(4)HAT培养液
完全RPMI 1640 98ml
100×HT储存液 1ml
100×A储存液 1ml
(5)HT培养液
完全RPMI 1640 99ml
100×HT储存液 1ml
(6)50％PEG液
选用的PEG分子质量4500，浓度为50％。将PEG高压灭菌30min，融化并冷却到50℃(仍是液体状态时)，加等量的无血清1640培养液，混匀后即分装-20℃保存。用前置37℃，CO2培养箱培养一夜。
(7)10％二甲亚砜(DMSO)冻存液
RPMI 1640中加入10％DMSO。临用前新鲜配置，或置于4℃冰箱(避光)备用，保存1个月左右。
(8)包被液(pH9.6的0.05mol/L碳酸缓冲液)
碳酸钠 1.59g
碳酸氢钠 2.93g
双蒸水 1000ml
(9)稀释缓冲液(含0.3％牛血清白蛋白(BSA)的pH7.4 0.02mol/L PBS缓冲液)
氯化钾 0.2g
磷酸二氢钾 0.2g
磷酸氢二钠·12H2O 2.9g
氯化钠 8g
双蒸水 1000ml
临用前加BSA
(10)洗涤液
同稀释缓冲液，但以0.05％Tween-20代替BSA。
(11)底物缓冲液
0.2mol/L磷酸氢二钠 25.3ml
0.1mol/L柠檬酸 24.7ml
双蒸水 100ml
(12)LB液体培养基
配置每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰化蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
氯化钠 10g
用5mol/L NaOH调pH至7.0
(13)TE缓冲液
10mmom/L Tris-Hcl，pH8.0
1mmom/L EDTA，pH8.0
(14)2×SDS上样缓冲液
10mmom/L Tris-HCl，pH6.8
20mmom/L DTT
4％SDS
2％溴酚兰
20％甘油
(15)红细胞裂解液成分为0.83％氯化铵，4℃保存
(16)10×RNA电泳缓冲液(MOPS 0.2mol/L，EDTA 0.01mol/L，NaAC 0.05mol/L混匀后用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，临用时以DEPC-H2O稀释)
(17)RNA上样缓冲液(成分有100％甲酰胺0.5ml、37％甲醛0.2ml、10×电泳缓冲液0.1ml、溴酚兰0.06ml，临用时配制)
2、主要仪器
1)低速离心机(日本HITACHI公司)
2)光学显微镜(日本OLYMPUS公司)
3)CO2培养箱(德国HERAEUS公司)
4)隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)
5)PCR仪(HEMA公司)
6)7020全自动生化仪(日本HITACHI公司)
7)H-800电子显微镜(日本HITACHI公司)
8)匀浆机(亚力恩公司)
9)低温台式离心机(HERAEUS公司)
10)SCR20BA低温离心机(HITACHI公司)
11)凝胶成像系统(TANNON公司)
12)垂直电泳及电转移装置(Bio-Rad公司)
13)β计数仪(PACKARD公司)
下面实施例中未特别指出的比例或百分比均为重量比或重量百分比。
实施例1总RNA抽提
1、正常人新鲜静脉血20ml(3.8％枸橼酸抗凝)，低速离心得富含血小板的血浆，用1/6(体积比)3.8％枸橼酸钠洗涤，离心得血小板。将离心得血小板通过旋涡混合使其悬浮于1ml TRizol液中。
2、于室温下静置5min，加入0.2ml氯仿，颠倒混匀后，室温静置3min。
3、10000g 4℃离心15min，将上层水相吸入一新离心管，加入等体积异丙醇，室温静置10min。
4、10000g 4℃离心10min，弃上清。用75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500g 4℃离心5min。
5、无菌干燥后用10-20μl无RNase的双蒸水溶解，用紫外分光光度仪测定RNA的纯度及含量，取RNA 4.5μl，5×甲醛凝胶电泳缓冲液2μl，甲醛3.5μl，甲酰胺10μl混合，65℃温育15min，加入2μl甲醛凝胶电泳缓冲液上样，5V/cm，电泳45min，鉴定RNA的完整性。
RNA含量(μg)＝稀释倍数×A260×40×原液(ml)
实施例2 RT-PCR扩增
以4μg实施例1所得之总RNA为模板，进行逆转录反应获得cDNA。以该cDNA链为模板，用上述引物进行PCR扩增得到人P-选择素Lectin-EGF区域474bp片段。
1、引物设计根据上述文献已报道的P-selectin基因序列和GeneBank(登录号M25322)并结合载体的多克隆酶切位点，在上、下游引物5’端分别加入限制性内切酶位点，引物序列如下，下划线部分为NdeI和HindIII酶切位点，引物由上海生工生物公司合成。
P1：L-E1 5’GGC CAT ATG TGG ACT TAT CAT TAC AGC AC 3’
NdeI
P2：L-E2 5’CGG AAG CTT CTC TCT CAG GTA TTC ACA T 3’
HindIII
2、RT-PCR
逆转录反应体系和反应条件
RNA(1.0μg/μl) 4μl
RandomHemx 2μl
DEPC-H2O 5.8μl
混匀后，65℃ 15min
5×RT缓冲液 4μl
DTT(0.1mol/L) 2μl
dNTP(25mmol/L) 0.2μl
RNA sin(40U/μl) 1μl
M-MLV逆转录酶(200U/μl) 1μl
混匀后，37℃ 1h，95℃ 10min
总体积 20μl
PCR反应体系
10×PCR缓冲液 2.5μl
dNTP(25mmol/L) 0.1μl
P1 0.2μl
P2 0.2μl
cDNA模板 3μl
ddH2O 18μl
pfu(2.5～5U/μl) 1μl
PCR反应条件：
94℃预变性5min后，按94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸10min。
3、PCR产物电泳取上述产物于2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/μl溴化乙锭)中进行电泳分析，100V，30min，紫外灯下观察上述RT-PCR产物染色条带，结果表明扩增片段的大小与预期的474bp相符(如图1所示)。
4、PCR产物纯化用QIAGEN quick-spin PCR纯化试剂盒回收PCR产物，具体过程详见试剂盒说明。
实施例3 重组质粒的构建(参考图13所示)
1、pET42b(+)质粒的大量抽提
采用QIAGEN公司Hispeed质粒大抽试剂盒进行。将保存的pET42b(+)质粒菌种接种于含30ug/ml卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中，37℃振摇培养12～16h。培养结束后，将150ml细菌培养液分装于4支大离心管中400rpm 4℃离心20min，弃上清，加入6ml Buffer P1(已加RNaseA)，使沉淀悬浮充分；加入6ml Buffer P2，轻轻上下颠倒5次使其混合均匀，室温放置5min；加入6ml Buffer P3轻轻上下颠倒5次使其混合均匀，将其倒入预先准备的过滤套管中，室温放置10min；同时准备Hispeed过滤柱并加入4mlBuffer QBT平衡，待液体重力落下排空，在离心套管中插入栓子均匀用力将溶液压入Hispeed过滤柱中，待液体重力落下排空；用20ml Buffer QC洗柱；更换新管，柱中加5ml Buffer QF洗脱DNA；移去柱，在管中加3.5ml异丙醇混合，室温放置5min，沉淀DNA；取一支20ml注射器，拔去栓子，将注射器与一个QIA滤器进行连接，并将混合物转移至注射器中，插入栓子均匀用力使混合物通过滤器；移开滤器，拔出栓子后再将滤器安装上，插入栓子，均匀用力使空气通过滤器并重复此步；用滤纸擦干滤器去除异丙醇；取一支5ml注射器，拔去栓子，将滤器与注射器连接，在注射器中加入1ml TEBuffer，插入栓子，将DNA洗脱入1.5ml离心管中；重复此步再次洗脱得产物，-20℃保存。
2、pET42b(+)质粒和PCR扩增的目的基因双酶切
双酶切体系：质粒和实施例2所得之PCR纯化产物各10μl，10×缓冲液2μl，内切酶各1μl，ddH2O 6μl，共20μl，37℃水浴4h。
3、酶切产物电泳回收纯化
将酶切产物经1％琼脂糖电泳，在紫外灯下迅速挖取含相应大小的目的基因片段和质粒的琼脂糖凝胶块(约100mg)，放入1.5ml离心管中，用QIAGEN凝胶回收试剂盒回收纯化。
操作步骤简述如下：每管中加入300μl缓冲液QG，50℃放置10min，每2min混摇一次直至完全溶解；检查混合物颜色为橙色，加3M醋酸钠(pH5.0)10μl，混合使其颜色变成黄色(同缓冲液QG)；由于pET42b(+)5.9Kb＞4Kb，L-E 474bp＜500bp，故在其管中加入100μl异丙醇增加产量，把样品转入回收柱中，13000rpm室温离心1min；弃液体，将回收柱放入收集管中，加500μl缓冲液QG至柱中，13000rpm室温离心1min；加750μl缓冲液PE至柱中，13000rpm室温离心1min；弃液体，空柱离心1min；将回收柱放入1.5ml Ep管中，在滤膜中心加30μl的Elution Buffer，静置1min后离心1min，所得即为回收产物，-20℃保存。
4、连接反应
将纯化的产物定量后，按目的基因片段与质粒摩尔数3∶1比例加样。10μl反应体系：T4DNA连接酶1μl，10×连接酶缓冲液2μl，加目的基因片段和质粒并补足水至10μl总量，16℃过夜。
5、重组质粒鉴定
上述连接反应得到重组原核表达质粒，定名为pET42b(+)-L-E。重组质粒经NdeI、HindIII双酶切，得目的片段。经限制性内切酶酶切后电泳，证实所插入片段与预期的结果相符(如图2所示)。另经DNA测序，克隆的基因片段与上述文献报道及GenBank(登录号M25322)的序列完全一致。
6、转化
采用氯化镁制备感受态细菌。取1ml对数生长前期DH5α细菌，5000rpm离心10min后去上清，加入100μl预冷的1×TSS致敏缓冲液(含10％PEG 8000，5％DMSO，50mmol/L MgCl2，pH6.5)悬浮细菌；冰浴5min后，加入5μl连接产物并混匀，继续冰浴30min；加900μl LB(20mmol/L葡萄糖)，37℃振荡培养1h，取200μl均匀涂布含Kan的LB平板上，37℃倒置培养16h。
7、质粒小量抽提
挑取单个菌落接种至5ml含Kan(原核)的LB中37℃振摇培养12h；取1ml菌液以12000rpm 4℃离心1min后去上清，加入100μl预冷的溶液I(含50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)悬浮细菌，再加入200μl新鲜配制的溶液II(含0.2mol/L NaOH，1％SDS)，轻柔混匀后加入150μl预冷溶液III(含3mol/L KCl，5mol/L醋酸)，充分混匀后置冰浴5min。12000rpm 4℃离心10min后取上清，等体积苯酚/氯仿/异戊醇(三者体积比为：25∶24∶1)抽提后，加入2倍体积无水乙醇，室温放置5min，12000rpm 4℃离心10min后70％乙醇洗涤沉淀，用30μl TE(含RNaseA 100μg/ml)溶解后，取适量经过双酶切后行1％琼脂糖电泳初步鉴定。
8)序列测定
取酶切鉴定正确的1ml菌液送上海基康生物技术有限公司测序。
9)克隆至原核表达载体
对测序验证后的pET42b(+)-L-E质粒进行提取，并按上述6法转化入表达菌BL21。
10)质粒在大肠杆菌中表达
将转化的BL21大肠杆菌接种于5ml LB培养液中，37℃活化过夜，次日将该菌液以2％体积比例接种于250ml LB培养基中，37℃培养3h后，取1ml菌液，测A600并收集菌体作为诱导表达前的对照，其余菌液中加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导3h后，测A600并收集菌体。
实施例4目的蛋白质的表达与纯化
1、表达蛋白提取与纯化
收集250ml实施例3所得之表达菌，将其悬浮于4ml缓冲液A(6mol/L GuHCl，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH8.0)中，经超声波破菌后，15000rpm/min 4℃离心15min，保留上清。取1ml Ni2+-NTAsuperflow(每ml树脂可吸附10mg 6xHis融合蛋白)与上清液37℃混合1h，用4ml缓冲液C(8mol/L Urea，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/LTris-HCL，pH6.3)洗脱杂蛋白。专一性吸附的6xHis融合蛋白分别用2ml缓冲液D(8mol/LUrea，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH5.9)和2ml缓冲液E(8mol/L尿素，0.1mol/L NaH2PO4，0.01mol/L Tris-HCL，pH4.5)进行洗脱。
2、表达蛋白的检测
采用SDS-PAGE和免疫印迹法进行检测蛋白。对诱导前、诱导后及纯化的样品按0.1A10ul PBS悬浮样品，加等体积2×SDS上样缓冲液，沸水浴3～5min，进行SDS-PAGE电泳。分离胶为15％，积层胶为5％，接通电源后，先50V电泳约1h，待样品进入分离胶后，调整电压为100V，电泳2.5h。随后将蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上。用诱导前作为对照。具体如下：
1)将转移缓冲液冷至4℃。
2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜：并用转移缓冲液湿润，放置15min直到没有气泡。
3)割4张普通滤纸其大小与胶尺寸相符，并将其浸泡在转移缓冲液中。
4)海绵在转移缓冲液中充分浸湿。
5)在转移槽中倒入200ml转移缓冲液。
6)电泳后，切取有用部分的胶并很快地转移至缓冲液中洗涤。
7)打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入：
①浸湿的海绵；
②两张用转移液饱和的滤纸；
③用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；
④放上硝酸纤维素膜；
⑤缓冲液饱和的滤纸；
⑥浸湿的海绵。
8)小心地合上转移槽的胶板，并立即放入转移槽中，倒入转移缓冲液，使浸没转移胶版。
9)插上电极，注意正负极方向，打开电泳仪开关调至80mA，过夜。
10)转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
免疫印迹膜的处理(0.5ml/cm)
1)用TBS缓冲液洗膜5～10min。
2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻轻摇动60min。
3)轻轻地转移掉封闭溶液，并用TBS溶液洗膜两次，悬浮洗膜一次，第二次10min。
4)加入1ml鼠抗6×His单克隆抗体(1∶50体积比稀释)第一抗体，置摇床上轻摇，室温下过夜。
5)弃第一抗体溶液，并用TBS洗3次，每次10min，置摇床轻轻摇动。
6)加入1ml HRP标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体(1∶50体积比稀释)第二抗体，将膜浸泡在此溶液中。置摇床上轻摇，室温放置4h。
7)弃第二抗体溶液，用TBS洗3次，每次10min。
8)最后用TBS溶液洗，以转移Tween-20。
9)取10ml底物DAB溶液，将膜浸入此溶液中至显色清楚为止。
BL21转化菌经IPTG诱导后表达的总蛋白质，经SDS-PAGE鉴定，在相对分子质量约16kD处有一明显的表达条带(如图3A所示)，与Lectin-EGF基因编码融合蛋白质的理论预期值相符。表达蛋白质经Ni2+-NTA superflow亲和柱纯化，纯度达90％以上。另取阳性条带蛋白质进行Western blot检测，结果显示在上述相同位置呈明显阳性结果(如图3B所示)。
实施例5动物免疫
8周龄健康雌性Balb/c小鼠2只，用自制的抗原即实施例4所得之纯化蛋白免疫3～4次，每次每只抗原量为50μg(加等量弗氏完全佐剂乳化)。初次用弗氏完全佐剂-抗原乳剂于足底及背部皮内多点注射，再次用弗氏不完全佐剂-抗原乳剂于腹股沟淋巴结及背部皮内免疫，融合前3d 50μg抗原尾静脉加强免疫一次。三次免疫间隔时间为10～15d。最后一次免疫3～4d后，经ELISA检测抗体阳性之后处死小鼠取脾细胞作融合用。
实施例6细胞融合、筛选及克隆化
1、细胞准备
1)脾细胞制备：在最后一次加强免疫后第3d，取小鼠的脾脏，置于无血清的1640培养液中，用注射器内栓将脾脏撵碎，通过尼龙网过滤，制备细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清后重悬于5ml血清1640培养液中，计数细胞浓度。
2)饲养细胞制备：于Balb/c小鼠腹腔先注射0.5ml石蜡油，4d后处死小鼠剖开腹膜，用5ml无血清1640培养液注入小鼠腹腔，清清晃动后抽出腹腔液，离心计数。用20％FCS(小牛血清)-1640调整细胞浓度至0.5～2×105/ml，立即种到96孔培养板内，0.1ml/孔，1×104/孔。
3)骨髓瘤细胞制备：选用小鼠骨髓瘤株SP2/0，收集对数生长期的骨髓瘤细胞，洗涤记数，调整浓度为4～5×105/ml，悬浮于无血清1640培养液中备用。
2、细胞融合
将脾细胞与SP2/0细胞以10∶1(细胞数比)混合，1000rpm离心5min，倾去上清，轻弹沉降下来的细胞团块，使之完全松散。以1ml移液管吸取50％PEG 1ml在1min内边搅拌边加入，加完后静置90s。之后以无血清1640培养液终止融合，开始时须缓慢加入(1ml/min)，而后逐渐加快，边加边搅，共加入10ml终止液。1000rpm离心7min，去除上清，继续下一步操作。从加入PEG开始融合到融合终止，整个过程须在37℃水浴下进行。
3、阳性克隆的筛选
1)细胞培养
将离心后的细胞团块轻轻弹散。待细胞完全松散后用HAT培养基重悬，加入到已用饲养细胞铺好的96孔板中，每孔100μl。置于37℃，5％(体积百分比)CO2的培养箱中培养。一周后，在倒置显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。观察后每孔补充100μl新鲜HAT培养基。待细胞生长至占培养孔底1/3面积时即可吸取培养液上清进行ELISA检测。
2)ELISA检测
以包被液将原核表达蛋白(抗原)浓度调为50ng/ml，每孔100μl包被酶标板，置于4℃过夜后甩干上清。
用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次5min，然后用1％BSA-PBS封闭液封闭，每孔200μl，室温放置2h。
倾去封闭液，同上洗涤，每孔加入100μl待检杂交瘤上清，于37℃孵育1.5h。
倾去未结合样品，洗涤后每孔加入1∶1000(体积比)稀释的羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)结合物100μl，于37℃孵育1h。
将多余的酶结合物洗去，同上洗涤。每孔加入100μl的底物反应液，室温显色10-30min后，每孔加入50μl的终止液(2mol/L H2SO4)终止反应。用酶标仪495nm测OD值，OD值大于阴性孔2倍以上者进行克隆化培养。
4、杂交瘤细胞的克隆化(单个细胞培养)
采用有限稀释法进行克隆化。
1)克隆当天制备饲养细胞，接种96孔板内，0.1ml/孔(2×104/孔)。
2)阳性细胞从培养板内轻轻冲洗下，计数。
3)用培养液连续稀释细胞悬液成10个细胞/ml接种加有饲养细胞的96孔板内，0.1ml/孔。
4)10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。
5)测得有抗体活性的阳性细胞孔时，再克隆，共进行3次。
经上述重复进行ELISA筛选及亚克隆，最后筛选出3株能稳定分泌抗P-选择素Lectin-EGF单抗(PsL-EGFmAb)的杂交瘤细胞株，分别为PsL-EGFmAb-CSRJZT-1(CCTCC-C2003012)、F3和H5。
实施例7单克隆抗体的制备及鉴定
1、腹水制备及抗体纯化
接种Babl/c小鼠前7～10d腹腔注射0.5ml石蜡油。将上述3株杂交瘤分别扩大培养后对Balb/c小鼠进行腹腔注射(2×107cell/只)，10～14d后收集腹水，腹水产量为4～6mL/只，2000rpm离心，5min，取上清，用Protein A Sepharose-4B柱纯化腹水中的单抗(沈关心，周汝麟主编，现代免疫学实验技术，第2版，湖北科学技术出版社，1998：51)，-80℃保存。
2、单抗筛选和亚类鉴定的结果及效价测定
利用罗氏公司Ig亚类测定试剂盒，检测上述3株阳性杂交瘤细胞的培养上清液，鉴定结果分别为IgG2、IgG1和IgG3，其轻链均为κ型；用间接ELISA法检测细胞培养上清液和腹水中单抗效价，抗原为Lectin-EGF融合蛋白质及非表达菌的蛋白质。
其中，间接ELISA法检测腹水抗体效价的步骤如下：
1)用稀释缓冲液将腹水依次稀释成体积比为1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400、1∶204800，设4个复孔。
2)将抗P-selectin单抗(实验对照PsmAb)依次稀释成体积比为1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400、1∶204800，设2个复孔。
3)以Lectin-EGF片段蛋白包被酶标板，采用间接ELISA法检测腹水抗体效价，腹水未纯化效价可达10-5，腹水经Protein A Sepharose-4B柱层析，纯化后抗体ELISA检测的效价可达10-6。
3、单抗的特性鉴定
1)一般性质
腹水经紫外测定蛋白浓度，CCTCC-C2003012、F3和H5产生的单抗蛋白质定量分别为16.71g/L、22.68g/L和22.32g/L。此外，ELISA检测结果表明，杂交瘤细胞培养上清液和腹水中单抗均能与融合蛋白质Lectin-EGF特异性结合，而不与非表达菌的蛋白质结合。
2)单抗与活化内皮细胞的结合
采用间接免疫荧光染色法和流式细胞仪(FACS)检测。分别取经LPS(50mg/L及100mg/L)刺激和未受刺激培养24h的内皮细胞ECV304(4×105/mL)，均分别与3株单抗和对照单抗(均1∶40体积比稀释)于4℃作用4h，再与二抗(羊抗鼠IgG-FITC)于4℃作用0.5h。最后用1％多聚甲醛-PBS固定细胞后上FACS分析结果。
经检测，3株单抗和对照单抗均可与经LPS刺激培养24h的ECV304细胞特异性结合(仅出现单一结合峰)。其中CCTCC-C2003012分泌的单抗与两种浓度LPS激活的细胞结合率分别为18.65％、29.25％，对照单抗为20.60％、31.59％，且随LPS浓度的增加，单抗与ECV304细胞结合率均也随之增加。
应用实施例1 PsL-EGFmAb对血小板与中性粒细胞粘附的影响
1、方法
1)分离血小板
取5ml正常人EDTA抗凝血，500rpm低速离心10min，得富含血小板血浆，3000rpm离心10min，弃上清得血小板(1×108/mL)。
2)分离中性粒细胞
于上述低速离心后得到的富含血细胞沉积物，加入2倍体积的PBS缓冲液和1/3体积的Dextran分离中性粒细胞，混匀后37℃孵箱放置15min，上层即富含中性粒细胞成分，加入红细胞裂解液至10ml，1000rpm离心10min，弃上清得中性粒细胞(1×107/mL)。
3)取分离的血小板(1×108/mL)20μl滴片制成细胞微孔片，与凝血酶(1U/mL)或PBS(阴性对照)于37℃孵箱作用10min，加1％多聚甲醛-PBS固定，用Tris(250mmol/L)中止固定15min；PBS缓冲液洗血小板3次后，再分别与3株单抗(1∶40体积比稀释)、对照单抗(1∶40体积比稀释)及1％BSA-PBS于37℃作用15min。然后加入中性粒细胞(1×107/mL)20μl作用30min后，置显微镜下观察结果。
2、结果
如图4A-4D所示，未受凝血酶刺激的血小板不与中性粒细胞粘附结合；经凝血酶激活后的血小板可与中性粒细胞明显结合；而预先用本发明的单抗和对照单抗分别处理后的血小板均不显示与中性粒细胞粘附结合。
3、结论
上述结果表明，本发明的单抗在体外具有阻断活化血小板与中性粒细胞结合的抗粘附功能。
应用实施例2 PsL-EGFmAb对中性粒细胞与内皮细胞粘附的影响
1、方法
1)人脐静脉内皮细胞株ECV-304置含10％小牛血清的1640培养液，37℃，5％CO2条件下培养，2d换液一次。收集细胞时，加入胰酶作用1min，见细胞收缩为圆形后，再加入含10％小牛血清的1640培养液终止消化，转移细胞至离心管中，2000rpm离心3min，去上清，打匀沉淀。调整细胞浓度至3～5×106/ml。
2)于96孔板中每孔加入上述细胞混悬液100μl，约含细胞3～5×105。37℃，5％CO2培养24h后观察细胞贴壁情况，如果细胞贴壁良好，则继续进行，反之重新开始。
3)于96孔板每孔加入TNF-α(终浓度为500U/ml)处理呈单层的内皮细胞，继续培养24h。
4)用生理盐水配制PsL-EGFmAb、PsmAb溶液。于含有ECV-304的96孔板中，分别按3个浓度(终浓度分别为0.01、0.05、0.1mg/ml)加入上述二种药物，5μl/孔，轻轻振荡后，37℃放置30min。
5)制备人外周血中性粒细胞
(1)取15ml正常人新鲜EDTANa2抗凝血，分成5管，1×PBS 1～2倍稀释。
(2)从底部轻缓加入Ficoll分离液2ml，避免破坏液面。
(3)2000rpm，低速离心30min，弃上清(血浆)与中层(淋巴细胞与Ficoll分离液)，收集富含红细胞与中性粒细胞的沉积物。
(4)加入2倍体积的PBS缓冲液和1/3体积的Dextran，混匀。
(5)置37℃孵箱放置30min。
(6)吸出上清，1500rpm，离心10min。
(7)弃上清，加入4℃预冷的红细胞裂解液至10ml，混匀后置4℃ 5min。
(8)1500rpm，离心10min，弃上清得中性粒细胞，用PBS洗涤，合并后计数，调整细胞浓度至3～5×106/ml。
(9)常规Gimsa染色，镜下观察，纯度应大于95％。
6)中性粒细胞与内皮细胞粘附实验：在步骤4)结束后，于96孔板内再加入中性粒细胞100μl(3～5×105个细胞/孔)，每组3复孔，置37℃，5％CO2孵育30min，用PBS洗去未粘附细胞。另设空白孔(只加内皮细胞，不行TNF-α刺激)和对照孔(加内皮细胞，行TNF-α刺激后再加中性粒细胞)。
7)加入0.25％虎红，100μL/孔，振荡后，室温作用30min。用自来水轻轻冲洗游离虎红后，再用1×PBS洗涤，稍干后，加PBS-乙醇(1∶1体积比)200μL/孔，振荡后，室温作用1h，酶标仪570nm测OD值。
计算方法：粘附量＝实验孔OD值-空白孔OD值
8)数据结果以均数±标准差表示，采用t检验。
2、结果
PsL-EGFmAb对中性粒细胞与内皮细胞粘附的影响(表1)
表1中性粒细胞与内皮细胞粘附试验检测结果
*与其他各组比较，P＜0.05；**在各浓度，与其他各组比较，P＜0.05；***在各浓度，与其他各组比较，P＜0.05。
3、结论
本实验利用TNF-α诱导血管内皮细胞活化，从而表达P-选择素，并介导与中性粒细胞粘附，藉此模拟体内急性炎症早期的反应状态。在此基础上，应用PsL-EGFmAb和对照单抗进行干预研究。研究发现，二种单抗处理组的细胞粘附量均少于生理盐水对照组(P＜0.05)，干预效果均随药物浓度的升高而增强。此外，在相同的浓度下，本发明的PsL-EGFmAb抗粘附效应均比对照单抗PsmAb强(两两比较，P＜0.05)。
应用实施例3 PsL-EGFmAb对大鼠肾缺血再灌注损伤的防治作用
粘附分子P-选择素通过介导中性粒细胞与内皮细胞粘附聚集，在缺血再灌注引起的肾组织损伤中起重要作用。下面应用实施例拟利用肾缺血再灌注大鼠模型，进一步观察和分析PsL-EGFmAb对再灌注肾损伤的防治作用，以评价该单抗在作为抗粘附作用药物中的应用价值。
1、方法
1)65只Wistar大鼠被随机分为治疗组和非治疗组，分别按不同再灌注时间(1、3、6、24h)再分为4组。
治疗组：每时间点10只。其中，PsL-EGFmAb和PsmAb治疗组各5只。
非治疗对照组：每时间点5只，以生理盐水对照。
另设5只作为假手术对照组(仅做麻醉、开腹，不阻断血流)。
2)大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型构建
2.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉，开腹，暴露肾脏。用无创伤微动脉夹夹闭左肾动脉，同时切除右肾，60min后移去微动脉夹，恢复灌注。治疗组均于恢复灌注前5min，于阴茎静脉分别注射PsL-EGFmAb及PsmAb，剂量均为2mg/kg，对照组于相同的时间阴茎静脉注射生理盐水1ml。实验组与对照组均分别按相应时相点于腹主动脉采血及取肾组织。
3)标本采集及检测方法
(1)血标本部分用于检测BUN、Scr；部分用于测定凝血酶原时间(PT)与部分激活凝血时间(KPTT)。
(2)取肾组织置10％甲醛中固定，常规切片和HE染色，光镜下观察肾组织病变情况。
(3)在400倍光镜下观察病理切片，每个视野选择10个肾小管评分，共选取皮质区域的5个不同视野，按50个肾小管累积评分。肾小管病理改变评分依据：①肾小管上皮细胞扁平(1分)；②刷状缘脱落(1分)；③间质水肿(1分)；④胞浆空泡形成(1分)；⑤细胞坏死(1～2分)；⑥肾小管管腔阻塞(1～2分)；⑦分值高代表损伤严重，单个肾小管损伤最高积分为10分，最低为0分。
(4)取肾组织置2％戊二醛固定，制片后，进行电镜观察，观察亚细胞结构的病理改变。
(5)免疫组化LSAB法检测肾组织中P-selectin表达。
主要操作步骤如下：
①组织切片经二甲苯脱蜡3次，每次20min；梯度乙醇水化(100％，95％，70％，50％乙醇各一档，每档2min)后，TBS漂洗5min，3次。
②3％过氧化氢孵育10min以清除内源性过氧化物酶活性。TBS漂洗5min，3次，
③滴加1∶20(体积比)稀释的正常兔血清，室温下孵育20min。抖掉并擦拭多余的血清。
④滴加1∶100(体积比)稀释的P-selectin全长单抗(一抗)，室温下孵育30min，4℃过夜。TBS漂洗3次，共5min。
⑤滴加1∶400(体积比)稀释的生物素化兔抗鼠免疫球蛋白(二抗)，室温下孵育30min。TBS漂洗3次，共5min。
⑥滴加1∶400(体积比)稀释的抗生物素化过氧化酶-链霉卵蛋白素复合物，室温下孵育30min。TBS漂洗3次，共5min。
⑦滴加0.05％DAB显色剂，室温下孵育2～10min。流水冲洗10～20min。
⑧苏木素复染5min，自来水冲洗20min。盐酸酒精分化，流水冲洗10～20min。
⑨切片经95％、100％乙醇各二档脱水，二甲苯二次透明，中性树胶封片。
⑩光镜下判定结果(阳性呈棕黄色颗粒)。
4)数据结果以均数±标准差表示，采用t检验。
2、结果
1)大鼠肾缺血再灌注24h的BUN与Scr变化(表2)
表2模型鼠BUN、Scr的变化
BUN(mmol/L) Scr(μmol/L)
假手术组 7.88±0.57 39.00±4.47
生理盐水组* 14.54±0.67 102.21±4.76
PsmAb组 9.3±0.50 50.05±4.18
PsL-EGFmAb组** 8.78±0.46 45.62±3.17
*与假手术组相比，P＜0.01；与各治疗组相比，P＜0.01；**与PsmAb组相比，P＜0.05。
2)缺血再灌注后肾组织病理学改变
(1)肉眼改变：缺血再灌注后，生理盐水对照组的大鼠肾脏皮质苍白、髓质瘀血，颜色深暗；治疗组则肾脏外观与假手术组接近。
(2)光镜改变：缺血再灌注后，生理盐水对照组的大鼠肾脏可见肾小管上皮细胞肿胀，出现明显的变性与坏死，肾小管阻塞，腔内有脱落细胞，间质有出血或充血水肿及大量炎细胞浸润，再灌注1h、24h较轻，3h与6h组病变较重；治疗组，光镜下仅见部分肾小管上皮细胞轻度肿胀、少量变性与坏死，肾间质无明显改变及炎细胞浸润(图5、6、7)。
(3)电镜改变：缺血再灌注1h后，肾脏即出现超微结构改变，3h后改变明显。生理盐水对照组出现严重的线粒体肿胀，排列紊乱；基底膜不完整；肾小管管腔狭窄，上皮细胞空泡变性，近曲小管上皮细胞内有明显的脂滴，核固缩多见；间质有较多白细胞浸润，以中性粒细胞为主，巨噬细胞亦可见到。抗粘附治疗组线粒体肿胀为轻度，形状尚清晰，排列较整齐；基底膜相对完整；肾小管管腔狭窄不明显，部分上皮细胞轻度空泡变性，近曲小管上皮细胞核固缩偶见；间质白细胞浸润较少，中性粒细胞少见(图8、9、10)。
3)肾组织P-selectin的表达
缺血再灌注1h，P-selectin即在肾组织中广泛表达，至24h仍有表达，包括肾小球系膜区、毛细血管、肾小管和肾间质等，其中以肾小管上皮细胞表达最为明显。经PsL-EGFmAb及对照单抗PsmAb治疗后，肾组织内基本未出现棕黄色颗粒，即基本未见P-selectin表达(图11、12)。
4)肾小管损伤评分(表3)
表3模型鼠肾小管损伤评分结果
1h 3h 6h 24h
假手术组 0 0 0 0
生理盐水组* 53.20±2.77 79.00±1.51 113.60±2.88 225.80±3.76
PsmAb组 41.00±1.56 65.00±1.53 83.60±3.78 164.60±3.21
PsL-EGFmAb组** 35.00±2.34 60.80±1.92 82.80±2.59 149.60±2.70
*在各时间点，生理盐水对照组与各治疗组相比，P＜0.05；**在缺血再灌注1、3、24h，与其他各组相比，P＜0.05；在6h点，与PsmAb组相比，P＞0.05。
5)两种药物对模型鼠PT、KPTT的影响(表4)
表4模型鼠PT、KPTT测定结果
PT(s) KPTT(s)
假手术组 13.4±1.7 17.9±2.9
生理盐水组 13.7±1.4 17.6±3.1
PsmAb组 13.4±1.3 17.3±2.9
PsL-EGFmAb组 13.5±1.2 17.2±3.0
各组间两两比较，P＞0.05。
3、结论
利用大鼠肾缺血再灌注损伤模型，再次证明P-selectin与肾缺血再灌注损伤关系密切。经两种单抗药物治疗后，P-选择素表达下调，肾组织内炎症细胞浸润减少，病理损伤相对较轻，肾小管损伤评分情况也与此趋势一致。进一步表明抑制P-选择素及其介导的细胞粘附，可阻抑白细胞粘附聚集、炎症介质释放等级联反应，从而减轻炎症反应与肾损伤，改善肾功能。显示了两种药物均有良好抗粘附防治效果，进一步比较后发现，在相同实验条件下，PsL-EGFmAb效果最佳，表明该功能域单抗可能更具靶向性。此外，上述实验也提示，本发明的单抗对机体凝血指标无明显影响，显示了使用安全性。
应用实施例4 PsL-EGFmAb对大鼠肾缺血再灌注损伤免疫防御功能的调节
1、方法
1)大鼠肾缺血再灌注损伤模型构建及标本采集的方法见应用实施例3。
2)有丝分裂原诱导的大鼠T细胞增殖实验。
(1)自肾缺血再灌注24h，取大鼠脾脏，制成细胞悬液。
(2)计数，用含20％胎牛血清的1640完全培养液，调整细胞浓度至1.0×106/ml。
(3)于96孔培养板中各孔加入含20％胎牛血清的1640完全培养液20μl，ConA(10μg/ml)或0.9％NaCl对照液20μl，各4孔。然后各孔加入上述细胞悬液100μl，加盖，置37℃，5％(体积比)CO2培养72h。
(4)每孔加入20μl 3H-TdR(相当于1μCi，特异性比活性为5Ci/mmol)，继续培养4h，用细胞收集器将细胞吸附在玻璃纤维滤纸片上，用生理盐水充分洗涤，洗去游离的3H-TdR。滴加5％三氯醋酸1～2ml固定细胞，并用无水乙醇脱水、脱色。
(5)将滤纸片烘干后，用镊子按顺序分别依次放入盛有4ml闪烁液的塑料管内。用β闪烁仪测定样品1min，将4份测定值中除去读数最高或最低者，取其平均值。
(6)计算实验组(加ConA)及对照组(加NaCl)每分钟脉冲数cpm值。
刺激指数(stimulating index，SI)：
3)LPS刺激B细胞增殖实验
(1)脾细胞悬液制备、计数及细胞浓度(1×106/ml)调整同上2)中的步骤(2)。
(2)于96孔培养板中各孔加入含20％胎牛血清的1640完全培养液20μl，100μl LPS(10μg/ml)或0.9％NaCl对照液20μl，各4孔。然后各孔加入脾细胞悬液100μl，加盖，置37℃，5％(体积比)CO2培养72h。
(3)培养至46h时，每孔加入50μl 0.1mCi/ml的3H-TdR，继续培养。
(4)收集细胞至玻璃纤维滤膜上，滤膜放烘箱内干燥。
(5)将滤膜于含5ml闪烁液的测量瓶中，β闪烁仪自动测定样品1min，将4份测定值中读数最高或低者除去，取其平均值。
(6)计算实验组(加LPS)及对照组(加NaCl)cpm值：
4)LDH酶释放法测定NK细胞活性
(1)底物溶液配制(临用前)：硝基氯化四氮唑蓝(NBT)4mg，氧化型辅酶I(NAD+)10mg，吩嗪二甲硫酸盐(PMS)1mg，加蒸馏水2ml溶解，混匀后取上液1.6ml加1mol/L乳酸钠0.4ml，然后加0.1mol/L、pH7.4的PBS至10ml。
(2)用完全1640培养液将脾细胞悬液调整浓度至1×107/ml，作效应细胞备用。
(3)取经24h培养的YAC-1细胞，用完全1640培养液洗涤1次，1000rpm，离心6min。去上清，用完全RPMI-1640培养液重悬后计数，并用0.5％台盼蓝染色检测活性，活细胞应＞95％，然后调整细胞浓度至1×105/ml，作靶细胞备用。
(4)用40孔细胞培养板，每样本3个复孔，每孔各加100μl靶细胞和效应细胞混匀。同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(靶细胞100μl+1％ NP-40液100μl)，100rpm低速离心2min后，置37℃，5％(体积比)CO2温箱培养2h。
(5)取出培养物，吸取各孔上清100μl加于另一反应板中，每孔加入新鲜配制的底物溶液100μl，置室温避光反应10～15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应。
(6)用酶标检测仪于570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。
5)数据结果以均数±标准差表示，进行t检验。
2、结果
1)T细胞功能的检测结果(表5)
表5模型鼠T细胞功能检测结果
T细胞活性(SI)
假手术组* 14.83±1.27
生理盐水组 5.76±2.45
PsmAb组 50.97±25.79
PsL-EGFmAb组** 51.56±19.91
*与其他各组相比，P＜0.01；**与生理盐水组相比，P＜0.05；与PsmAb组相比，P＞0.05。
2)B细胞功能的检测结果(表6)
表6模型鼠B胞功能检测结果
B细胞活性(SI)
假手术组* 8.37±0.32
生理盐水组 3.27±1.04
PsmAb组 3.63±0.50
PsL-EGFmAb组** 3.51±0.10
*与其他各组相比，P＜0.01；**与PsmAb组相比，P＞0.05。
3)NK细胞功能的检测结果(表7)
表7模型鼠NK细胞功能检测结果
NK细胞活性(％)
假手术组* 15.56±1.95
生理盐水组 27.04±3.79
PsmAb组 16.09±3.24
PsL-EGFmAb组** 15.72±0.28
*与生理盐水组相比，P＜0.01；与PsmAb组、PsL-EGFmAb组相比，P＞0.05；
**与PsmAb组相比，P＞0.05。
3、结论
由上述实验结果可见，大鼠肾脏缺血再灌注后，体内T、B细胞活性明显受抑，而NK细胞显著激活。提示在缺血再灌注应激损伤过程中，不同淋巴细胞据各自生物学功能产生了不同的免疫防御反应，可能与缺血再灌注损伤所致机体免疫防御机制改变有关。进一步发现，经单抗药物治疗后，大鼠T、NK细胞活性产生上调或下调，而B细胞活性变化不明显，但均未见细胞功能抑制。可能是因为经抗粘附治疗后，可调节或影响上述各具不同生物活性细胞的粘附分子选择素信号转导，以致产生不同调抑结果。故本研究提示，本发明的PsL-EGFmAb对肾缺血再灌注的抗粘附保护作用，可能与其同时兼有抗炎和免疫调节作用有关，但至少不会产生免疫抑制或降低机体抵抗力，从而进一步表明本发明的PsL-EGFmAb可能更具有潜在的临床应用前景。