说明书 骆驼蓬种子总生物碱的制备方法及应用 【技术领域】
本发明涉及到骆驼蓬总生物碱的提取纯化方法和所获得的产品的应用，属于药用植物有效部位的提取方法技术领域。
背景技术
骆驼蓬为蒺藜科多年生草本植物，喜生于路旁、河岸、戈壁、荒漠等干旱地区。骆驼蓬种子为维吾尔、哈萨克、藏族习用药材，收载于中华人民共和国卫生部药品标准(维吾尔药品标准WS3-BW-0080-98)，中国专利公开文献CN1104507A、CN1220162A、CN1299664A多为骆驼蓬制剂及制备方法；目前关于提取分离骆驼蓬总生物碱的方法，概括有以下几种：
①The alkaloid：SanKen(1952)所描述的用5％的醋酸浸提种子，用10％的氯化钠将醋酸盐转变为盐酸盐然后冷热反复处理即得。
②Brit：CA.1964.61：9365h系用乙醇渗漉回收乙醇水母液用乙醚脱脂，水沉用氨水调PH6.5加入硫酸铵，用焦炭过滤，加KI，再用含HI的焦炭处理，盐用10％的氨水处理即得。
③李春杰(新疆医学院学报1987 10(1)27-30)系用5％的盐酸浸提，酸液用阳离子树脂交换，用氨水碱花树脂，并用乙醚、氯仿或无水乙醇洗脱即得。
④利国威(中草药1988 19(1)2-4)系用95％的乙醇回流提取，浓缩至糖浆状，用稀盐酸转溶，氯仿脱脂后的酸液用氨水碱化，析出沉淀，即得
⑤张学农(新疆医学院学报1993 16(4)350-1)系用酸水与碱水交替煎煮合并溶液干燥即得。
⑥Munir等(Fitoterapia 1995 66(1)73-6)系用乙醇提取，提取液用氯化汞处理使去氢骆驼蓬碱与骆驼蓬碱以复合物沉淀下来，然后用H2S处理即得。
上述骆驼蓬提取方法中①法虽然工艺简单，但提取率不高，只是分离去氢骆驼蓬碱而丢失了其他生物碱且醋酸盐与盐酸盐转化不彻底；②法用乙醚萃取脱脂，工业化生产十分困难而危险；③法用H型阳离子交换树脂处理生物碱，树脂再生及预处理复杂，后续处理中用乙醚和氯仿，对环境不友好；④法稀盐酸转溶时不易进行，因为骆驼蓬种子中含有大量粘液质、树脂、树胶、脂肪油等，用稀盐酸不能充分接触生物碱，即使搅拌也较困难，而且酸水溶液过滤困难；⑤法酸水与碱水煎煮药材，尽管工艺简单，但浓缩干燥十分困难，因为随着浓缩地进行，溶液表面会形成厚厚的油膜状物质，使热利用率降低；喷雾干燥溶液易粘壁；⑥法用重金属和H2S处理，导致环境污染和人体毒害，不可取。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种低成本，高转移率，适合于工业化生产的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法及获得的产品，作为制备治疗癌症药物尤其是治疗人体消化系统肿瘤的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：这种骆驼蓬种子总生物碱的制备方法包括：
A、碱液浸润：将骆驼蓬种子粉碎成粗末，用PH＞8的碱性水溶液或碱性醇溶液，以1-3倍(W/W)的量浸泡8-12小时使之溶胀；
B、提取总生物碱：用PH＞8的碱性醇溶液加热回流提取3次以上；醇溶液用量为生药的3-10倍，每次提取时间为1-2小时，合并提取液；减压回收溶剂，浓缩至药液比重为1.01-1.3，过滤；
C、碱化游离：对B步骤中流浸膏，按照生药0.05-15％的重量比例加入石灰，60-80℃真空干燥48-96小时；水分控制在7％以下，粉碎成细末；
D、回流分离：将步骤C的浸膏粉，用甲酸乙脂、乙酸甲脂、乙酸乙脂、乙酸丁脂、丙酮其中的一种或几种溶剂进行回流提取游离总生物碱，回流2-3次，每次用量为浸膏的4-8倍，时间为1-2小时；
E、用硅藻土与活性炭组成的混合介质趁热进行减压过滤；60-80℃减压回收溶剂，并烘干；
F、转溶精制：对步骤D的浸膏加入醇溶液进行温浸或回流提取；用量为浸膏的2-6倍，次数为1-2次，每次1-2小时，合并上述醇溶液；再用步骤E中的介质进行过滤，然后减压回收溶剂；
G、水沉：将步骤F的母液进行水沉，加水量为30倍以上(重量/重量)，冷藏4小时以上，板框过滤，喷雾干燥。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法中用于浸润生药碱性溶液适用的碱包括氨水、K2CO3、KHCO3、Na2CO3、NaHCO3、KOH、NaOH、Ca(OH)2；乙胺、二乙胺、三乙胺、N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺，三甲基磷酰三胺。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法中所述醇溶液包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇的70-85％溶液。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法步骤B中还可用慢速渗漉代替回流提取，碱性醇溶液用量为生药的20倍以上；直至无明显的生物碱反应为止；合并提取液。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法所述步骤D中优选乙酸乙酯回流提取游离总生物碱。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法所述步骤E中硅藻土与活性炭组成的混合介质比例为1∶1。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法，将所述步骤F的醇溶液按照药料比为1∶6以上的比例在饱和的β-环糊精/羟丙基β-环糊精溶液中进行高速搅拌2小时以上，停止搅拌冷藏4小时以上，倾出上层清液，过滤即得β-环糊精/羟丙基β-环糊精包合物。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法获得的去氢骆驼蓬碱达到50％以上。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法获得的提取物或包合物，作为制备治疗癌症药物的应用，可与临床上可接受的药用辅料进行配伍制备口服制剂，注射制剂。
所述的骆驼蓬种子总生物碱的制备方法获得的提取物或包合物，作为制备治疗人体消化系统的肿瘤，如胃癌，食道癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、舌癌、胆癌、胆管癌、胰腺癌、喉癌药物的应用，可以用于制备滴丸、片剂、胶曩、颗粒剂、乳剂、注射用粉针剂，混悬剂。
本发明的一个重要特点是在浸润、提取、游离过程中连续三次采用碱性物质处理骆驼蓬种子，一方面大大提高了去氢骆驼蓬总碱的提取率，使之达到50％以上，比现在文献报道的20-30％提高近一倍；另一方面，加入生/熟石灰后，大大加快干燥速度；同时促使生物碱彻底的游离；为骆驼蓬种子大批量的工业化提取创造了工艺条件。
本发明的另一个重要特点是用β-环糊精包合骆驼蓬提取物，以增加其溶解度，使其在后续制剂步骤中更具实用性。
本发明制备的骆驼蓬种子总生物碱中的去氢骆驼蓬碱＞50％，体外抗肿瘤研究结果表明随着去氢骆驼蓬碱含量增高，效果显著(见附件1)。急性毒性试验表明，骆驼蓬种子总生物碱的β-环糊精包合物(见附件2)和直接喷雾干燥产品均能达到药用要求(见附件3)
【具体实施方式】
下面结合骆驼蓬种子的生物总碱提取和制剂实例说明本发明的具体实施方式。
实施例1：骆驼蓬种子总生物碱的制备方法1
取骆驼蓬种子40目的粉末，加二倍重生药量的1％氨水，搅拌均匀，放置8小时，以85％的碱性醇溶液(Ph＝9)加热回流提取三次，每次1.5小时，醇溶液加入量分别为生药的量的6倍、4倍，4倍，合并醇提液，减压回收乙醇，浓缩无醇味，加入5％的熟石灰(按生药重量计算)，搅拌均匀，70℃真空干燥72小时(至水分＜15％)，粉碎，用乙酸乙脂回流提取三次，每次2小时，乙酸乙脂量为浸膏的10倍、8倍、8倍，合并乙酸乙脂提取液，用硅藻土与活性炭组成的混合介质(1∶1)过滤，减压回收乙酸乙脂，真空干燥24小时，用85％的乙醇10倍量，2倍量回流提取2次(2小时、0.5小时)，合并提取液，用硅藻土与活性炭组成的混合介质(1∶1)过滤，减压回收乙醇至无醇味，加45倍酸性水加热溶解，冷藏过夜，用硅藻土与活性炭组成的混合介质(1∶1)过滤，滤液浓缩干燥即得。
以此为原料做滴丸，颗粒剂，片剂，肠溶胶囊，胶囊。制剂处方分别如下：
1、滴丸制剂
处方：总碱：200mg基质：聚乙二醇(聚合度6000)，14.5g
工艺：原料与基质于80℃研磨溶解，加入数滴吐温-80，搅拌均匀，冷却剂为二甲基硅油，从每分钟15滴的速度，滴制而成。
其它制剂形式如表1所示：
表1片剂总碱5g微晶纤维40g硬脂酸镁5g颗粒剂总碱5g淀粉40g酒精适量肠溶胶囊或胶囊总碱10g乳糖110g硬脂酸镁10g
实施例2：骆驼蓬种子总生物碱的制备方法2
取骆驼蓬种子粉碎40目的粉末，加1％的碳酸钠乙醇溶液以二倍的生药量浸泡搅拌均匀，放置8小时，润透，以85％的碱性乙醇溶液(PH＝11)加热回流提取三次，每次1.5小时，用量分别为生药的6倍、4倍、4倍，合并醇提液，减压回收乙醇，浓缩无醇味，加入5％的生石灰(按生药重量计算)，搅拌均匀，70℃真空干燥72小时(水分＜15％)，粉碎，用乙酸乙脂回流提取三次，每次2小时，用量为浸膏的10倍、8倍、8倍，合并乙酸乙脂提取液，用硅藻土与活性炭组成的混合介质(1∶1)过滤，减压回收乙酸乙脂，真空干燥24小时，分别用85％的乙醇10倍量，2倍量回流提取2次，每次2小时、0.5小时，合并提取液，用硅藻土与活性炭组成的混合介质(1∶1)过滤，减压回收乙醇至无醇味，加6倍β-环糊精溶液，在60℃水浴中搅拌状态下以每分钟60滴的速度加入上述药液，继续搅拌2小时，冷藏4小时，过滤，真空干燥即得。
获得的干燥物用于制备注射剂，可与注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、聚乙二醇等配合，还可以加入适宜的赋形剂、助溶剂、防腐剂。
实施例3：骆驼蓬浸润生药使用的不同碱性溶液的影响：
(1)、取粉碎40目的骆驼蓬种子生药20g，加入用Na2CO3调节pH为12的水溶液50ml浸泡过夜，过滤，得吸水率为1.9倍。
(2)、粉碎40目的骆驼蓬种子生药20g，加入用二乙胺调节pH为9的乙醇溶液50ml浸泡过夜，过滤，得吸水率为1.8倍。
实施例4：骆驼蓬回流提取步骤中pH值，乙醇浓度，用量和提取时间的影响如表2所示：
表2
结果分析：正交试验结果是pH值较高，乙醇浓度也较高时效果较好。
实施例5：骆驼蓬碱化游离步骤中石灰的加入量影响
各取400g生药，按上述条件进行提取，浓缩至无醇味的提取液，分成四份分别加入Ca(OH)2 20g、15g、CaO25g、30g拌匀，分别于常压下60℃干燥1.5小时，2小时，3小时，4小时，然后60℃减压干燥7天，采用烘干法测水分，结果如表3所示：
表3 编号 时间 水分 去氢骆驼蓬碱 1 1.5 4.98 0.062mg/ml 2 2 3.38 0.046mg/ml 3 3 2.99 0.044mg/ml 4 4 2.83 0.058mg/ml
实施例6：骆驼蓬回流分离步骤中不同溶剂的影响
各取实施例4中的Ca(OH)2干燥物15g，加入苯，甲苯，乙酸乙脂，氯仿，二氯甲烷，丙酮各150ml，在三口瓶中在搅拌状态下加热回流提取三次，每次1.5小时，在澄清板上抽滤，减压回收溶剂，用少量鲜新溶剂洗涤，水浴上挥干，80℃真空干燥48小时，测各溶剂的收率如表4所示：
表4 名称 重量(g) 对Ca(OH)2物的收率％ 去氢骆驼蓬碱(mg) 苯浸膏 2.9 19 221 甲苯浸膏 2 13 276.6 氯仿浸膏 4.6 31 1483.1 乙酸乙脂浸膏 4.4 29.3 1783.5 二氯甲烷浸膏 2.5 17 346.25 丙酮浸膏 2.3 17. 897
结果分析：从收率来看，以氯仿和乙酸乙脂为好，从骆驼蓬总碱的含量来看，以乙酸乙脂和氯仿为好，但乙酸乙脂对总生物碱的提取效率与氯仿相比明显要好许多，且对环境及人皆友好，故优选乙酸乙脂。
实施例7：骆驼蓬转溶精制步骤中不同浓度的乙醇转溶效果影响
用10倍不同浓度的乙醇加热回流1.5小时，2倍回流0.5小时，合并滤液，测去氢骆驼蓬碱的含量如表5所示：
表5 90％ 139mg/ml 85％ 156mg/ml 80％ 128mg/ml 75％ 119mg/ml
实施例8：β--环糊精对总生物碱的包合温度的和比例的影响如表6所示：
表6 温度 配比 60 1∶6 80 1∶8
总生物碱每份10g，加入乙醇回流溶解后，加入到β-环糊精的饱和溶液中，在相应的温度及配比的条件下搅拌操作2小时，冷藏4小时，过滤，用乙醇少许洗涤样品，70℃真空干燥4小时，快速称重.得到包合物结果如下：
①60℃1∶6，结果得到56g；②60℃1∶8，结果得到56.5g；
③80℃1∶6，结果得到56.5g；④80℃1∶8，结果得到57g.
考虑成本因素，初步拟定为1∶6，以每分钟60滴的速度加入物料，60℃搅拌操作2小时，冷藏4小时，过滤，用乙醇少许洗涤样品，70℃真空干燥4小时，即得。