一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备和用途 技术领域 本发明属于生物工程领域，涉及一种新的来自于长白山白眉蝮蛇蛇毒的磷脂酶A2同源物及编码这种磷脂酶A2同源物的多核苷酸序列，还涉及所述多核苷酸及其编码的蛋白质用途。
背景技术 磷脂酶A2(phospholipaseA2，EC3.1.1.4)，简称PLA2，能催化甘油磷脂的第二位脂酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸。它广泛存在于生物体内，尤其富含于哺乳动物胰脏的分泌液及蛇和昆虫的毒液中。
蛇毒PLA2由一类结构相似(通常含有7对二硫键)，分子量在14kD左右的蛋白质家族组成。除了酶活性外，还具有多种生理活性，如神经毒、心脏毒、肌肉毒、细胞毒、溶血作用、抗凝集作用等。这些活性或者与酶活性相关，或者完全独立于酶活性之外。不同来源的蛇毒PLA2所具有上述生理活性不尽相同，每种PLA2通常只有一种或少数几种生理作用。吴祥甫等从江浙蝮蛇的毒液中分离到3种PLA2(Wu XF等，Acta Biochem Biophys Sin，1984，16(6)：664-671)，根据等电点的不同，分别命名为酸性PLA2(APLA2，pI4.5)，中性PLA2(NPLA2，pI6.9)及碱性PLA2(BPLA2，pI9.3)。它们的一级结构同源性较高，空间结构也比较保守，而药理活性有相当大的差异。其中，APLA2能抑制血小板聚集，NPLA2属于突触前神经毒素，BPLA2则具有溶血活性。为了搞清楚PLA2结构和功能的关系，人们对各种来源的蛇毒PLA2进行了大量的研究，包括通过生化提取的方法对蛇毒进行分离纯化，然后对所得PLA2进行氨基酸测序，通过进一步的功能研究来探索不同结构的PLA2结构与功能关系地规律。
发明内容 本发明的目的是提供了一种来自长白山白眉蝮蛇(日本蝮蛇乌苏里亚种，Agkistrodon blomhoffii ussurensis，俗名Manushi)的蛇毒磷脂酶A2同源物(Gln-49-PLA2)及其编码基因的制备和用途。
本发明采用的技术方案是：(1)分离纯化出一种新的蛇毒磷脂酶A2同源物，并测定其部分氨基酸序列；(2)克隆编码所述磷脂酶A2同源物的基因并测定其碱基序列；(3)将本发明提供的基因导入宿主细胞，使用本基因。(4)提供所述磷脂酶A2同源物性质及用途。
一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因，是来源于长白山白眉蝮蛇(日本蝮蛇乌苏里亚种，Agkistrodon blomhoffii ussurensis，俗名Manushi)，包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽，或其活性片段，或其活性衍生物，活性片段和活性衍生物是指具有全部或部分SEQID No.2氨基酸序列的多肽。
制备一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的方法是，分离纯化出一种新的蛇毒磷脂酶A2同源物，克隆其编码基因，插入重组表达载体，并导入宿主细胞，以使用该基因。
一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法是：
(a)适合表达蛇毒磷脂酶A2的条件下，培养权利要求3所述的宿主细胞；
(b)从细胞培养物中分离出具有长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物活性的多肽；
(c)从长白山白眉蝮蛇蛇毒中分离磷脂酶A2同源物。
一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法，编码基因是指一种分离的多核苷酸，其特征在于包含(a)或(b)中至少90％相同性的核苷酸序列：
(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸；
(b)与(a)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法，重组载体是能在宿主细胞中稳定复制并包含多核苷酸的任何质粒和载体。
一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的制备方法，宿主细胞是一种遗传工程化的宿主细胞，可选自下组的一种：
(a)载体转化或转导的宿主细胞；
(b)多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
制备的一种长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物及其编码基因的用途是，利用多肽细胞毒性、肌肉毒性、神经毒性和抗凝血活性等特性，制备用于治疗血栓、肿瘤、神经等疾病以及止痛药物组合物。
本发明提供的蛇毒磷脂酶A2同源物可通过离子交换层析、凝胶层析和高效液相层析(HPLC)的联合应用得到，SDA-PAGE显示其为单一组份，质谱确定其精确分子量为13881.83±0.33D，等电聚焦电泳测定其等电点为8.56。本发明提供的磷脂酶A2同源物具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。序列表明，该磷脂酶A2同源物是一种新的Gln49磷脂酶A2。Gln49磷脂酶A2是指磷脂酶A2氨基酸序列中的第49位氨基酸残基是Gln，按照国际惯例，本发明中涉及的蛋白质序列编号是以牛胰PLA2的序列编号作为参照。
本发明提供的磷脂酶A2同源物可通过常用的蛋白质分离纯化方法适当组合分离纯化得到，如离子交换层析、凝胶层析和高效液相层析(HPLC)等，但本发明可采用的方法不限于此。
本发明不局限于蛋白质的来源，生产方法等，只要它具有说明书中的特征即可。本发明提供的蛋白质可以是天然蛋白质，利用基因工程技术由重组DNA表达的蛋白质，或化学合成的蛋白质。
本发明提供的蛋白质不仅包括具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质，还包括该蛋白质的片段、衍生物和类似物。本发明所用术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明所述多肽相同的生物学功能或活性多肽。
本发明提供的蛋白质SEQ ID No.2的片段、衍生物或类似物可以是：(1)这样一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是或不是由遗传密码子编码的；或者(2)这样一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基；或者(3)这样一种多肽，其中成熟多肽与另一种化合物融合；或者(4)这样一种多肽，其中附加氨基酸融合进成熟多肽，其用来纯化成熟多肽；或者(5)这样一种多肽，一个或多个氨基酸残基被缺失，或者插入或添加一个或多个氨基酸。
本发明提供了分离的多核苷酸，其基本上是编码SEQ ID No.2氨基酸序列多肽的多核苷酸。本发明提供的多核苷酸序列包括在SEQ ID No.1核苷酸序列中。本发明的多核苷酸是从长白山白眉蝮蛇毒腺中分离得到的。它包含366个核苷酸，编码122个氨基酸。
本发明所用术语“分离”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化。
本发明提供的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID No.1所示的编码区序列相同或是简并性变异体。本发明所用术语“简并性变异体”是指编码具有SEQ ID No.2蛋白质或多肽的核酸序列，但由于密码子的简并性，编码与SEQ ID No.1所示的编码区序列可能不同。
编码SEQ ID No.2成熟多肽的多核苷酸包括：仅有天然多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列以及非编码序列。 术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码多肽的多核苷酸和编码和(或)非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失或插入，但基本上不会改变其编码的多肽功能。
本发明还涉及能与以上所述序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少90％，更优选的具有95％的相同性)。本发明涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高湿度下的杂交和洗脱，如60℃，0.2×SSC，0.1％SDS；或(2)杂交时加变性剂，如42℃，50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清或0.1％Ficoll等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码多肽与SEQ ID NO.2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及以上所描述的杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是20-30个核苷酸，更好是50-60个核苷酸，最好是100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和(或)分离编码所述蛇毒磷脂酶A2的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸序列的载体和用本发明的载体经基因工种方法产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明提供的DNA序列能用几种方法获得，例如用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：(1)用探针与基因组cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列；(2)表达文库的抗体筛选以检出其具有同源结构特征的克隆DNA片段。
编码所述的磷脂酶A2同源物特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)化学合成DNA序列以获得所需
多肽编码的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最为常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成也是可选的方法。如果所需多肽氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离目的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qingene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶链反应技术时，即使极少的表达基因也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定编码所述长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物转录本的水平；(4)应用免疫学技术或测定生物学活性检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源的核苷酸序列，其长度至少15个核苷酸，较好是20-30个核苷酸，更好是50-60个核苷酸，最好是100个核苷酸以上。此处所用的探针通常是在本发明提供的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明提供的基因本身或者片段当然可以用做探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测所述新蛋白质基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki等，Science，1985；230；1350-1354)可被优先用于获得本发明提供的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE：cDNA末端快速扩增法)，在上述PCR方面所用的引物可根据本发明提供的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明提供的基因，各种DNA片段等核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法测定(Sanger等，PNAS，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明提供的长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”是指涉及本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不局限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Maeda M.等，J. Biochem，109(4)：632-637，1991，)以及在酵母细胞中表达的基于AOX1的表达载体；在哺乳动物小鼠的表皮细胞中表达的基于MT的表达载体(Geyer H.等，Eur.J.Biochem.，237：113-127，1996)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含所述长白山白眉蝮蛇磷脂酶A2同源物的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信息的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook等，Molecular Cloning，a laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1998)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子中代表性的例子有：大肠杆菌的Lac或Trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTR启动子和其他一些已知的可控制基因在原核、真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括有翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状，如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、新霉毒抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉毒抗性。
包含以上所述的适当DNA序列以及适当的启动子或者控制序列的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。有代表性的例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；诸如酵母的真菌细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤动物细胞等。
本发明提供的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入一个增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主为原核生物如大肠杆菌时，制备能吸收DNA的感受态细胞一般从指数生长期后收获细胞，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀，显微注射，电穿孔，脂质体包装等方法。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养细胞可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中所需的重组多肽可表达于细胞内、或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法多为本领域技术人员所熟知。更具体地说，有常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破碎细胞、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)，吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了所述磷脂酶A2同源物的生物学活性。实验表明所述蛇毒磷脂酶A2同源物没有明显的磷脂酶A2活性，但具有抗凝血、抗肿瘤等生物学活性，但基于本研究还在继续，所述磷脂酶A2同源物的生物学活性不限于此。所述新的磷脂酶A2同源物有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：抗肿瘤、抗血拴、止痛。
综上所述，鉴于蛇毒PLA2结构的多样性和功能的复杂性，本发明首次提供的磷脂酶A2同源物氨基酸序列及其编码基因，对弄清不同来源的PLA2结构与功能之间的关系具有重要的理论意义。本发明提供的磷脂酶A2同源物，具有多种生物学活性，使得天然或重组PLA2在临床血栓治疗、肿瘤治疗或临床止痛方面具有潜在的应用前景。
具体实施方式 下面的具体实施方式结合实例对本发明进一步说明。
实施例1：长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的分离纯化
长白山白眉蝮蛇粗蛇毒购自吉林辉南县，使用前用10mmol Tris-HCl(pH8.0)溶解，离心去沉淀，用10kD的超滤膜超滤两次。
取上述粗蛇毒样品进行阳离子交换层析，离子交换柱为Hitrap sp，缓冲液A为10mmol HAc-NaAc(pH 5.0)，缓冲液B为10mmol HAc-NaAc+1molKCl(pH5.0)，流速为2ml/min。收集离子交换柱上洗脱下的各组分，超滤浓缩后进行凝胶过滤层析：凝胶柱为superdex75，缓冲液C为10mmol Tris-HCl+1molKCl，流速为1ml/min。收集凝胶过滤层析组分，超滤浓缩脱盐后，进行阴离子交换层析：离子交换柱为source Q，缓冲液D为10mmol Tris-HCl(pH 8.0)，缓冲液E为10mmol Tris-HCl+1molKCl(pH 8.0)，流速为2ml/min。HPLC进一步纯化方法为：收集阴离子交换层析组分，超滤浓缩后进行HPLC制备，色谱柱为反相C18制备柱(250×15)；流动相F为乙腈+0.1％三氟乙酸；G为水+0.1％三氟乙酸；流速为2ml/min。
实施例2：长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因的获得
长白山白眉蝮蛇排毒后4天，取出毒腺，迅速投入TRIZOL中，按照试剂盒生产厂商提供的操作指南进行总RNA提取(TRIZOL试剂盒，美国GIBICOL公司)。根据已知氨基酸序列，结合同源序列比较设计特异引物P-F1，采用3’-FullRACE法得到长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因3’端序列。进而设计引物P-F2、P-R2，采用RT-PCR法得到长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的编码基因。3’-Full RACE、RT-PCR均采用试剂盒(TAKARA公司，日本)，3’-FullRACE反转录引物为Oligo dT-3 sites Adaptor Primer，由TAKARA公司提供，所有操作均按照试剂盒生产厂商提供的操作指南进行。其中有关PCR反应的条件是这样的：
引物为：
P-F1：5’-TATCGTCTGTGGAGGGGACGACCC-3’
3 sites Adaptor Primer：5’-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3’
P-F2：5’-AGCCTGCTGCAATTCAGGAAGATGAT-3’
P-R2：5’-TCCCGGCCTGCAGAGACTTAGC-3’
PCR具体反应条件均为：
72℃ 7min
4℃ 5m
所得PCR产物克隆到pMD18-T中，测序获得编码长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因序列。将该序列与已有的DNA序列数据库进行比较，结果发现该多核苷酸序列未有过报道，我们将该基因编码的蛋白质命名为长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物，英文名为：manushi phospholipaseA2 homologue，缩写为Gln49-MPLA2。
实施例3：长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物基因在大肠杆菌中的表达
根据该新蛋白质相应的基因序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下：
F1 primer：5’-CCGAATTCATTGAGGGACGCAGCCTGCT GCAATTCAG-3’
R1 primer：5’-CCGGATCCTCATTAGCATTTCTCTGACTT-3’
F-primer序列含有EcoRI酶切位点和Factor Xa切割的识别序列。R-primer序列含有BamH I酶切位点和翻译终止子序列，其后面分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，以含有目的基因的pMD118-T质粒为模板，进行PCR反应。
根据已知的大肠杆菌表达载体pET-32(a)+的全序列，设计出一对特异性扩增引物，以改建质粒，得到满意的表达效果，引物序列如下：
F2 primer 5’-CCGGATCCCAAAGCCCGAAAGGAAGC-3’
R2 primer 5’-GGGAATTCACCAGAAGAATGATGATGATG-3’
F primer含有BamH I酶切位点和部分T7终止子序列。R primer含有EcoRI酶切位点、柔链区和部分His Tag序列。以大肠杆菌表达载体pET-32(a)+为模板，进行反向PCR。
用BmH I和EcoRI分别对扩增的目的基因序列和大肠杆菌表达载体pET-32(a)+序列进行酶切并连接。将重组质粒电脉冲转化大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃，IPTG诱导4小时后收获菌体。所的菌体超声破碎，SDS-PAGE显示重组蛋白质获得了表达。
实施例4：长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物抗凝血活性的测定
取新鲜的枸橼酸钠抗凝猪血，1000g离心10min，得富含血小板血浆(PRP)，取PRP 0.5ml，与0.1ml含不同浓度的磷脂酶A2同源物(0.1，0.2，0.4或0.6g/L)的PBS溶液37℃孵育10min，加入0.1ml 0.25mol/L CaCl2，记录凝血时间。实验表明，长白山白眉蝮蛇PLA2同源物在较低浓度(0.1mg/ml)时，对复钙时间略有降低，但当浓度高于0.2mg/ml时，随PLA2浓度的增加，复钙时间延长。
实施例5：长白山白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物细胞毒性的测定将冻存的Hela、K562细胞经复苏、传代后取对数生长期的细胞记数，以1×105/ml细胞加入24孔培养板，每孔500μl，5％ CO2孵箱中培养24h，加入不同浓度的PLA2同源物，培养3h。采用MTT法测定Hela、K562的活细胞数，计算半数致死量(LD50)。实验表明，PLA2同源物对Hela细胞有明显的毒性作用，但对K562细胞不明显，其LD50分别为1.3μmol/ml和28.6μmol/l。