壳囊孢菌素B制法及在制备抗肿瘤和抗真菌药物中的应用 (1)技术领域
本发明涉及一种来源于红树植物内生真菌—小穴壳菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3)的壳囊孢菌素B化合物的制备方法及其在制备抗肿瘤和抗真菌药物中的应用。
(2)背景技术
红树林是生长在港湾河口地区的淤泥滩涂上的木本植物群落，作为独特的海陆边缘生态系统在自然生态平衡中起着特殊的作用。红树林植物不仅是重要的经济植物，也是民间常用的药用植物，如红树植物老鼠簕(Acanthus ilicifolius)的树皮熬汁可以用于治血尿；角果木(Ceriops tagal)的树皮捣碎可以止血、通便和治疗恶疮，种子榨油可以止痒和治疗癣，还可治疗冻疮等。
红树植物中存在着丰富的内生真菌，有报道认为红树植物的药用成分都是由其内生真菌产生的，不多的文献(1、Brady，S.，Wagenaar，M.W.，Singh，M.，et al.The cytosporonesisolated from an endophytic fungus.Org.Lett.2000，2(25)：4043-4046；2、Bandaranayake，W.M..Traditional and medicinal uses of mangroves.Mangroves and Salt Marshes，1998，2：133-148；3、Bandaranayake，W.M..Bioactivities，bioactive compounds and chemicalconstituents of mangrove plants.Wetland Ecology and Management，2002，10：421-452；4、Lin Y.，Wu X.，Deng z.，et al.The metabolites of the mangrove fungus Verruculina enalia No.2606 from a salt lake in the Bahamas.Phytochemistry，2002，59：469-471)报道也已证明红树植物的内生真菌确实可以产生具有新结构和强的生理活性的化合物。但目前国内外在这方面的工作才刚刚开始，为此其研究具有较高的理论价值和实际应用价值。
(3)发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于红树植物内生真菌(cytosporone B)地化合物的分离提取方法以及它在制备抗肿瘤药物和抗真菌药物中的应用。
本发明所用的红树植物内生真菌—小穴壳菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3)已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国 武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M203067，保藏日期为2003年8月29日。
本发明所说的壳囊孢菌素B(cytosporone B)化合物的结构式为：
(3，5-二羟基-2-辛酮基)-苯乙酸乙酯
所说的壳囊孢菌素B化合物的制备方法为：
1)内生真菌(Dothiorella sp.HTF3)的种子培养：
培养基以g为单位，马铃薯去皮、切碎20，水煮，在过滤后的滤液中加葡萄糖1～3，琼脂1.5～2.0，海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，室温下培养5～15天；
2)内生真菌的发酵培养：
发酵培养基以g为单位：马铃薯去皮、切碎20，水煮，在过滤后的滤液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，室温下培养5～15天；
3)将上述发酵培养液过滤除去发酵液后得到菌体；
4)菌体烘干，用乙酸乙酯反复浸泡，合并乙酸乙酯，减压浓缩，所得的膏状物用硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100进行梯度洗脱，收集二者比例为1/1时的洗脱液，减压浓缩即得到该化合物，含量为9mg/g菌体干重。
所得该化合物的实验数据为：
无色油状物；EMS：m/z(rel.int.)：323.3[M+H]+(100)，345.3[M+Na]+(11.4)，361.2[M+K]+(4.2)；1H NMR和13C NMR(400MHz，CDCl3，ppm)见表1。
本发明所说的壳囊孢菌素B化合物可用于制备抗肿瘤药物，其抗肿瘤活性检测实验如下：
1)肿瘤细胞株
人B淋巴瘤Raji细胞、人口腔皮样癌KB细胞、人成骨肉瘤MG-63细胞、人肺癌A549细胞、人宫颈癌hela细胞等。
表1.壳囊孢菌素B的NMR数据 Position 1H-NMR Position13C-NMR 2 3.70)s) 1 171.0 4 6.25(s) 2 41.8 6 6.25(s) 3 136.0 9 4 112.0 10 2.75(t) 5 163.1 11 1.6 6 103.2 12 1.22 7 161.0 13 1.19 8 116.0 14 1.20 9 207 15 1.20 10 43.7 16 0.8 11 25.0 17 4.2(q，7) 12 29.4 18 1.20(t，7) 13 29.2 OH-5 14 31.8 OH-7 15 22.8 16 14.2 17 61.0 18 14.1
2)材料
a MTT(噻唑蓝)：
用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到终浓度5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃避光保存；
b SDS裂解液：
100g十二烷基磺酸钠(SDS)，1N HCL 10ml，加热溶解，蒸馏水定容至1000ml。
c 细胞培养基(全培)：
一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)细胞培养基溶于1L双蒸水中；加入2gNaHCO3搅匀溶解后封口，置于4℃过夜，以自然沉淀除去杂质；次日加入10％-15％已灭活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混匀后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。
3)化合物cytosporone B的配置
取一定量的壳囊孢菌素B，用甲醇溶解并调整浓度为5mg/ml，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
4)肿瘤细胞的培养
a 细胞活化：
取一干净烧杯，装入干净温水，水温调至37～40℃；将冻存管从液氮中取出迅速投入温水解冻，并将冻存细胞接入预装有细胞培养基的培养瓶内，在37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液、分瓶。
b 细胞计数：
选对数生成期细胞，胰酶消化，移入离心管中，加全培至10ml，取一滴滴入计数板一侧凹槽中，倒置显微镜下计数。调整细胞数至1×105/ml。
c 活性检测：
①96孔板在超净工作台内紫外光下照射1h；
②在各孔中加入细胞悬液80μl，37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养24h；
③加入20μl用全培梯度稀释成一系列浓度的溶液，继续培养48h；
④每孔加入MTT溶液10μl，轻轻震摇使颗粒溶解，37℃放置3h；
⑤取出培养板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解过夜；
⑥用酶联反应仪570nm测定各孔吸光值(参比波长为655nm)，按下列公式计算抑制率：
抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％
⑦以抑制率为纵坐标，受试样品浓度的对数为横坐标作图，求出抑制率为50％时的浓度即为IC50。
d 试验结果：
Cytosporone B对人B淋巴瘤Raji细胞、人口腔皮样癌KB细胞、人成骨肉瘤MG-63细胞、人肺癌A549细胞、人宫颈癌hela细胞的IC50分别是62.5ng/ml、4μg/ml、1μg/ml、4μg/ml和1μg/ml。
本发明所说的壳囊孢菌素B化合物可用于制备抗真菌药物，其抗真菌活性检测实验如下：
1)真菌指示菌株：
白色假丝酵母菌、黑曲霉菌、木霉菌、镰刀菌、交链孢霉菌、白色面包霉菌、枝孢霉菌
2)化合物cytosporone B的配置
取一定量的cytosporone B，用甲醇溶解并调整浓度为1mg/ml，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
3)活性检测：(最低抑菌浓度MIC的测定)
a 用无菌水将在PDA(马铃薯-葡萄糖-琼脂)斜面培养基上生长的各指示菌洗下，制成孢子浓度为107个/ml的菌悬液，4℃保存备用；
b cytosporone B的样品溶液按两倍稀释法，用甲醇稀释成一系列的浓度梯度，取20μl加入到已在超净工作台的紫外灯下照射30min的96孔板中。用超净工作台的风机鼓风吹干甲醇；
c 真菌悬液用PD(马铃薯-葡萄糖)培养基稀释成104个/μl的菌液，取100μl加入到上述96孔板上，25℃培养48h，肉眼观测，没有真菌生成的最小稀释浓度即为MIC。
d 实验结果：
cytosporone B对白色假丝酵母菌、黑曲霉菌、木霉菌、镰刀菌、交链孢霉菌、白色面包霉菌、枝孢霉菌的MIC分别是：0.156mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0625mg/ml、0.07mg/ml、0.125mg/ml和1mg/ml。
综上所述，本发明提供了一类来源于红树林内生真菌的化合物的制备方法，产量高，达到9mg/g菌体干重，可以用于工业生产；该化合物对多种人体肿瘤细胞均表现出较好的抑制作用，可用于制备抗这类肿瘤的药物；该化合物还对人体致病真菌和植物致病真菌有较好的抑制作用，可用于制备这类抗真菌药物。
(4)具体实施方式
实施例1
以下实施例给出所说的壳囊孢菌素B化合物的制备方法。
1)内生真菌的种子培养：
将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖1g，琼脂1.6g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，25℃下培养10天；
2)内生真菌的发酵培养：
将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖1.5g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，26℃下培养8天；
3)将上述发酵培养液过滤除去发酵液后得到菌体；
4)菌体烘干，用乙酸乙酯反复浸泡，合并乙酸乙酯，减压浓缩，所得的膏状物用硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100进行梯度洗脱，收集二者比例为1/1时的洗脱液，减压浓缩即得到该化合物，含量为9mg/g菌体干重。
实施例2
将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖1.5g，琼脂1.8g，50％海水定容至100ml灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，30℃下培养8天；再将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖2.5g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，20℃下培养15天；将上述发酵培养液过滤除去发酵液后得到菌体；菌体烘干后用乙酸乙酯反复浸泡，合并乙酸乙酯，减压浓缩，所得的膏状物用硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100进行梯度洗脱，收集二者比例为1/1时的洗脱液，减压浓缩即得到该化合物，含量为9mg/g菌体干重。
实施例3
将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖2.0g，琼脂1.5g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，28℃下培养15天；再将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖2g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，25℃下培养10天；将上述发酵培养液过滤除去发酵液后得到菌体；菌体烘干后用乙酸乙酯反复浸泡，合并乙酸乙酯，减压浓缩，所得的膏状物用硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100进行梯度洗脱，收集二者比例为1/1时的洗脱液，减压浓缩即得到该化合物，含量为9mg/g菌体干重。
实施例4
将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖2.5g，琼脂2.0g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，20℃下培养12天；再将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖1g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，30℃下培养12天：将上述发酵培养液过滤除去发酵液后得到菌体；菌体烘干后用乙酸乙酯反复浸泡，合并乙酸乙酯，减压浓缩，所得的膏状物用硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100进行梯度洗脱，收集二者比例为1/1时的洗脱液，减压浓缩即得到该化合物，含量为9mg/g菌体干重。
实施例5
将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖3.0g，琼脂1.7g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，23℃下培养5天；再将20g马铃薯去皮、切碎，水煮30min，在过滤后的滤液中加葡萄糖3.0g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，28℃下培养5天；将上述发酵培养液过滤除去发酵液后得到菌体；菌体烘干后用乙酸乙酯反复浸泡，合并乙酸乙酯，减压浓缩，所得的膏状物用硅胶柱层析分离，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100进行梯度洗脱，收集二者比例为1/1时的洗脱液，减压浓缩即得到该化合物，含量为9mg/g菌体干重。