细胞色素表达的基因分型 本发明涉及一种测定，具体而言，涉及给与细胞色素表达相关的表型进行多型性预测的基因分型的测定，本发明中表型指CYP3A5。
细胞色素P450亚家族CYP3A5代表了P450超家族中最重要家族中的一个家族，它对不断增加的治疗性化合物的代谢起着重要作用(23，24)。该家族包括在人类肝脏中表达最丰富的P450s，并且负责超过50％的临床所用药物的代谢，包括二氢吡啶、环胞菌素、红毒素和巴比妥酸盐类(1)。在CYP3A5底物代谢中的广泛的个体间差异已被注意，而且这是决定个体用药效率的一个因素。有证据表明一系列的亲脂性环境污染物被该超家族的成员所代谢，污染物中包括象黄曲霉毒素B1这样的前致癌剂地活化(2)。
目前已经在人类中鉴定出四种CYP3A cDNAs，CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7。CYP3A3是CYP3A4的等位变异体，而CYP3A4和CYP3A7分别只在成人和胎肝中发现(3)。原初的实验表明CYP3A4存在多形性(4)。但是其它的研究，尽管证实CYP3A4表达存在广泛的个体间差异，但未能证实最初的双峰(5，6)。CYP3A5和CYP3A5间底物特异性的部分重叠使得很难区分这些异构体的代谢，结果很少有研究人类CYP3A5活性变异的基因分型的数据。但是，有CYP3A5多形性表达的证据。同时应用免疫印迹和Northern分析，仅在10-30％的人肝中检测到CYP3A5表达(7，8，9)。最近，应用免疫印迹法对30个人肝样品进行分析发现，仅有3％没检测到CYP3A5，而大量的人有痕量表达，这提示该酶的多形性也许是调节性的，而不是结构性的(10)。比较CYP3A4，3A5和3A7基因5′侧翼区推断出几个所有异构体共同的转录调节因子的结合位点(11，12，13)。但是该CYP3A亚家族成员个体间差异表达的分子基础目前为止尚未弄清楚，如果有的话。确实，有人提出与基因结构相比宿主的细胞环境是更大的诱导能力的决定因素(14)。但是确定不同表达和活性的主要遗传组分若与便利的筛选方法相连的话，将极为有利-不仅可预测个体对由这些异构体代谢的药物的反应性，而且有利于CYP3A和疾病过程间的相关研究。
应用镇静的咪达唑仑作为探针药物可进行CYP3A4和CYP3A5代谢的描叙(15)。该过程中产生2种代谢产物，1-羟基咪达唑仑(1-OHM)和4-羟基咪达唑仑(4-OHM)。那些CYP3A5含量比CYP3A4高的样品，它们的代谢趋向于1-0HM路径，因此1-OHM/4-OHM的比率与仅含CYP3A4的样品高。于是本发明者们建立了这样两种多形性，位于推断的转录调节区域，连接着引起CYP3A5基因表达和代谢活性增加的基因，并发展了检测它们的测定方法。这些测定方法能用于测定个体间对由该异构体代谢的药物的反应差异性，并有利于疾病相关研究。
因此，本发明的第一方面是提供一种鉴定具有与细胞色素CYP3A5表达相关的高或低的药物代谢表型的目标物的方法，该方法包括在目标物的基因组的转录调节区，如邻近CYP3A5编码区的启动子或增强子，筛选存在或缺少多形性变异体。优选，在所说调节区域的转录子识别位点筛选变异体，更优选在活化子蛋白-3基元序列或基本的转录元件位点筛选。更优选的是，在邻近CYP3A5编码区的5′侧翼区DNA的-475或-147任一位点筛选变异体，并且优选筛选-475和-147同时存在的变异体。侧翼区的序列列于图7中。
在本发明方法的一个实施方案中，基因组DNA被扩增，优选应用能与野生型序列或变异序列选择性杂交的寡核苷酸分子通过聚合酶链式反应进行，这样从该分子产生的扩增DNA会提示野生型或突变是否存在。在该方法中PCR引物或者与突变型序列杂交，或与野生型序列进行杂交，但不同与二者杂交。应用各自的引物进行各自的突变或野生型DNA的扩增，可提供野生型或突变的核苷酸存在的提示。
本发明的另一方法是有利地应用寡核苷酸分子作为引物，它除与感兴趣的位点杂交外，还能够引入限制性位点，或在野生型序列中缺失，或在多形性变异体中缺失。因此，本发明的另一实施方案是，提供一种鉴定具有与CYP3A5表达相关的高或低药物代谢表型的目标物的方法，该方法包括：1)应用寡核苷酸分子从目标物中扩增基因组DNA，该寡核苷酸分子能与位于被分析位点的野生型序列和/或多形性变异性序列进行杂交，通过扩增反应该分子能在野生型或变异序列中不存在的部位引入限制性位点；2)将第1步中扩增的DNA进行限制性酶切，限制性酶在限制性位点切开DNA，这种限制性消化提示变异体的存在或缺失。
该方法优选包括在转录调节区域的转录子识别位点扩增DNA，并优选在活化蛋白-3基元序列(AP-3)和/或基本的转录元件(BTE)部位扩增DNA。该方法优选包括扩增DNA跨越-475或-147任一位点，跨越CYP3A5的调节区域，其序列列于图7。
按本发明的每一种方法鉴定出的多形性位点包括T-475→G和A-147→G。如下面的例子所示，用于检测A-147→G变异的分子只有在野生型A核苷酸存在于位点-147时才能引入Tai I的限制性位点。而用于检测T-175→G核苷酸变异的分子只有在野生型T核苷酸存在于位点-475时才能引入Alu I的限制性位点。
在该实施方案中，适宜的引物可是
3A5F1 GGGTCTGTCTGGCTGCGC
3A5F2 (GGGGTCTGTCTGGCTGAGC)
3A5R1 (TTTATGTGCTGGAGAAGGACG)中的任一个。
只有当野生型A核苷酸存在于位点-147时，应用寡核苷酸错配引物3A5R1可制造一个Tai I识别位点。用Tai I消化369bp的产物时，野生型序列产生349bp和20bp的片段，如果存在突变，如存在G，则产物不被消化(图2)。同样，用于检测T-475→G突变时可应用第二个寡核苷酸错配引物3AF2。
当野生型T存在于位点-475时，该引物可引入一个Alu I的识别位点，产生318，33和18bp片段的消化产物。当突变的G存在于该位点时，产生336和33bp的消化产物(图3)。
用于给单核苷酸多态性评分的已知技术(见综述Schafer，A.J.，Hawkins，J.R.，Nature Biotechnology，Vol 16，pp 33-39(1998))包括质谱，尤其是基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS，se Roskey，M.T.等，1996，PNAS USA，93：4724-4729)，单核苷酸引物延伸(Shumaker，J.M.等，1996，Hum.Mutat.，7：346-354；Pastinen，T.等，1997，Genome Res.，7：606-614)和DNA芯片或微阵列(Underhill，P.A.等，1996，PNAS USA，93：196-200；Gilles，P.N.等，Nat.Biotech.，1999，17：365-370)。应用DNA芯片或微阵列可同时给单个个体许多不同的多形性位点进行基因分型，或者可同时对多个个体的单个多形性位点进行基因分型。
除上述之外，SNPs通常应用PCR-SSCP为基础的技术进行评估，如应用等位基因特异的引物(Bunce，1995)的PCR-SSP。如果SNP导致消除或建立限制性位点，那么就可应用跨越多态性位点的非等位基因特异的引物进行PCR，然后用合适的限制性酶酶切PCR产物。为多态性打分的已知技术具有广泛应用性，因此对该领域的技术人员来说很明白的是已知的技术可用于给CYP3A5调节区域的单核苷酸多态性打分。
该领域的技术人员明了基因分型通常是用从受试对象获得的适宜组织样品制备的基因组DNA进行的。最优选的，按照本领域内熟知的标准程序，基因组DNA从血样制备。
本发明还提供至少10个邻近核苷酸的寡核苷酸，它用于检测与高或低药物代谢表型相关的细胞色素CYP3A5编码序列邻近的5′调节区域的多态性变异体。该寡核苷酸能与在侧翼区的-475或-147位整合了突变或野生型核苷酸的区域进行杂交，因此根据在所说任一位点有无多态变异体发生，该位点从引物开始得到扩增或得不到扩增。
本发明的寡核苷酸分子长度优选为10～50个核苷酸，更优选的是20～30个核苷酸。正如该领域的技术人员易于了解的，它们可以是DNA，RNA或合成的核酸，或许是经过化学或生化修饰的，或含有非天然或衍生的核苷酸碱基。可能的修饰包括，例如添加同位素或非同位素标记，用类似物替代一个或多个自然发生的核苷酸碱基，核苷酸间的修饰，如无电荷连接(如甲基膦酸酯，磷酰胺，氨基甲酸酯等)或为电荷连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)。也包括模拟多核苷酸能与所设计的序列结合并形成稳定杂交的合成分子。该领域中已知的这样分子包括，例如叫做肽核苷酸(PNAs)的，其中分子骨架中肽连接替代了磷酸酯连接。本发明的寡核苷酸分子可按照该领域内熟知的技术进行制备，如通过化学合成或重组方式。
本发明的寡核苷酸分子可以是双链或单链，但优选单链，因为这样它们可与CYP3A5 5′调节区域的有义链或反义链一致。该寡核苷酸可有利地用作探针或引物以启动DNA合成/DNA扩增。它们也可用于诊断性试剂盒或类似的试剂盒，以检测CYP3A5调节区域一个或多个变异性等位基因的存在。这些实验通常包括在杂交条件下让探针与受试的核苷酸(通常基因组DNA)样品接触，检测探针与样品中的互补核苷酸间双链体和三链体的形成。可把探针锚定于固相支持物上以便用于变异体的检测。优选将它们锚定于阵列上，这样可多种探针同时与目标核苷酸的单个样品进行杂交。探针可被点到阵列上，或在阵列上原位合成(参见Lockhart等，Nature Biotechnology，vol 14，12月，1996“Expression monitoring by hybridisation to high densityoligonucleotide arrays”。一个阵列可在分散的位点中包含100,500甚至1000多个不同的探针。优选寡核苷酸包括这里确定的引物3A5F1，3A5F2和3A5R1中的任何一个。
还提供一种试剂盒，以执行本发明的方法。优选地，该试剂盒包括这里讲述的寡核苷酸，更优选该试剂盒还包括一个或多个这里定义的能区分野生型或形态性变异体的限制性酶。该限制性酶优选包括Tai I或Alu I。
本发明还提供一种鉴定受试化合物，如药物、毒素或由CYP3A5代谢前致癌物毒性或致突变性的方法，该方法包括将每种具有与细胞色素CYP3A5表达相关的高药物代谢表型的细胞和具有低药物代谢表型的细胞与受试化合物接触，并且检测该化合物对每种高或低药物代谢表型细胞的效果或其它细胞对该化合物的敏感性。另外一种实施方案包括一种诊断个体对环境毒素或由CYP3A5代谢的前致癌物相关疾病的敏感性的方法，它包括：1)提供含有DNA的样品，2)应用能区分在所讲调节位点存在或缺乏核苷酸的试剂鉴定邻近CYP3A5编码区转录调节区存在或缺乏突变。按照本发明的这一方面，突变发生在调节区域的转录因子的识别位点，优选位于活化蛋白-3基元序列(AP-3)和/或基本转录元件(BTE)。优选该突变发生于调节区域中-475或-147的任一位点，更优选的是位于两个位点，在这儿的突变可以是T-475G或A-147G。
有益的是，可以设想5′侧翼区的调节区域可用于鉴定或纯化与5′区结合的转录子，其中5′包括各个多形性变异体。因此本发明提供一种鉴定转录因子的方法，该转录子能与邻近细胞色素CYP3A5编码DNA的转录调节区域的DNA片段结合。该方法包括将包括所讲转录调节区域的DNA片段与可能的转录子接触，并且鉴定与该DNA片段形成复合体的任何转录子。
应用转录调节片段可以鉴定对CYP3A5的转录调节区域展现或发挥效果的化合物或试剂。因此本发明提供一种鉴定作用于邻近CYP3A5编码DNA序列的转录调节区域的化合物的方法，该方法包括用DNA构建体转化细胞，将细胞与受试化合物接触，鉴定报告分子的表达。该DNA构建体包括调节区域序列，并且该调节区域连接于编码报告分子的序列。优选地，该细胞表达CYP3A5或表现CYP3A5活性。
本发明还提供一种从样品中纯化转录子的方法，该转录子能与编码细胞色素CYP3A5的DNA序列邻近的转录调节区域的DNA结合。该方法包括将包含有该转录调节区域的DNA片段与转录子的混合物接触，鉴定该转录子与该片段形成的任何复合体。
本发明的另一方面包括一种方法，它用于检测编码细胞色素CYP3A5的DNA邻近转录调节区域的活性，或者是一种鉴定突变的方法，该突变能改变转录调节区域的活性。该方法包括提供一种DNA构建体，它含有编码一种报告分子的序列，该序列与包括调节区域的DNA片段相连，然后将构建体导入细胞并监测报告分子的表达水平。当该方法用于鉴定改变转录调节区域活性的变异体时，该方法还包括这样一步，对比野生型和多态性调节区域的表达水平。
参照本发明的每一实施方案，该调节区域包括一多态性变异，优选在调节区域的转录子识别位点，并优选在活化蛋白-3基元序列(AP-3)和/或基本转录元件(BTE)。在一优选实施方案中，该变异位于CYP3A5编码序列侧翼区的-475或-147，该区域在图7中有所描述。优选2种变异均存在。
本发明的方法将尤其有利于在用药物进行治疗前评估该药物是否能被该患者有效代谢。
参照附图，通过下面的实施例能更清楚地理解本发明。
图1a：描述了CYP3A5基因5′侧翼区连接了A-147G和T-475G突变的基因型与咪达唑仑代谢率的关系。咪达唑仑代谢率＝1-OHM/4-OHM，wt＝如以前发表的(11)5′侧翼区有野生型序列的样品，Het＝与连接的多态性A-147G和T-475G杂合的样品。
图1b：描述了CYP3A5 mRNA表达与在CYP3A5 5′侧翼区连接的A-147G和T-475G突变的关系。Relative Ct difference＝样品间循环阈值的不同，如方法部分所述，wt＝5′侧翼区有野生型序列的样品，如以前发表的(11)，Het＝与连接的多态性A-147G和T-475G杂合的样品。
图2a：是引物的相对位置图，和限制性酶Tai I的识别位点图，该位点是应用错配引物3A5R1导入PCR产物的，当野生型“A”存在于-147位时就存在，当突变的“G”存在时就丢失。
图2b：是A-147G变异体每种可能的基因型即纯合野生型，杂合型和纯合突变体的限制性酶切片段的图例。
图2c：是为检测A-147G变异体而进行的3A5F2/3A5R1 PCR产物经TaiI限制性消化后的1.5％琼脂糖凝胶图。1泳道为100bp梯子，2和7未被消化的PCR产物。3泳道野生型“A”位于-147位点的纯合子样品。10，11，16是A-147G变异体的杂合子样品。
图3a：是引物的相对位置和限制性酶Alu I的识别位点。当野生型“T”位于-475时，应用错配引物3A5F2可将识别位点导入PCR产物，当变异体“G”存在时位点消失。
图3b：是T-475G变异体各种可能的基因型即纯合野生型、杂合子和纯合突变体，预期出现的限制性片段。
图3c：是Alu I限制性消化3A5F2/3A5R1 PCR产物后的12.5％聚丙烯酰胺ExcelGel，它是为了检测T-475G突变。1泳道为100bp梯子。2，5，6，7，8为野生型“T”位于-147的纯合子样品。3，4，9为T-475G突变的杂合子样品。X片段是用引物3A51/3A52对原始模板进行再扩增后产生的额外消化产物。
图4a：是连接了突变的样品(HET组)和-147与-475位点发生突变的野生型样品(WT组)间1-OHM/4-OHM代谢率的比较。显示了每一组的均值和方差，以及二组的总均值(中央线)。
图4b：是连接了突变的样品(HET组)与在-147和-475位点发生突变的野生型样品(WT组)间CYP3A5表达(转化形式)的比较。显示了每一组的均值和方差，以及二组合并的总均值(中央线)。
图5：是CYP3A5在肝脏中表达的Western blot分析结果。从肝标本中制备的微粒体与CYP3A5特异性抗体杂交的Western blot。在-147和-475连接多态性的肝标本标有*(wt组)(大小由大范围的颜色标志物(标志)以kDa表示)。
图6：是本发明中应用的寡核苷酸错配引物列表，其中下划线的核苷酸指错配序列。
图7：是与CYP3A5的DNA编码序列相关的5′侧翼区的核苷酸序列。
图8：是A-147G寡核苷酸电泳移动度转移测定(EMSA)的结果。EMSA按材料与方法中的论述进行。1泳道为没有HeLa核提取物的A-147G寡核苷酸；2-8道存在HeLa核提取物；3和4道存在50-100倍摩尔浓度过量的未标记的A-147G寡核苷酸；5和6道存在50-100倍摩尔浓度的过量未标记的野生型寡核苷酸；7和8道存在1和2 ml的抗Sp1抗体。
图9-9d：是用GCG序列分析包中的‘find patterns’程序而获得的结果。
实验过程肝微粒体制备
人肝标本从肾移植供体获得，取出后立即速冻。人肝脏微粒体的制备按以前描述的方案(21)进行，蛋白含量的测定用Miller改良的Lowry法(22)。咪达唑仑羟化酶测定
咪达唑仑总体代谢率及1-OHM和4-OHM形成的比率如下进行测定。每一培养管中含有等分的悬于1.15％KCl-0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4的微粒体(包含1mg微粒体蛋白)；10μg 6mM咪达唑仑储存液溶于DMSO中，使其终浓度达60μM；含有0.5mg葡萄糖-6-磷酸盐，0.5mg MgCl2·6H2O，0.5单位溶于0.5M Na-K-磷酸盐缓冲液，pH7.4的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和1.15％KCl-0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4的500μl共因子混合物，使培养体积达0.9ml。在37℃预培养5分钟后，加入100μl的1.25mg/ml NADP溶液使其终浓度为0.125mg/ml，开始培养。在Heto水浴摇床中以100次振荡1分钟的速率连续振荡试管。在同等条件下对煮沸的微粒体进行空白培养，作为对照培养。30分钟后将试管插入干冰中终断培养。在≤18℃储存样品备用。用有UV-监测的HPLC分析培养样品中的未转变的咪达唑仑和其代谢产物1-OHM和4-OHM。咪达唑仑代谢产物的HPLC检测
溶化1ml咪达唑仑样品，用1ml DMSO稀释。将样品超声10分钟，离心，将上清中的一整份直接注入HPLC-柱。HPLC仪包括一Waters 600MS泵。通过应用一WISP 717＋自动注射器，样品被自动注射。不锈钢柱(30cm×4.6mmi.d.)通过平衡密度匀浆程序(HaskelDSTV 122-C pump，107Pa)被填充上Kromasill 18(5μm)结合相。用Waters 996 Diode Array检测仪进行230nm的紫外检测。洗脱速度为1ml/min，开始时进行一短时间的梯度洗脱，从100％0.1M醋酸铵，pH7.0(溶剂系统A)到50％溶剂系统A和50％溶剂系统B，B包括1M醋酸铵pH7.0，甲醇和丙腈(10/45/45)，过1分钟，进行第2次梯度洗脱，在15分钟内溶剂系统B达100％。在用开始条件进行平衡前将该溶剂组分保持2分钟。咪达唑仑代谢物的鉴定用质谱进行。UV-峰面积向ng的转换通过Millennium 2020CDS系统在咪达唑仑的计算曲线上进行。该计算曲线是在注射已知量的药物(0，1059，2117，3176和5028ng)后，以及对相应的UV-峰面积进行线性回归分析后制备出的。计算曲线的公式为ng＝0.000333×面积(r2＝0.9997，n＝5)。代谢活性用pmol代谢产物/min mg蛋白质表示，每个样品代谢率的计算按其1 OHM/4 OHM的比率进行。基因组DNA制备
DNA的分离提取是应用QIAmp Tissue Kit(QIAGEN)按照厂家说明从冰冻的肝标本中进行。RNA制备
RNA的分离提取是用QIAGEN RNAeasy Midi Kit(QIAGEN)，按厂家说明书，从肝标本中制备。用无RNAse的DNAse I(BoehringerMannheim)在20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM MgCl2中处理20μg的RNA，37℃、30分钟。用酚/氧仿抽提，沉淀，重悬于30μlTE缓冲液中。取2μg和0.5μg经处理的样品进行转录，用1×第一条链缓冲液，0.01M DTT和0.5M dNTPs，0.5μg的oligo(dt)随机引物和200单位用于ABI Prism 7700 Sequence Detection System(SDS)的SuperScript II逆转录酶(GibcoBRL)进行，42℃，50分钟。CYP3A5 5′侧翼区的测序
应用引物3A51(5′-GGAAGCAACCTACATGTCCATC)和3A52(5′-ATCGCCACTTGCCTTCTTC)，从肝脏分离出的基因组DNA上PCR扩增出CYP3A5的一1343 bp的5′侧翼区，引物是以Jounaidi等(11)公开的序列为基础的。PCR条件是95℃、1min 1个循环，30个循环的95℃、1分，57℃、30秒，72℃2.5分，1个循环的72℃10分。应用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)对PCR产物进行纯化，直接用于PCR产物在正义和反义链的测序，测序通过应用ABIBigDye Terminator cycle sequencing Kit(Perkin Elmer)进行循环测序。测序反应在ABI 377自动测序仪上进行分析。列出其连接序列并用Sequence Editor Version 1.0.3软件包(Perkin Elmer)进行比较，并手工编辑以鉴定杂合体位点。A-147G和T-475G突变的PCR检测分析
所有的PCR测定方法均应用100倍稀释的原始的3A51/3A52 PCR产物作模板，在下列条件下进行反应：1循环的95℃、1分钟，30个循环的95℃、1分钟，55℃、30秒，72℃、1分钟，最后一个循环为72℃10分钟。所有的产物都测序以证实这产物为CYP3A5。在该方法中应用的寡核苷酸错配引物为：3A5F1(5′-GGGTCTGTCTGGCTGCGC)，3A5F2(5′-GGGGTCTGTCTGGCTGAGC)，和3A5R1(5′-TTATGTGCTGGAGAAGGACG)，其中错配的位点有下划线。
对于A147G突变，应用引物对3A5F2和3A5R1进行PCR。用15单位的Tai I消化20μl PCR产物，65℃3小时，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳后用溴化乙锭染色观察限制性片段。
对于T-475G突变，应用上述的引物对3A5F2和3A5R1进行PCR。用15单位的Alu I消化20μl的PCR产物，最少3小时，通过在Pharmacia Multiphor Electrophoresis system(Pharmacia)上进行12.5％ExcelGel凝胶电泳分离限制性片段。通过在Hoeffer AutomaticGel Stainder(Pharmacia)中进行银染来观察片段。
为了检测同一染色体上突变的存在，应用引物3A5F1和3A5R1进行PCR。应用15单位Mvn I对20μl PCR产物进行消化，65℃至少3小时，所得限制性片段通过1.5％琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙锭染色来进行观察。CYP3A5 RNA的相对定量和比较
CYP3A5 mRNA的相对水平通过应用ABI 7700 SDS(PerkinElmer)进行实时PCR来检测。检测CYP3A5的合适引物及探针应用Primer Express程序进行设计，并核对，以保证CYP3A5的特异性。用于定量PCR的引物为：正向5′-AAGTGGCGATGGACCTCATC-3′；反向-5′-GAGGAGCACCAGGCTGACA-3′。Taq Man探针用5′报告染料6-羧基-荧光素(FAM)进行标记，序列为5′-CAAATTTGGCGGTGGAAACCTGGC-3′。确定合适的引物/探针比率和浓度，实验按照ABI 7700 Standard Detection System的标准流程进行。所有样品的CYP3A5 mRNA表达通过对β-actin mRNA的表达标准化。循环阈值(Ct)是指PCR循环数，它是ABI 7700开始检测到与PCR产物线性扩增相关的荧光信号增加的循环数。Ct值依赖于模板原始的拷贝数。每个样品中CYP3A5的定量通过将每个样品的Ct平均在从3个独立的PCR反应进行确定。样品间Ct的相对差异的计算是从样品内的最高Ct(最低表达)减去每个样品的Ct。由于PCR产物在PCR线性范围内的每一循环内均翻倍，所以Ct的差异可通过计算2δCt转变为估算样品间mRNA量的差异，其中δCt是两个样品间循环阈的差异。
每一轮中都要有阴性对照以确保无因DNA污染而产生的信号。对照样品包括RNA样品，它被以与进行定量PCR同样的方式进行处理，但不用加逆转录酶。统计学分析
统计学分析在JMP统计程序3.2.2版本(SAS Institute Inc.)上进行。核实代谢率和CYP3A5 mRNA表达数据以确保它们符合正常分布。CYP3A5 mRNA表达数据不符合正常分布，经转化后，数据呈正常分布。应用t检验比较组间的代谢率和表达水平。Western blot分析
通过4轮10分钟的冻、沸，将40mg从每一肝中制备的微粒体蛋白溶解于等量的Laemmli样品缓冲液(Biorad)中。将样品加到pre-cast 10％SDS-PAGE Ready Gels(Biorad)上，180V电泳1h。分离开后的蛋白质被Trans-blot SD仪(Biorad)转移到Hybond-P膜(Amersham)上。用含有5％(w∶v)脱脂奶粉和0.1％(v∶v)吐温的1×PBS封闭膜，4℃、过夜。在用1×PBS 1∶3000稀释了的特异性人CYP3A5抗体(Gentest)，2.5％脱脂奶粉中室温孵育1小时，然后在1×PBS，2.5％(w∶v)脱脂奶粉，0.1％(v∶v)吐温中洗涤4次。在用1×PBS 1∶5000稀释的抗兔IgG过氧化酶缀合物(Sigma)，2.5％脱脂奶粉中室温孵育1h，如前洗涤。用ECL＋WesternBlotting Detection System(Amersham)，按照其说明书对膜进行显色，用Kodak X-Omat胶卷(Sigma)进行放射自显影，进行观察。实施例1咪达唑仑表型分析
对39例肝脏标本进行CYP3A5活性的表型分析，应用咪达唑仑代谢为1-OH咪达唑仑作为活性标志。除CYP3A4外含有CYP3A5的人肝微粒体样品与仅有CYP3A4的样品相比，呈现显著高的1-OHM/4-OHM比率。观察到同时含有CYP3A4和3A5的微粒体，其1-OHM/4-OHM的比率为5～9。仅含有CYP3A4的样品，其1-OHM/4-OHM的比率＜4(15)。在我们的数据设置中进行CYP3A5表型分析呈现一明显的双峰分布，6个样品(15％)的代谢率＞5，其余的样品的代谢率位于1.5～3.5间(见图1.a)。在39个从中制备微粒体进行代谢分析的肝标本中，有26个可获得足够的组织进行整个DNA和RNA分析，其中包括6个代谢率位于较高范围的标本。除了这26个样品之外，还有3个标本的微粒体能进行蛋白质分析，它们所有的代谢率均＜4。CYP3A5基因5′侧翼区的分析
从所有26个标本的基因组DNA PCR扩增CYP3A5的5′侧翼区，全部序列位于图7。排列表明该区域是高度保守的。除与公开的序列(表2)有几处差异外，仅鉴定出少数几个个体间差异。所有检测到的变异体均为杂合体，并且所有与非常频繁的A-147G突变杂合的样品也与T-475G突变杂合，这提示这2种突变是相联的。这两种突变属于2种独立的推测性调节元件，一个是基本转录元件(BTE：A-147G)，一个是活化蛋白-3基元序列(AP-3：T-475G)。其余的变异体没有属于推断的调节区域的。
进行PCR测定来证实A-147G和T-475G各自地存在，并确证这2个突变位于同一染色体还是不同的染色体。A-147G突变的PCR分析是建立在通过应用一种寡核苷酸错配引物(3A5R1)来建立限制性酶Tai I的识别位点。只有当野生型“A”位于-147位时，该引物才能导入一个Tai I识别位点。用Tai I消化369 bp产物时，野生型序列产生349和20bp的片段，而突变的“G”存在时则产物不能被消化(图2)。同样，检测T-475G突变时应用了第2个寡核苷酸错配引物(3A5F2)。当野生型T位于-475位时，该引物可导入一个限制性酶Alu I的限制性位点，消化产物产生318，33和18bp的片段。当突变体G存在时该位点丢失，产生的消化产物为336bp和33bp(图3)。
为了检测突变是否存在于同一染色体上，用2种寡核苷酸错配引物(3A5F1和3A5R1)进行了PCR分析，当突变体核苷酸位于-147和-475位时，2种引物均导入限制性酶Mvn I的限制性位点。如果突变存在于不同的染色体上，那么原始的369bp产物会被消化产生349/350bp和20/19bp(凝胶电泳不能分开)的产物，若存在于同一染色体上则消化后产生的产物为330和20/19bp(未列出数据)的片段。除证实样品的个体表型如通过测序所确定的外，在所有情况下，这2个突变连接在染色体上(未显示数据)。CYP3A5等位变异体，CYP3A5介导的代谢，CYP3A5 mRNA和蛋白质表达间的关系
按照基因型“野生型”或“突变体”(含有连接的多态性)对样品进行分组，比较组间1-OHM/4-OHM代谢率(mr)(图4a)。除一个无关项(肝标本号，mr＝2.08)之外，所有带有连接突变的个体，代谢率＞5.0，而野生型组的所有标本，其代谢率＜3.5。突变组的代谢率均值明显高于野生型组的(6.0±2.0对2.7±0.42；均值±标准差；p＜0.001)。
定量PCR是用于确证是否5′侧翼区的突变影响基因表达。由于mRNA水平的变异高于代谢率，观察到一定程度的双峰线(图1b)。突变体组的CYP3A5 mRNA水平倾向于表达范围的较高端，与野生型相比显示了显著性高水平的CYP3A5 mRNA(均值InCt＝4.03，标准差＝0.97，对照均值InCt＝2.06，标准差＝1.2，p＜0.006)(图4b)。在该情况下无关项(用突变体基因型而非野生型代谢率代表)也落入表达的低范围内(InCt＝2.9)。
应用CYP3A5特异性抗体，通过Western blot进行CYP3A5蛋白质表达水平的检测。在一些标本中明显出现一条与CYP3A5相对应的带。除去具有高表达基因型(突变体)和低代谢率表型(野生型)的无关项之外，所有具有高表达基因型、高代谢率和高RNA表达水平的样品，与那些具有低表达基因型和表型的样品相比，呈现明显地高水平的CYP3A5表达(图5)。具有高表达基因型而低表达表型的单个无关项，其CYP3A5的表达水平与那些属于低表达基因型的相似。长时间的Western blot暴光表明，在大多数样品中有极低量的CYP3A5表达(数据未显示)。
事实上在该研究中获得的CYP3A5 5′侧翼区的序列与Jounaidi等已公开的(11)一致，并在序列中出现几个个体间差异。有趣的是，Jounaidi等测序了2个人类基因组DNA克隆，其中一个包含在本报告中详细论述的关联的突变。这提示一个克隆来自低表达组的个体，另一个来自高表达/代谢组的个体。
以前的研究提示CYP3A5在10-30％的肝脏中表达(7，8，9)，而另外的研究讲述在所有的样品中一些表达是组成性的(10)。尽管应用所要求的步骤没有在所有的样品便利地检测到CYP3A5蛋白，但在所有研究的肝脏中检测到一些代谢活性和mRNA，所以本研究支持该发现，即一些CYP3A5表达是组成性的。我们在23％(6/26)可获得的组织样品中检测到增强了的RNA和蛋白质表达，这与以前研究中表现表达的肝部分相似。这支持Boobis等的发现(10)，即在所有肝样品中的低水平表达是组成性的，尽管只有应用更敏感的检测技术才能检测到(如PCR，而非Western或Northern blot分析)。
由于检测到的两个多态性均位于可能的转录调节元件，所以我们猜想在BTE内的变异体更似于负责这种不同的表达，因为有报道，位于TATA box侧翼的BTE负责CYP1A1的组成性表达，并且在几个其它的CYP基因中也找到相似的区域，该CYP基因包括CYP2B1，CYP2B2，CYP2E1(16)，CYP3A4(13)和CYP3A7(12)。在CYP3A4基因中发现该元件结合有核提取物(13)，并结合有CYP3A7的基本转录元件结合因子(12)，这指出该区域在细胞色素P450表达的整体控制中的作用。这些描述的在等位异构体中CYP3A5上调表达的确切机制尚需确定，尽管在BTE中存在突变中的一个，以及该元件对其它P450s表达的相关性提示了一种可能的机制性关联。应用甲基化干涉的足迹法表明，BTE中的所有鸟嘌呤残基及邻近区域中的鸟嘌呤残基与转录子Sp1相互作用(19)。假若这里描述的BTE(Sp1)中的突变将腺嘌呤改为鸟嘌呤，那么这将有利于转录子结合到Sp1的不同变异体上。
尽管在纯合子组和杂合子组观察到的CYP3A5 mRAN水平范围有相当的部分重叠，但代谢率的分布如同CYP3A5的数量一样是双峰。我们不能排除存在其它可影响CYP3A5翻译效率或蛋白稳定的多态性。但考虑到DNA多态性和蛋白质水平的较好的相关性，以及RNA的不利影响，较为简单的解释就是不同的RNA降解或产物(由于在样品处理中不同)模糊了高表达和低表达间的差别。无论如何解释在mRNA水平的差异，均不能消除DNA多态性的预测价值。
但是有一例，它的基因型(杂合突变)不能预测其代谢表型(低表达)。在该无关项中CYP3A5蛋白和mRNA水平均低的事实表明解释必须在转录水平上考虑，即在转录因子调节CYP3A5表达上考虑。
BTEB基因5′非翻译区的一AUG元件被证实，至少部分负责BTEB的细胞特异性翻译调控(20)。该区内的突变影响BTEB翻译。因此，尽管我们研究中出现的无关项具有CYP3A5的高表达基因型，但该个体也许具有“弱”的BTEB表达表型。此外，也有可能一种与负责诱导CYP1A1表达的机制相似的机制也影响CYP3A5表达。除BTE之外，CYP1A1表达由外生素的反应性元件(XRE)介导。在这种情况下，诱导子通过结合胞浆受体(Ah受体)，被转移到核(也许与在Arnt基因编码的辅助性蛋白相关)，在核内与XRE结合，由此而增强表达(17，18)。尽管在这些和其它转录子中的突变会进一步调节CYP3A5表达，但这并不抵触这一事实，即这里描述的多态性似乎是CYP3A5表达的主要决定因素，至少在肝中是这样。
尽管获得了相对小量的样品用于本研究中的分析，但一方面发现了两个相关多态性间的密切关系，另一方面发现二者均表达及在肝中的CYP3A5 mRNA、蛋白质和活性水平。CYP3A5多态性代谢的遗传学机制的阐明将在药物遗传学领域产生重要影响。应用基因分型预测代谢的可行性将大大有利于疾病相关基因，并且可帮助解释对由该细胞色素P450异构体代谢的治疗物产生不同反应或弱反应的原因。它还可帮助描述哪些影响CYP3A5活性的因素是遗传学的，哪些是环境的；为了全部弄清楚用该酶观察到的复杂的表达变化，还需进行更深入的工作。可能的启动子序列分析材料和方法：
应用GCG序列分析包(GCG，Madison，Wisconsin)的“findpatterns”程序分析CYP3A5调节区的序列。该程序发现特异的DNA序列基元序列，模式，和转录结合位点，其序列储存于程序中，并呈现于目标序列中。在该分析中，在目标序列中，最多允许在每一模式中出现一个错配或错误，检测两个报道的变异是否改变任何已知的基元序列或转录结合位点。结果在图9～9d中显示。第一，GCGTG到GCTTG的变异
移去了MBF-I CS，MRE-CS2和CNBP-SRE的结合位点。第二，CCACC到CCGCC的变异
用GCF-共有序列，APRT-小鼠_US，GC-box_(1)，DSE_(1)，Sp1_CS4，Sp1_hsp70_(1)，hsp70.2，Sp1-IE-3.3，Sp1-IE-4/5，IRE(1)，Sp1-TPI(4)替代了apoE-未鉴定的位点-3，ApoE B1，APRT-CHO US和APRT-人US的结合位点，不影响Yi-共有模式。
两种突变均影响转录调节位点。电泳迁移率漂移测定(EMSA)
应用Geneka Biotechnology Icn.(Montreal，Canada)的Sp1NUSHIFT Kit，按照其说明书进行EMSA。主要地，应用T4多核苷酸激酶，对一31-mer与包含A-147G多态性(5′-GGC AGC TGC AGCCCC GCC TCC TTC TCC AGC A-3′)的CYP3A5 5′-非翻译区一致的双链寡核苷酸进行P-32的末端标记。50,000cpm(0.5ng)的寡核苷酸与2μg HeLa核提取物16℃孵育30分。未标记的突变型或野生型(5′-GGC AGC TGC AGC CCC ACC TCC TTC TCC AGC A-3′)寡核苷酸以50倍或100倍过量加入。核提取物、抗-Sp1抗体和结合缓冲液购自Geneka Biotechnology Inc。将TGE缓冲液(25mM Tris，190mM Glycine，1mM EDTA，pH8.3)中的样品分别加到5％聚丙烯酰胺(39∶1)胶上。干胶暴光到X-线胶片上。结果
CYP3A5基因5′-非翻译区的分析表明A-147G多态性可制造一个转录子Sp1的结合位点。进行电泳迁移率漂移测定(EMSA)以验证该假说。用一含有A-147G多态性的寡核苷酸来测定存在于HeLa核提取物中的转录子。可以观察到一条带漂移(图8，2泳道)，它可分别被50倍和100倍过量的非标记的寡核苷酸竞争掉(图8，3和4道)，使用野型寡核苷酸竞争不掉(图8，5和6道)。这清楚的表明，在HeLa核提取物中存在一种蛋白因子，它能与A-147G多态性区域结合，而不能与野生型区域结合。在转录子Sp1的特异性抗体存在的情况下进行孵育，可导致A-147G多态性寡核苷酸的超转移(图8，7和8道)，这表明Sp1与A-147G多态性位点结合。
这种转录子Sp1对CYP3A5基因5′-非翻译区结合亲和力的改变也许可解释从A-147G多态性启动子开始的转录增加，顺便地有助于与A-147G多态性相关的代谢率的增加。细胞色素表达的基因定型
对300名健康的Caucasian志愿者进行细胞色素P450 3A5基因T-475＞G和A-147＞G变异的基因分型。试验合理性
第一个目标集中在等位基因/基因型频率。
因为第一批实验仅包括30-35个不同的个体，所以未检测等位基因/基因型频率。对300人进行基因定型应该允许这些频率的测定，并且要核实是否与Hardy-Weinberg平衡定律相符。
第二个目标集中于这2个突变的相关性。在最初的研究中，所有具有基因突变的样品(总共只有6个)，T-475＞G和A-147＞G是相关的。为了证实预示的相关性，在较大人群中对CYP 3A5的两种多态性进行基因分型。材料与方法
为了减少基因分型的错误，从300个健康Cauacsian志愿者获得的基因组DNA在微量滴度板为基础的模板中进行基因分型，这样可保证每一样品的双盲和完全独立的重复分析。
用引物3A51/3A52从基因组DNA中PCR扩增出CYP3A5的1343bp的5′侧翼区。应用1/100稀释了的原初的3A51/3A52 PCR产物作模板，对两个变异进行PCR分析。在2种分析中均应用错配引物3A5F2和3A5R1。对于A-147＞G突变，用限制性酶Tai I消化PCR产物；对于T-475＞G突变，用限制性酶Alu I消化PCR产物。消化以后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离限制性条带，用银染来观察。由两个独立的观察者观察结果，在观察到的DNA片段图案的基础上进行基因分型。结果1.等位基因/基因型频率
在300个体的人群中，53个杂合体(18％)携有一个拷贝的每一种变异，246个人(82％)是A-147和T-475纯合体，一个人(0.3％)在两个等位基因上均有G-147和G-475变异(纯合体)。这些频率与前面研究中发现的3A5表达(7，8，9)一致。等位基因频率与Hardy-Weinberg平衡一致(表3)。
2. T-475＞G和A-147＞G变异的相关性
在所有的个体中，单个的T-475和A-147变异和G-475和G-147变异同等地出现于基因型的，表明2种突变间存在很强的相关性。2种变异间的相关是否具有功能上的意义还需进一步证实。作为相关的结果，以后的基因分型将只要求变异中的一种的分析，无论它是否为功能性变异体。参考文献
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引物 起点#位置* 序列(5′-3′) 3A51 F-1237--1217 GGAAGCAACCTACATGTCCATC 3A5p01 F-978--963 AGTACAGGGAGCACAG 3A5p08 R-917--932 CACCTATTCATTCCTG 3A5p02 F-698--684 TGCTATCACCACAGAC 3A5p07 R-689-704 GGTGATAGCAATAGAC 3A5p03 F-364--349 AGGATGTGTAGGAGTC 3A5p06 R-417--434 CCTCACACAGATGTAACC 3A5p04 F-176--161 TAAGAACTCAGGTTCC 3A5p05 R-178--194 CAGAAACTGAAGTGGAG 3A52 R+105-+87 ATCGCCACTTGCCTTCTTC#F＝5′→3′，R＝3′→5′*引物位置是以Jounaidi等(11)的CYP3A5序列为基础
表2.位置 变异体序列百分率-475 T-K(T或G)杂合体30.6％(11/36)-147 A-R(A或G)杂合体30.6％(11/36)
表3.Hardy Weinberg平衡试验 试验：CYP3A5-45A＞G
人群：CON-JRF-1
观察值 预期值
N 机率 N 机率基因型AA 246 0.820 247.5 0.825基因型AG 53 0.177 50.0 0.167基因型GG 1 0.003 2.5 0.008总共 300 1 300 11.112＝Chi-方差(人)0.292＝p值1＝d.f.
N 机率等位基因A 545 0.908等位基因G 55 0.092