一种磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法.pdf

本发明涉及一种磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法，包括：将壳聚糖粉末与不同比例的双取代胆碱膦酸酯，在碱、四氯化碳和仲醇的混合体系中，于0～40℃反应12～24小时，再经碱液水解处理，制得具有不同偶联率的磷酸胆碱壳聚糖衍生物。本发明制备的磷酸胆碱壳聚糖衍生物在壳聚糖高分子骨架上引入仿生结构的磷酸胆碱基团，改善了其生物功能性和生物相容性。可作为生物医用材料在药物和基因载体、组织工程支架、生物医用膜、水凝胶、生物智能器件等领域得到广泛应用。

权利要求书
1、  一种磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将壳聚糖与双取代胆碱膦酸酯按照壳聚糖中的氨基与双取代胆碱膦酸酯中的膦酸酯的摩尔比1∶0.5～20的比例投入到反应介质中，于0～40℃反应12～24小时，旋干溶剂，加入碱性水溶液，水解0.5～12小时得到反应液；
(2)步骤(1)得到的反应液经乙醇沉淀、过滤、洗涤、干燥，得到磷酸胆碱壳聚糖衍生物；

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述壳聚糖选用脱乙酰度为50％～100％、分子量为5000～500万的壳聚糖。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2∶1在二甲亚砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述反应介质选用碱、四氯化碳或仲醇。

5、  根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的仲醇为异丙醇或2-丁醇。

6、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱性水溶液为氨水、氢氧化钾或氢氧化钠水溶液。

说明书一种磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法
技术领域
本发明涉及一种磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法。属于生物降解型医用材料的仿生技术改性领域。
背景技术
壳聚糖是一种毒性极低，并具有良好的生物相容性和生物可降解性的天然碱性高分子，其分子结构中含有游离氨基和羟基，可进一步进行化学修饰，引入多种功能基团或偶联上具有特殊性能的分子。因此，壳聚糖及其衍生物在农业、食品工业、环境保护和医药卫生等领域应用广泛，尤其在医药卫生领域，可用于创伤愈合、药物控制释放、组织工程等方面。
由于壳聚糖本身具有易发生非特异性蛋白质吸附等性质，使其实际应用效果受到影响。例如，壳聚糖基的纳米药物/基因载体系统在血液中易迅速激活异物识别系统，使之被捕捉和吞食，从而减少了在血液中的滞留时间，也影响其靶向性，进而影响药效；在组织工程方面，非特异性蛋白质吸附将影响支架对生物活性物质的特异性相互作用，不利于实现细胞的特异识别和希望的组织生长。
仿生材料来源于材料科学与生物技术的交叉，是指模仿生物体的各种特点或特性而开发的材料，可以是结构仿生或功能仿生的材料，也可以是采用过程仿生的组装行为，制备结构与功能仿生的材料。用于人体的生物医用高分子，首先要求其具有生物功能性(在体内能够发挥所期望的功能或诱发预期的反应)和生物相容性；而引入仿生化学结构，可以改善医用高分子的生物功能性，并进一步提高其生物相容性。已有文献报道具有仿生物膜结构的磷酸胆碱基团的高分子材料通过抑制非特异性蛋白质吸附来改善其生物相容性，可以在包括移植材料、导管和药物输运系统等许多医用装置中得到应用。[1.L.Ruiz，J.G.Hilborn，D.Léonard，etc，Synthesis，Structure and Surface Dynamics of Phosphorylcholine FunctionalBiomimicking Polymers，Biomaterials，19，987～998(1998).2.T.Konno，K.Kurita，Y.Iwasaki，etc，Preparation of Nanoparticles Composed withBioinspired 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine Polymer，Biomaterials，22，1883～1889(2001).3.A.L.Lewis，J.Berwick，M.C.Davies，etc，Synthesis and Characterisation of Cationically Modified PhospholipidPolymers，Biomaterials，25，3099～3108(2004).]
若通过对壳聚糖直接进行磷化学改性，在其分子骨架上引入仿生物膜结构的磷酸胆碱基团，则可以在保持壳聚糖的生物降解性和其他优良的生物医学活性基础上，抑制其与生物体的非特异性作用，从而进一步改善其生物功能性和生物相容性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法，通过对壳聚糖进行磷化学改性，引入仿生物膜结构的两性磷酸胆碱基团，以进一步改善壳聚糖的生物功能性和生物相容性，得到的磷酸胆碱壳聚糖衍生物可作为生物医用材料在药物和基因载体、组织工程支架、生物医用膜、水凝胶、生物智能器件等领域中广泛应用。
本发明的磷酸胆碱壳聚糖衍生物的合成方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖与双取代胆碱膦酸酯按照壳聚糖中的氨基与双取代胆碱膦酸酯中的膦酸酯的摩尔比1∶0.5～20的比例投入到反应介质中，于0～40℃反应12～24小时，旋干溶剂，加入碱性水溶液，水解0.5～12小时得到反应液；
(2)步骤(1)得到的反应液经乙醇沉淀、过滤、洗涤、干燥，得到磷酸胆碱壳聚糖衍生物；
本发明的优选方案如下：
步骤(1)所述壳聚糖优选脱乙酰度为50％～100％、分子量为5000～500万的壳聚糖。
步骤(1)所述双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2∶1在二甲亚砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得。
步骤(1)所述反应介质优选碱、四氯化碳或仲醇。
所述的仲醇优选异丙醇或2-丁醇。
步骤(1)中所述的碱性水溶液优选氨水、氢氧化钾或氢氧化钠水溶液。
采用本发明方法制备磷酸胆碱壳聚糖衍生物的反应式如下：

本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明方法制备的磷酸胆碱壳聚糖衍生物，由于引入了仿生物膜结构的两性磷酸胆碱基团，一方面其水溶性得到改善，例如，取代度达到20％的磷酸胆碱壳聚糖衍生物不仅可溶解于酸性水溶液，也可溶解于中性和碱性水溶液中；另一方面，可抑制其在体内对蛋白质的非特异性吸附，使该衍生物的生物功能性和生物相容性得到有效改善，例如，磷酸胆碱壳聚糖衍生物制备的药物载体微球较壳聚糖微球对血液中蛋白质的吸附显著减少，有利于延长药物载体在血液中的停留时间，改善药效。
具体实施方式
实施例1
(1)制备双取代胆碱膦酸酯
将0.01mol的氯化胆碱溶于30～50ml二甲亚砜，加热真空干燥，完全除去水分，再加入0.005mol的对苯氧基膦酸酯和3～5ml的无水吡啶，在常温下搅拌反应2小时制得双取代胆碱膦酸酯溶液。
(2)制备磷酸胆碱壳聚糖衍生物
将步骤(1)制备的双取代胆碱膦酸酯溶液旋干溶剂，溶解于无水异丙醇中得到反应液A。
将0.0005mol的脱乙酰度50％、分子量228000的壳聚糖粉末在真空烘箱内50℃干燥24小时，脱去表面的吸附水，加入干燥处理的3ml的三乙胺、2ml的四氯化碳、5ml的异丙醇混合溶剂作为分散剂，得到反应液B。在室温下将反应液A逐渐滴入反应液B，搅拌反应24小时，得到双胆碱磷酰化壳聚糖衍生物。旋干溶剂，再加入20ml氨水常温下搅拌5小时，用乙醇沉淀并洗涤，真空干燥，得到磷酸胆碱壳聚糖衍生物产物，得率81％。
实施例2
(1)制备双取代胆碱膦酸酯
将0.02mol的氯化胆碱溶于60～120ml二甲亚砜，加热真空干燥，完全除去水分，再加入0.01mol的对苯氧基膦酸酯和6～10ml的无水吡啶，在常温下搅拌反应2小时制得双取代胆碱膦酸酯。
(2)制备磷酸胆碱壳聚糖衍生物
将步骤(1)制备的双取代胆碱膦酸酯溶液旋干溶剂，溶解于无水2-丁醇中得到反应液A。
将0.005mol的脱乙酰度80％、分子量46000的壳聚糖粉末在真空烘箱内50℃干燥24小时，脱去表面的吸附水，加入干燥处理的6ml的三乙胺、3ml的四氯化碳、10ml的2-丁醇混合溶剂作为分散剂，得到反应液B。在40℃中，将反应液A逐渐滴入反应液B，常温下搅拌反应12小时，得到双胆碱磷酰化壳聚糖衍生物。旋干溶剂，再加入20ml的0.1M氢氧化钠溶液常温下搅拌2小时，用乙醇沉淀并洗涤，真空干燥，得到磷酸胆碱壳聚糖衍生物产物，得率78％。
实施例3
(1)制备双取代胆碱膦酸酯
将0.01mol的氯化胆碱溶于30～50ml二甲亚砜，加热真空干燥，完全除去水分，再加入0.005mol的对苯氧基膦酸酯和3～5ml的无水吡啶，在常温下搅拌反应2小时制得双取代胆碱膦酸酯溶液。
(2)制备磷酸胆碱壳聚糖衍生物
将步骤(1)制备的双取代胆碱膦酸酯溶液旋干溶剂，溶解于无水异丙醇中得到反应液A。
将0.005mol的脱乙酰度100％、分子量5000的壳聚糖粉末在真空烘箱内50℃干燥24小时，脱去表面的吸附水，加入干燥处理的3ml的三乙胺、1.5ml的四氯化碳、10ml的异丙醇混合溶剂作为分散剂，得到反应液B。在冰水浴中，将反应液A逐渐滴入反应液B，常温下搅拌反应12小时，得到双胆碱磷酰化壳聚糖衍生物。旋干溶剂，再加入20ml氨水常温下搅拌5小时，用乙醇沉淀并洗涤，真空干燥，得到磷酸胆碱壳聚糖衍生物产物，得率85％。
核磁共振测试对实施例得到的磷酸胆碱壳聚糖衍生物的结构表征如下：31P NMRat 293 K(D2O)：δ6.81(-NH-PC)；1H NMR at 293 K(D2O)：δ2.89(br，H2 ofGlcN and GlcN-PC)，3.22(s，-N+(CH3)3)，3.63～4.06(m，N+CH2-，H3，H4，H5，H6of GlcN and GlcN-PC)，4.28(br，OPOCH2-)，4.52(br，H1 of GlcN-PC)，4.59(br，H1 of GlcN)；13C NMR at 293 K(D2O)：δ54.0((CH3)3N+)，56.4(N+CH2-)，58.5(C2of GlcN)，60.2(C6 of GlcN)，66.3(OPOCH2-)，72.9(C3 of GlcN)，74.9(C5 ofGlcN)，77.5(C4 of GlcN)，100.7(C1 of GlcN)，102.7(C1 of GlcN-PC)。该表征证实测试物是磷酸胆碱壳聚糖衍生物。