血管周围间充质前体细胞.pdf

间充质前体细胞已经利用血管周围标记从广泛的组织中从血管周围生态位中分离。本发明描述了一种新的间充质前体细胞表型，其特征在于存在血管周围标记3G5，优选还存在α－平滑肌肌动蛋白及早期发育标记如MUC18、VCAM－1和STRO－1bri。血管周围间充质前体细胞是多能的并且显示出形成血管组织以及骨髓、牙本质和牙髓。本发明还描述了一种基于这些标记而使用细胞分选进行富集的方法。

权利要求书
1.  一种分离的哺乳动物细胞，其是多能的和/或是多能的并且对于表面标记3G5是阳性的。

2.  权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞具有形成间充质来源的至少三种分化的细胞类型及外胚层和内胚层来源的至少一种其它分化的细胞类型的分化能力。

3.  权利要求1的分离的细胞，其中所述细胞是间充质前体细胞(MPC)。

4.  权利要求3的分离的MPC，其中所述细胞共表达标记MUC18/CD146。

5.  权利要求3的分离的MPC，其中所述细胞共表达标记α-平滑肌肌动蛋白。

6.  权利要求3的分离的MPC，其中所述细胞共表达标记STRO-1bri。

7.  权利要求3的分离的MPC，其中所述细胞共表达选自但不限于如下的标记：THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD61、整联蛋白β5和6-19、凝血调节蛋白、CD10、CD13、SCF、STRO-1bri、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2)。

8.  权利要求3的分离的MPC，其中所述细胞共表达标记STRO-1bri、MUC18/CD146和α-平滑肌肌动蛋白。

9.  权利要求3的分离的MPC，其中所述细胞对于造血标记CD45、CD34和血型糖蛋白A是阴性的。

10.  权利要求1或3的分离的细胞，其中所述细胞分离自如下一组组织，所述的组包含但不限于：脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱、和骨骼肌。

11.  一种能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的间充质前体细胞(MPC)，其分离自包含但不限于如下的组织：脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌，并且其对于表面标记STRO-1bri是阳性的。

12.  权利要求11的分离的细胞，其中所述MPC共表达标记MUC-18/CD146或α-平滑肌肌动蛋白。

13.  权利要求11的分离的细胞，其中所述MPC共表达选自但不限于如下的标记：THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD61、整联蛋白β5和6-19、凝血调节蛋白、CD10、CD13、SCF、STRO-1bri、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2)。

14.  权利要求11的分离的MPC，其中所述细胞对于造血标记CD45、CD34和血型糖蛋白A是阴性的。

15.  权利要求1、3或11的分离的细胞，其中所述细胞分离自哺乳动物。

16.  权利要求1、3或11的分离的细胞，其中所述哺乳动物是人。

17.  权利要求1、3或11的分离的细胞，其中所述细胞具有被诱导分化形成包括至少如下一或多种细胞类型的细胞的能力：成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

18.  一种得自权利要求1、3或11的分离的细胞的分化的子代细胞，其中所述子代细胞至少是成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

19.  一种未扩增的细胞群，其富集有权利要求3或11的间充质前体细胞(MPC)。

20.  一种未扩增的细胞群，其富集有间充质前体细胞(MPC)，能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型，所述MPC共表达表面标记MUC18/CD146和α-平滑肌肌动蛋白。

21.  权利要求20的富集细胞群，其中MPC额外对于标记STRO-1bri是阳性的。

22.  权利要求20的富集细胞群，其中MPC额外对于标记3G5是阳性的。

23.  权利要求20的富集细胞群，其中MPC共表达MUC18/CD146、α-平滑肌肌动蛋白、STRO-1bri和3G5。

24.  权利要求19或20的富集细胞群，其中MPC对于造血标记CD34、CD45和血型糖蛋白-A是阴性的。

25.  权利要求19或20的富集细胞群，其包含至少0.01％的能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的MPC。

26.  权利要求19或20的富集细胞群，其包含至少0.1％的能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的MPC。

27.  权利要求19或20的富集细胞群，其包含至少1％的能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的MPC。

28.  权利要求19或20的富集细胞群，其包含至少0.01％STRO-1bri MPC。

29.  权利要求19或20的富集细胞群，其包含至少0.1％STRO-1briMPC。

30.  权利要求19或20的富集细胞群，其包含至少1％STRO-1briMPC。

31.  权利要求19、20、21、22或23的富集细胞群，其中所述细胞群具有被诱导分化形成包含如下至少一或多种细胞类型的细胞的能力：成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

32.  权利要求19、20、21、22或23的富集细胞群，其中所述细胞群从包含但不限于如下的组织中富集：脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

33.  得自权利要求19、20、21、22或23的富集细胞群的分化的子代细胞，其中所述子代细胞至少是成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

34.  权利要求19、20、21、22或23的富集细胞群，其中所述富集的细胞群是扩增的。

35.  权利要求34的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包含至少0.1％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

36.  权利要求34的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包含至少1％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

37.  权利要求34的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包含至少2％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

38.  权利要求34的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包含至少5％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

39.  权利要求34的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包含至少10％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

40.  一种富集间充质前体细胞(MPC)的方法，所述方法包括从血管化的源组织中制备单细胞悬浮液的步骤，以及基于血管化的组织中由血管周围细胞表达的标记的存在而进行富集的步骤。

41.  权利要求40的方法，其中血管化的源组织包含但不限于如下组织：脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

42.  权利要求40的方法，其中所述富集步骤基于标记3G5的存在而进行。

43.  权利要求40的方法，其中所述富集步骤基于标记MUC18/CD146的存在而进行。

44.  权利要求40的方法，其中所述富集步骤基于标记STRO-1bri的存在而进行。

45.  权利要求42、43或44的方法，其中所述富集步骤基于额外存在一或多个标记而进行。

46.  权利要求42、43或44的方法，其中所述富集步骤基于额外存在选自包含但不限于如下的一或多个标记而进行：THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD61、整联蛋白β5和6-19、凝血调节蛋白、CD10、CD13、SCF、STRO-1bri、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2)。

47.  权利要求40的富集MPC的方法，其中所述MPC共表达标记3G5、STRO-1bri、MUC18/CD146和α-平滑肌肌动蛋白。

48.  权利要求42、43或44的方法，其中所述富集步骤基于额外不存在表示定型或造血系分化的表面标记而进行。

49.  权利要求48的方法，其中所述细胞不表达造血标记CD34、CD45或血型糖蛋白A。

50.  权利要求40的方法，其中所述富集的MPC能分化为包括如下一或多种细胞类型的细胞：成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞，或少突胶质细胞。

51.  权利要求40的方法，其中富集MPC的源组织选自包含但不限于如下组织：脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

52.  权利要求40的方法，其中所述用于富集MPC的源组织是哺乳动物。

53.  权利要求40的方法，其中所述用于富集MPC的源组织是人。

54.  权利要求40的方法，其中富集的细胞群包含至少0.01％的能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的MPC。

55.  权利要求40的方法，其中富集的细胞群包含至少0.1％的能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的MPC。

56.  权利要求40的方法，其中富集的细胞群包含至少1％的能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型的MPC。

57.  权利要求40的方法，其中所述富集步骤基于标记3G5的存在而进行，所述方法进一步包括在富集后扩增该细胞群的步骤。

58.  权利要求40的方法，其中所述富集步骤基于标记MUC18/CD146的存在而进行，所述方法进一步包括在富集后扩增该细胞群的步骤。

59.  权利要求40的方法，其中所述富集步骤基于标记STRO-1的存在而进行，所述方法进一步包括在富集后扩增该细胞群的步骤。

60.  权利要求57、58或59的方法，其中所述扩增的细胞群包含至少0.1％的表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

61.  权利要求57、58或59的方法，其中所述扩增的细胞群包含至少1％的表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

62.  权利要求57、58或59的方法，其中所述扩增的细胞群包含至少2％的表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

63.  权利要求57、58或59的方法，其中所述扩增的细胞群包含至少5％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

64.  权利要求57、58或59的方法，其中所述扩增的细胞群包含至少10％的高水平表达一或多个标记STRO-1bri、3G5或MUC18/CD146的细胞。

65.  权利要求57、58或59的方法，其中所述扩增的细胞群包含如下至少一或多种细胞类型的细胞：成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

66.  权利要求34的扩增MPC的方法，其通过将细胞在补加了生长因子的培养基中培养进行。

67.  权利要求66的方法，其中所述生长因子选自包含但不限于PDGF、EGF、FGF、IGF、VEGF和LIF的一组。

说明书血管周围间充质前体细胞
发明领域
本发明涉及间充质前体细胞，及携带血管周围标记的这种前体细胞亚群的分离。
发明背景
由于间充质前体细胞(mesenchymal precursor cell)在医学应用方面的潜力，针对分离和富集间充质前体细胞已经进行了许多尝试。Pittinger et al.，(1999)显示出克隆发生细胞(clonogenic cell)从骨髓中的扩增，并描述了扩大的间充质干细胞的制备。这种方法的最近实例提供了从骨髓中相对高产量生产的方法，见Simmons等的公开WO01/04268所述。
然而，迄今为止还未有可以从广泛的组织中分离间充质前体细胞的方法的实例。
发明概述
本发明建立在发现多能间充质前体细胞(MPC)群存在于血管周围生态位中的基础上。WO01/0426指出除了单一的组织骨髓之外还有MPC来源的更广泛的组织类型。本发明建立在另外发现富集的MPC群可以分化为由标记3G5区别的两种群体的基础上。认为3G5阳性的MPC特别用于新血管形成，尽管它们确实也显示出分化为其它组织类型。本发明另外发现本发明的优选的富集细胞群中存在的MPC的水平能产生足够数目的定型细胞(committed cell)以提供许多分化的组织类型。
本发明第一方面的第一种形式涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的方法，所述方法包括制备从血管化的源组织(vascularizedsource tissue)中制备单细胞悬浮液的步骤，及基于早期血管周围细胞标记的存在进行富集的步骤。
本发明第一方面的第二种形式涉及一种富集间充质前体细胞的方法，所述方法包括从非骨髓的血管化的源组织中制备单细胞悬浮液的步骤，及将组织分离成单独的细胞的步骤，以及基于一或多个早期发育标记的存在或水平和表示定型的一或多个表面标记的不存在而进行富集的步骤。
本发明第一方面的第三种形式涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的方法，所述方法包括从血管化的源组织中制备单细胞悬浮液的步骤，及基于在血管化的组织中由血管周围细胞表达的标记的存在情况而进行富集。
本发明的第二方面涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的富集的细胞群，所述MPC具有3G5、MUC18、VCAM-1、STRO-1bri和α-平滑肌肌动蛋白的表型。
本发明第三方面的第一种形式涉及一种分离的间充质前体细胞(MPC)，所述MPC具有3G5、MUC18、VCAM-1、STRO-1bri和α-平滑肌肌动蛋白的表型。
本发明的第三方面的第二种形式涉及一种分离的哺乳动物细胞，其是多能的并且对于表面标记3G5是阳性的。
本发明的第三方面的第三种形式涉及一种间充质前体细胞(MPC)，其能形成克隆发生集落(clonogenic colony)并分化为三或多种间充质组织类型，分离自包含但不限于脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌的组织，并且对于表面标记STRO-1是阳性的。
本发明的第三方面的第四方面涉及一种富集间充质前体细胞(MPC)的未被扩增的细胞群，其能形成克隆发生集落并分化为三或多种间充质组织类型，所述MPC共表达表面标记MUC18/CD146和α-平滑肌肌动蛋白。
本发明的第四方面涉及一种优选地从本发明的第三方面产生的分化的子代细胞，其中所述子代细胞至少是成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心脏肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

附图简述
图1.用抗-CD146(CC9)共标记的STRO-1+MACS-分离地细胞的性质。(A)分选区R1代表双阳性的STRO-1BRT/CD146+细胞群。(B)基于STRO-1BRT/CD146+表达的克隆发生细胞集落(＞50个细胞)的发生率使用泊松分布分析，从5个独立的实验中通过对每个细胞浓度的24个重复进行限制稀释分析确定。图中显示出了BMMNC(C)、STRO-1int/CD146-细胞(D)和STRO-1BRT/CD146+细胞(E)的前向(大小)和垂直(粒度)光散射特性。(F)STRO-1BRT/CD146+分选的骨髓细胞针对CBFA1(泳道2)、骨钙蛋白(泳道4)和GAPDH(泳道6)转录体的RT-PCR分析。图中还显示出了表达CBFA1(泳道1)、骨钙蛋白(泳道3)、和GAPDH(泳道5)的对照细胞(在存在地塞米松的情况下生长的BMSSC培养物)。将反应混合物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，并通过溴化乙啶染色观测。(G)CD146在接近骨(b)表面的人骨髓(bm)切片中血管(bv)壁(箭头所指)上的原位表达，20X。切片用苏木精复染。(H)双重免疫荧光染色表明在人骨髓的冷冻切片中用德克萨斯红标记的STRO-1抗体和用异硫氰酸荧光素标记的CC9抗体与血管壁的反应性。
图2：DPSC在体内的免疫表型分析。柱状图描述了在基于与识别STRO-1、CD146、和3G5的抗体及同种型匹配的阴性对照抗体的反应性进行免疫磁珠选择之后从牙髓的单细胞悬浮液中回收的克隆发生集落的数目。数据以从三个独立的实验平均的在珠阳性细胞级分中获得的集落形成单位的数目与未分级分离的髓细胞的集落总数的百分比表示。统计学显著性(*)使用斯氏t-检验(p＜0.01)对比每个抗体与相应的同种型匹配的对照抗体的集落总数百分比而确定。
图3：牙髓中血管周围标记的反应性。(A)STRO-1抗原在人牙髓(p)血管(小箭头所指)和围绕神经束(nb)的周围神经束膜(大箭头所指)上的免疫定位，20X。(B)双重免疫荧光染色表明用德克萨斯红标记的STRO-1抗体与牙髓神经束膜(箭头所指)的反应性，组合用异硫氰酸荧光素标记的抗神经丝抗体染色内部神经束(nb)，40X。(C)CD146抗原在人牙髓组织的血管壁的免疫定位，20X。(D)双重免疫荧光染色表明用德克萨斯红标记的STRO-1抗体及用异硫氰酸荧光素标记的CC9抗体与血管的反应性。(E)用兔多克隆抗DSP抗体(箭头所指)的牙髓组织对成牙本质细胞外层(od)的免疫组织化学染色，20X。(F)3G5与血管(bv)壁中单一周细胞(箭头所指)的反应性，40X。组织切片用苏木精复染色。
图4.3G5与BMSSC的反应性。(A)代表性柱状图描述了表达CD146(PE)和3G5(FITC)的全骨髓单核细胞(BMMNC)的典型双重颜色FACS分析图示。(B)对于观测到的所有不同的表达模式(区域R1-6)进行集落效率分析(colony efficiency analysis)。数据以从三个独立实验中平均的每个细胞级分的集落形成单位的平均发生率表示。
图5.纯化的BMSSC和DPSC在体内的发育潜力。MACS/FACS分离的STRO-1BRT/CD146+骨髓细胞的cytospin制品(箭头所指)用特异于α-平滑肌肌动蛋白(A)和冯·维勒布兰德因子(B)的抗体染色。通过免疫磁珠(小箭头所指的为磁珠)选择分离CD146+髓细胞(大箭头所指)，用特异于α-平滑肌肌动蛋白(C)和冯·维勒布兰德因子(D)的抗体染色。(E)来自衍生自与HA/TCP移植进无免疫应答的小鼠3个月的STRO-1BRT/CD146+BMSSC的回体(ex vivo)扩增的细胞的异常骨形成(b)和造血/脂肪发生骨髓(bm)。(F)来自衍生自与HA/TCP移植进无免疫应答的小鼠3个月的CD146+DPSC的回体扩增的细胞的异常牙本质形成(d)和纤维状牙髓组织(p)。切片用苏木精-伊红染色。
图6：CD34、CD45和血型糖蛋白-A在STRO-1阳性的骨髓单核细胞上的表达。代表性的柱状图描述了最初通过磁性激活的分选及与抗CD34(A)、CD45(B)或血型糖蛋白-A(C)的抗体共染色而分离的STRO-1阳性骨髓单核细胞的典型的双重颜色流式细胞术图。STRO-1抗体使用山羊抗鼠IgM-异硫氰酸荧光素鉴别，而CD34、CD45和血型糖蛋白-A使用山羊抗鼠IgG-藻红蛋白鉴别。含有克隆发生MPC群的高表达的STRO-1级分通过基于区域R1和R2的荧光激活的细胞分选而分离。
图7：骨髓MPC是STRO-1阳性(bright)，CD34阴性，CD45阴性及血型糖蛋白-A阴性的。该图描述了对于基于如图6所示R1和R2区域，通过其共表达或缺乏CD34、CD45或血型糖蛋白-A抗原而选择的每个不同分选的STRO-1阳性(bright)群进行的体外粘着集落形成分析的结果。这些数据以从两个独立实验中平均的每个细胞级分的集落形成单位的平均发生率表示。
图8：血管周围标记在不同的人体组织中的反应性。双重颜色免疫荧光染色表明(A)STRO-1和CD146、(B)STRO-1和α-平滑肌肌动蛋白及(C)3G5和CD146与脾、胰腺(第1组)，脑、肾(第2组)，肝、心脏(第3组)和皮肤(第4组)上存在的血管和结缔组织的反应性，20X。STRO-1和3G5抗体使用山羊抗鼠IgM-德克萨斯红鉴别，而CD146和α-平滑肌肌动蛋白使用山羊抗鼠或IgG-异硫氰酸荧光素鉴别。共定位通过黄色和橘黄色荧光的重叠区域表明(白色箭头所指)。
图9：通过FACS分离脂肪衍生的MPC。代表性流式细胞术术柱状图描述了STRO-1、CD146和3G5如先前所述在胶原酶/分散酶消化后产生的周围脂肪衍生的单细胞悬浮液新鲜制品中的表达(Shiand Gronthos 2003)。抗体使用山羊抗鼠IgM或IgG-藻红蛋白鉴别。然后通过FACS基于其与每个标记的阳性(区域R3)或阴性(区域R2)选择细胞群，然后铺板于常规生长培养基中以评价每个细胞级分中粘着的集落形成细胞的发生率。
图10：克隆发生性脂肪衍生的MPC对于STRO-1/3G5/CD146是阳性的。条线图描述了在基于其与识别STRO-1、CD146和3G5的抗体的反应性进行荧光激活的细胞分选之后，从酶消化的人周围脂肪组织的单细胞悬浮液中回收的克隆发生集落的数目(图9)，然后如先前对于骨髓和牙髓组织所述在标准生长培养基中培养(Shi and Gronthos2003)。数据以从两个独立的实验中平均的铺板于阳性和阴性细胞级分的每105个细胞获得的集落形成单位的数目表示。
图11：脂肪衍生的MPC的免疫表型分析。代表性的流式细胞术柱状图描述了STRO-1和CD146(A)及3G5和CD146在胶原酶/分散酶消化后产生的周围脂肪衍生的单细胞悬浮液的新鲜制品中的共表达。STRO-1和3G5抗体使用山羊抗鼠IgM-藻红蛋白鉴别，而CD146使用山羊抗鼠IgG-异硫氰酸荧光素鉴别。大约60％和50％的CD146阳性细胞分别共表达STRO-1和3G5。这些数据提示10％或更多的CD164阳性细胞共表达STRO-1和3G5。
图12：纯化的脂肪细胞衍生的MPC在体外的发育潜力。将衍生自STRO-1+/CD146+脂肪细胞的初级MPC培养物制品在标准培养条件(A)、成骨诱导培养基(B)、脂肪生成诱导培养基(C)或软骨生成条件(D)中重培养，如先前Gronthos等，2003所述。在多重分化诱导两周后，脂肪细胞衍生的MPC表明形成骨(B；茜素阳性的矿物质沉积物)、脂肪(C；油红O阳性的脂质)和软骨(D；II型胶原蛋白基质)的能力。
图13：通过FACS分离皮肤衍生的MPC。代表性流式细胞术柱状图描述了STRO-1、CD146和3G5在胶原酶/分散酶消化后产生的完整厚度的皮肤衍生的单细胞悬浮液的新鲜制品中的表达。使用山羊抗小鼠IgM或IgG藻红蛋白鉴别抗体。细胞群然后基于其对于每个标记的阳性(区域R3)或阴性(区域R2)而通过FACS选择，然后铺板于常规生长培养基中以评估每个细胞级分中粘着的集落形成细胞的发生率。
图14：克隆发生性皮肤衍生的MPC对STRO-1/3G5/CD146是阳性的。条线图表示在基于其与识别STRO-1、CD146和3G5的抗体的反应性进行荧光激活的细胞分选之后，从酶消化的人皮肤的单细胞悬浮液中回收的粘着集落的数目(图6)，然后如先前对于骨髓和牙髓组织所述在标准生长培养基中培养(Shi and Gronthos 2003)。数据以铺板于阳性和阴性细胞级分中的每105个细胞获得的集落形成单位数目表示，取两个单独的实验的平均值。
图15：A.回体扩增的骨髓MPC的免疫表型表达模式。回体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，然后与鉴别细胞系相关的标记的抗体温育。对于鉴别胞内抗原的那些抗体而言，将细胞制品在针对胞内标记染色之前用冷的70％乙醇固定以渗透过细胞膜。同种型匹配的对照抗体在相同条件下处理。使用COULTER EPICS设备进行流式细胞术。斑点区代表5,000 listmode事件，表明每个谱系细胞标记(粗线)相对于同种型匹配的阴性对照抗体(细线)的荧光强度水平。
B.培养的MPC的基因表达模式。回体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，并制备总细胞RNA。使用RNAzolB提取方法分离总RNA并用作cDNA合成的模板，使用标准方法制备。各种转录物的表达通过PCR扩增评价，使用如先前所述标准方法进行(Gronthos et al.2003)。这项研究中使用的引物示于表2。在扩增之后，每个反应混合物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，并通过溴化乙啶染色观测。每个细胞标记的相对基因表达使用ImageQuant软件，参考管家基因GAPDH的表达而评价。
图16.回体扩增的STRO-1briMPC在体外可发育为细动脉。回体扩增的骨髓STRO-1briMPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，然后铺板于含有200μl matrigel的48孔板中。将STRO-1briMPC以20,000个细胞/孔的密度铺板于补加了10ng/ml生长因子PDGF、EGF、VEGF的无血清培养基(Gronthos et al.2003)中。在37℃于5％CO2中培养24小时后，将孔洗涤并用4％多聚甲醛固定。随后进行免疫组织化学研究，表明绳索样(cord-like)结构表达了用山羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶抗体鉴别的α-平滑肌肌动蛋白。
本发明举例实施方案的详述
本发明涉及间充质前体细胞，特别是在血管化组织的血管周围区室中存在的那些细胞。这种间充质细胞可以通过3G5表面标记的存在而鉴别，并也许另外或单独地由其它早期发育标记如CD146(MUC18)、VCAM-1和STRO-1所鉴别。
前体细胞是主要处于发育的扩增前阶段的早期细胞。这些是以后将分化为充分定型的细胞，然而它们在严格意义上不必须是干细胞，它们必须能分化为所有类型的细胞。部分分化的前体细胞与干细胞相比具有更大增殖潜力。
本发明的前体细胞是略微分化的，其中它们定型为间充质组织而不是例如造血组织。数据显示已经分离的MPC缺少与造血细胞相关的标记如CD34，另外其分化潜力未扩增至造血细胞系。另外，它们非必须具有分化为所有类型间充质细胞的潜力，但是，它们能分化为一、二、三或多种细胞类型。
预期从相关组织中收获的这些前体细胞可用于再生针对其来源的细胞组织。因此，分离自心脏的前体细胞可再导入以产生心脏组织，然而其潜力不限于此，分离自一种类型组织的前体细胞可用于在另外一种类型的组织中再生组织。其中未分化的细胞所处的微环境已知对分化途径施加影响并因此所述再次导入不必是组织特异性的。
现有数据显示出MPC已经收获并再次导入以分别产生骨和骨髓及牙本质和牙髓，另外，在分离的MPC回体扩增之后已经产生了小动脉、索样结构。
预期基于某些细胞类型特有的标记的基因表达可产生广泛的细胞。因此预期在合适的培养条件下，可以从本发明的血管周围MPC产生的细胞类型包括但不限于如下类型：成骨细胞、成牙本质细胞、牙本质产生细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、破骨细胞和造血支持基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、神经胶质细胞、神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。
发现MPC可以分离自血管周围细胞的一个益处是这极大地扩充了从中可以分离或富集MPC的源组织范围，并且MPC的来源不再限于骨髓。在本发明的实施例中从中可以分离这些MPC的组织是人骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤。另外，原位染色和组织学研究已经鉴别MPC存在于脾、胰腺、脑、肾、肝和心脏的血管周围区室中。鉴于MPC存在的这种广泛而多种多样的范围，可以假设MPC也存在于更广泛的组织中，包括脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。
本发明的这些前体细胞与其它已知的MPC的区别之处在于其对于3G5是阳性的或者也许其携带另外的血管周围标记。它们可以通过富集血管周围细胞上存在的早期发育的表面标记而分离，特别是通过存在一或多个CD146(MUC18)、VCAM-1及或者或另外由单克隆抗体STRO-1识别的标记的高水平表达而分离。可以使用3G5进行另外的富集。
与血管周围细胞相关的标记也可以存在于MPC上，例如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。
与MPC相关的其它早期发育标记也可以存在。这些标记可包括但不限于THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD61、整联蛋白β5和6-19、凝血调节蛋白、CD10、CD13、SCF、STRO-1bri、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素(leptin)-R(STRO-2)。一或多个这些标记的阳性表达可用于从源组织中富集MPC的方法中。
本发明的MPC也可以是特征在于在分化的组织中没有标记，富集可基于没有这种标记而进行。
相似地，优选富集的细胞群不是造血源的，并因此优选这些细胞不存在。经特性鉴别不存在的标记包括但不限于CD34、CD45和血型糖蛋白A。为此另外的其它标记可包括CD20和CD19(B淋巴细胞标记)、存在于造血干细胞和成血管细胞上的CD117(c-kit癌蛋白)、CD14(巨噬细胞)、CD3和CD4(T细胞)。
希望可以使用相对静止的、直接富集或分离的血管周围MPC。或者，已经发现可以进行富集细胞群的扩增并具有产生更多数目的细胞的有益作用。然而，直接富集的细胞群的扩增的效应是将发生初始MPC的一些分化。5周以上的扩增时期可导致增加103倍。可以选择其它时期以将细胞群扩增102-105倍。这个潜力可以通过将其在含有指示分化为特殊的组织类型的细胞因子和其它因子例如形成平滑肌α索的PDGF和VEGF的培养基中培养而控制。这些然后可以导入例如损害的组织中以有助于组织修复。或者，可期望在扩增之后基于早期发育标记(可以是STRO-1bri)重新选择细胞，以增加细胞群中MPC的比例。
发现基本纯的MPC群不是形成分化的细胞以形成希望的组织结构所必需的。富集的细胞群可具有在富集的细胞群中占总细胞数高于大约0.001、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5或1％或更高比例的MPC水平。这个富集等级可以通过使用用于选择富集的MPC群的单一标记而实现。特别是在源组织具有固有的高水平血管周围MPC的情况中。发现在某些组织中存在比在骨髓中相对更多的3G5阳性MPC，例如在牙髓中。因此在骨髓中，3G5阳性MPC基于STR1bri集落形成细胞组成大约15％的MPC，而在牙髓中发现其组成65％的MPC，在脂肪和皮肤组织中高于90％。扩增细胞群及随后使用单一标记重新富集产生高水平的MPC，也许水平高于大约0.1、0.5、1、2、5或10％。
同时期望充足的一部分、优选地大部分前体细胞是血管周围MPC，不认为对于血管周围MPC，本发明的特定形式必须是唯一的前体细胞形式。其它形式的前体细胞也可以存在，而没有不适当地妨碍血管周围MPC经历希望的分化的能力。这种其它形式可包括造血前体或非血管周围MPC，也许对于3G5是阴性的。
本发明的某些形式提供了基本上没有内皮细胞的血管周围MPC。文中“基本上没有”可认为是少于大约5、2、1或0.1％的内皮细胞。或者，该术语可以是对富集的细胞群是冯·维勒布兰德(vonWillebrand)因子阴性的一种评价。
应理解携带构成分离基础的细胞表面标记的细胞的识别可以通过许多不同的方法实现，然而所有这些方法均依赖于结合剂与相关标记的结合，随后分开表现为高水平结合或低水平结合或不结合的那些结合剂。最便利的结合剂是抗体或基于抗体的分子，由于后者这些制剂的特异性而优选单克隆抗体或基于单克隆抗体的分子。这两个步骤均可以使用抗体，然而也可以使用其它制剂，因此也可以应用这些标记的配体以富集携带或缺失它们的细胞。
抗体可以附着于固体支持物以可以进行粗分离。分离技术应最大程度保持待收集的级分的存活力。可以应用各种不同效力的技术以获得相对的粗分离物。应用的特殊技术依赖于分离效力、相关的细胞毒性、执行方便性和速度、及精密设备和/或技术人员的需要。分离方法可包括但不限于使用抗体包被的磁珠进行磁性分离、亲和层析及使用附着于固体基质的抗体“淘选(panning)”。精确分离的技术包括但不限于FACS。
在这些方法中，细胞可以是阴性或阳性的。阳性细胞根据细胞表面存在的标记的程度而可以是低(lo)或高(bright)表达细胞，这个术语是关于细胞的颜色分选方法中使用的荧光或其他颜色的强度。文中lo和bri的区别是指对分选的特定细胞群使用的标记而言。
富集血管周围MPC的方法可包括通过富集第一个标记的表达而产生第一个部分富集的细胞群，然后进行从部分富集的细胞群中富集第二个标记的表达的步骤。
优选所述方法包括第一步骤是固相分选步骤，基于一或多个标记的识别进行。本发明例证的实施方案的固相分选步骤利用识别STRO-1高水平表达的MACS。这样与高精确度的分选用作第一步骤相比提供了更大数目的富集细胞群。如果例如FACS首先使用，则由于其与其它细胞的关联而排斥许多前体细胞。然后第二个分选步骤可以使用精确分离方法进行。这个第二个分选步骤可以包括使用两或多个标记。因此在例证的实施方案中，使用双重颜色的FACS识别由STRO-1识别的抗原的高水平表达以及CD146的表达。在第二个步骤中用于分选的窗(windows)可以更有利地调节，因为起始细胞群已经部分富集了。
富集血管周围MPC的方法也可包括在第一次富集步骤之前使用已知技术收获干细胞源。因此组织是经手术切除的。包含源组织的细胞然后分离成所谓的单细胞悬浮液。这种分离可以通过物理或酶消化方式完成。
这种血管周围MPC的优选来源是人，然而，期望本发明也适用于动物，包括农业牲畜如牛、绵羊、猪等，家畜如狗，实验室动物如小鼠、大鼠、仓鼠、及兔，或者可用于运动的动物如马。
本发明另一方面涉及一种在哺乳动物中产生组织的方法，包括如本发明第一方面中所述的富集前体细胞群，并将该富集的细胞群导入哺乳动物中，并使得该富集的细胞群在哺乳动物中产生组织。
本发明的富集的细胞的另一种潜在性应用是作为基因治疗的手段，通过在相关的组织类型中导入外源核酸以表达治疗性物质。
在本发明中，术语分离的细胞是指血管周围MPC，其包含其存在于其中的总细胞群的至少30、40、50、60、70、80或95％。
实施例1：前体细胞的分离和扩增
在许多不同的成人组织包括皮肤、毛囊、骨髓、小肠、脑、胰腺及最近在牙髓中鉴别的干细胞生态位通常是高度血管化的部位(1)。正常静止的干细胞群的维持和调节是由局部微环境根据宿主组织的需要而紧密控制的(2，3)。骨髓和牙髓的支持性结缔组织均含有基质干细胞群，其具有能再生具有明显保真性的其各自的微环境包括骨和牙本质周围的矿化结构的高度增殖潜力(4，5)。在出生后的生物体中，骨髓基质以支持和调节造血作用(6-8)的疏松排列的高度血管化的组织存在。在许多组织丧失或其再生能力降低的时候，成人骨髓保持持续更新造血实质组织的能力并且与相邻骨的表面重塑相关(9，10)。相反，牙齿的内髓腔是由非造血性致密的纤维组织组成的，有微血管网混入其中，由矿化的牙本质包埋(11-13)。在牙齿成熟后，牙髓变为相对静态，仅具有应答如龋齿或机械性损伤所致的牙本质基质损伤的修补能力。
功能性成骨细胞(BMSSC：骨髓基质干细胞)和成牙本质细胞(DPSC：牙髓干细胞)的前体，通过其来源组织鉴别的MPC的两种形式，最初是通过其在体外形成克隆发生细胞群的能力鉴别的，这种能力是不同干细胞群之间的一种共有特征(4，14-18)。回体扩增的BMSSC和DPSC的子代呈现与众多转录调节子、胞外基质蛋白、生长因子/受体、细胞粘着分子及一些但不是全部的成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成骨细胞特有的谱系标记相似的基因表达模式(4，19)。然而，先前的研究已经证明单独的BMSSC集落在其体外增殖速度和体内发育潜力中具有显著差异(5，14，20)。与这些发现相似，我们最近在不同的DPSC集落的生长和发育能力中观测到相似水平的异质性(21)。总之，这些研究推断骨髓和牙髓中基质前体细胞的等级排列，前面的是少量的高度增殖性多能干细胞，其产生定型的双或单潜力的祖细胞群(22)。
尽管我们对培养的BMSSC和DPSC的性质具有广泛的认识，但我们仍不知道其在体外的特性是否是真实的基因表达模式和原位发育潜力的正确表象。另外，还未正式认识到每个组织内的集落形成细胞是否全部衍生自一个多能干细胞库，或者是否其产生自属于截然不同谱系的定型祖细胞。还缺乏关于BMSSC和DPSC在其各自组织中的精确解剖学定位的信息。这主要归结于干细胞稀少及在骨发生和牙齿发生期间特别是对于原始的亚群没有鉴别不同发育阶段的特异性标记。先前已经假设成骨细胞和成牙本质细胞的前体细胞的一个可能的生态位也许分别是骨髓和牙髓的微血管网(23，24)。
材料和方法
组织样品
来自正常成人志愿者的髂嵴衍生的骨髓单核细胞(BMMNC)是在Royal Adealaide Hospital Human Ethics Committee规定的指导方针下获得的。正常人嵌塞的第三磨牙由University of Adelaide Dental ClinicResearch在University of Adelaide Human Ethics Committee许可的指导方针下从年轻人中收集。丢弃的全层皮肤和周围脂肪组织在RoyalAdelaide Hospital Human Ethics Committee指导方针下通过常规整形手术方法得自Skin Cell Engineering Laboratory。牙髓组织如先前所述分离自牙冠和牙根(4)。牙髓、皮肤和脂肪组织的单细胞悬浮液在3mg/ml I型胶原酶(Worthington Biochem，Freehold，NJ)和4mg/ml分散酶(Boehringer Mannheim，GMBH，Germany)的溶液中在37℃通过酶消化1-3小时而制备。单细胞悬浮液通过将细胞经过70μm渗滤器(Falcon，BD Labware，Franklin Lakes，NJ)而获得。骨髓、牙髓、皮肤和脂肪的细胞制品(0.01-1×105/孔)然后如下述用于免疫选择、RNA提取、或者直接在6孔平板(Costar，Cambridge，MA)中培养。
其它人体组织样品(脑、肝、心脏、肾、肺、脾、胸腺、淋巴结、胰腺、皮肤)得自Royal Adelaide Hospital在Royal Adelaide HospitalHuman Ethics Committee许可的指导方针下在常规病理检验期间进行的尸检。将每种组织的大约0.5em2的小样品置于Tissue-Tek IIcryomoulds中(25mm×20mm×5mm，Miles实验室；Naperville，IL)，并用O.C.T.化合物介质(Miles实验室)通过沉浸在通过将玻璃烧杯悬浮在液氮室中预冷的150ml-200ml异戊烷耐热玻璃烧杯(BDHChemicals，Poole，England)中进行包埋。当玻璃杯底是白色时则异戊烷已经冷却。将冷冻的切片立即贮存在-80℃。神经和肌组织的冷冻切片得自南澳大利亚I.M.V.S.的组织病理学系，皮肤切片得自南澳大利亚I.M.V.S.的免疫学系。福尔马林固定的石蜡包埋的人胎儿(52天)肢体的切片由南澳大利亚Adelaide妇儿医院组织病理学系的Dr.T.J.Khong善意提供。
集落效率分析及培养
将单细胞悬浮液以低铺板密度(1,000-10,000个细胞/孔，在6孔平板中一式三份)铺板，以评价不同的免疫选择的细胞级分的集落生成效力。将细胞在补加了20％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100μML-抗坏血酸-2-磷酸盐、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Eagle’s培养基的α-修改培养基中在37℃于5％CO2中培养。将14天的培养物用4％福尔马林固定，然后用0.1％甲苯胺蓝染色。计数等于或超过50个细胞的聚集体为克隆发生集落，等于集落形成单位-成纤维细胞性的(CFU-F)。
磁性激活的细胞分选(MACS)
这个程序是对在别处所述的方法(25)加以修改的程序。简而言之，将大约1×108 BMMNC与STRO-1bri上清(鼠抗人BMSSC，IgM)(29)(1/2)在冰上温育1小时。将细胞用PBS/5％FBS洗涤并在冰上再悬浮于生物素酰化的山羊抗小鼠IgM(μ-链特异性的，Caltag实验室，Burlingame，CA)的1/50稀释液中45分钟。洗涤后，将细胞与链霉抗生物素小珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，F.R.G.)在冰上温育15分钟，然后根据厂商指导在Mini MACS磁性柱(Miltenyi Biotec)上分离。
荧光激活的细胞分选(FACS)
将STRO-1briMACS分离的细胞与链霉抗生物素-FITC缀合物(1/50，CALTAG实验室)在冰上温育20分钟，然后用PBS/5％FBS洗涤。使用FACStarPLUS流式细胞计量仪(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)进行单一颜色的荧光激活的细胞分选(FACS)。双重颜色-FACS分析通过将MACS-分离的STRO-1briBMMNC与饱和水平的(1∶1)CC9抗体上清(小鼠抗人CD146/MUC-18/Mel-CAM，IgG2a，Dr.Stan Gronthos)在冰上温育1小时而完成。在用PBS/5％FBS洗涤后，将细胞与第二种标记山羊抗小鼠IgG2a(γ-链特异性的)藻红蛋白(PE)缀合抗体(1/50，CALTAG实验室)在冰上温育20分钟。使用FACStarPLUS流式细胞计量仪的自动化细胞沉积单位(ACDU)对细胞进行分选。如先前所述进行限制稀释分析：以1，2，34，5，&10个细胞/孔接种，复制24份，在无血清培养基中培养10天(26)。相似地，将新鲜制备的未分级分离的BMMNC与CC9(IgG2a)和3G5(IgM)抗体或同种型匹配的阴性对照抗体在冰上温育1小时。在用PBS/5％FBS洗涤后，将细胞与第二种标记山羊抗小鼠IgG2a(γ-链特异性的)藻红蛋白(PE)和IgM(1/50，CALTAG实验室)缀合的抗体在冰上温育30分钟。将细胞在PBS/％5FBS中洗涤，之后使用FACStarPLUS流式细胞计量仪分析。每个抗体的阳性反应性以高出同种型匹配的对照抗体的荧光水平99％限定。
流式细胞术
回体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，然后与纯STRO-1上清或鉴别不同细胞系相关标记的抗体(10μg/ml)在冰上温育1小时。将细胞在PBS/5％FBS中洗涤，然后与山羊抗鼠IgM-藻红蛋白(1/50，SouthernBiotechnologies)、山羊抗鼠或抗兔IgG-藻红蛋白(Caltag实验室)一起温育。对于鉴别细胞内抗原的那些抗体，将细胞制品渗透过细胞膜之后再针对细胞内标记染色。同种型匹配的对照抗体在相同条件下处理。使用COULTER EPICS设备进行流式细胞术。斑点区代表5,000listmode事件，表明每个谱系细胞标记参考同种型匹配的阴性对照抗体的荧光强度水平。
免疫组织化学
将人体组织切片(μm)在二甲苯中脱蜡，并通过梯度乙醇于PBS中再水化。将冷冻的组织切片(μm)和cytospin制品用冷却的丙酮在-20C固定15分钟，然后在PBS中洗涤。样品随后用含有1.5％过氧化氢的PBS处理30分钟，洗涤，然后用5％未免疫山羊血清在室温封闭1小时。将样品与初级抗体在室温温育1小时。使用的抗体是：小鼠(IgG1&IgG2a)对照抗体(Caltag，Burlingame，CA)、兔(Ig)对照抗体、1A4(抗α-平滑肌肌动蛋白，IgG1)、2F11(抗神经丝，IgG1)、F8/86(鼠抗-冯·维勒布兰德因子，IgG1)(Dako，Carpinteria，CA)、STRO-1、CC9(抗-CD146)、LF-151(兔抗人牙本质涎蛋白，Dr.L.Fisher，NIDCR/NIH，MD)。应用的稀释液是：兔血清(1/500)、单克隆上清(1/2)和纯化的抗体(10μg/ml)。通过将样品与合适的二级抗体生物素酰化的山羊抗小鼠IgM、IgG1、IgG2a或生物素酰化的山羊抗兔抗体在室温温育1小时进行单一染色(Caltag实验室)。然后根据厂商指导加入抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物和底物(Vectastain ABC Kit standard，Vector实验室)。将样品用苏木精复染并安放在水性培养基中。双重荧光标记通过在室温加入二级抗体山羊抗小鼠IgM-德克萨斯红和IgG-FITC(CALTAG实验室)进行45分钟而达到。洗涤后，将样品封固在VECTASHIELD荧光浸片剂中。
免疫磁珠选择
将牙髓组织的单细胞悬浮液与和STRO-1(1/2)、CD146(1/2)或3G5(1/2)反应的抗体在冰上温育1小时。将细胞用PBS/1％BSA洗涤两次，然后与绵羊抗小鼠IgG缀合的或大鼠抗小鼠IgM缀合的磁性Dyna珠在4℃在旋转混合仪上温育40分钟(4个珠/细胞：Dynal，Oslo，Norway)。与珠结合的细胞使用MPC-1磁性粒子集中器(Dynal)根据厂商指导除去。
Matrigel-小动脉分析
回体扩增的骨髓STRO-1bright MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，然后铺板于含有200μl matrigel的48孔平板中。STRO-1bright MPC以20,000个细胞/孔的密度铺板于补加了10ng/ml生长因子PDGF、EGF、VEGF的无血清培养基(Gronthos et al.2003)中。在37℃于5％CO2中培养24后，将孔洗涤，然后用4％多聚甲醛固定。随后对于如上述用山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶抗体/Vectastaining试剂盒鉴别的α-平滑肌肌动蛋白进行免疫组织化学研究。
MPC的在体外成骨、脂肪发生和软骨发生分化
先前显示出将回体扩增的脂肪衍生的MPC的单细胞悬浮液在补加了10％FCS、100μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐、地塞米松10-7M和3mM无机磷酸盐的αMEM中培养，诱导骨髓MPC在体外形成矿化骨基质(Gronthos et al.，2003)。矿物质沉积物通过von Kossa染色阳性而鉴别。如先前所述在存在0.5mM甲基异丁基甲基黄嘌呤、0.5μM氢化考的松和60μM消炎痛(indomethacin)的情况下诱导脂肪形成(Gronthos et al.2003)。油红O染色用于鉴别充满脂质的脂肪细胞。软骨发生分化在用10ng/ml TGF-β处理的聚集培养物中评价(Pittengeret al.，1999)。
体内移植研究
将衍生自STRO-1bri/CD146+BMSSC或CD146+DPSC的大约5.0×106个回体扩增的细胞与40mg羟磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉末(Zimmer Inc，Warsaw，IN)混和，然后皮下移植至10周龄无免疫应答的米色小鼠脊背表面(NIH-bg-nu-xid，Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)，如先前所述进行(4)。根据许可的动物协议说明书进行这些程序(NIDCR#00-113)。
逆转录酶-聚合酶链反应
使用RNA STAT-60(TEL-TEST Inc.Friendswood TX)，从STRO-1BRT/CD146+分选的BMMNC及对照细胞(在存在10-7M地塞米松的情况中生长3周的原始BMSSC培养物)中制备总RNA。cDNA第一链合成使用cDNA第一链合成试剂盒(GIBCO BRL，LifeTechnologies)使用寡-dT引物进行。将cDNA第一链(2μl)加入46μl的1×PCR主要反应混合物(Roche Diagnostics，Gmbh MannheimGermany)和10pMol每种人特异性引物系列：
CBFA1(632bp，及三个较小的可变剪接变体)(27)，
有义5’-CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3’[SEQ ID NO.1]，
反义5’-CATAGCCATCGTAGCCTTGTCCT-3’[SEQ ID NO.2]，
骨钙蛋白(310bp)(4)
有义5’-CATGAGAGCCCTCACA-3’[SEQ ID NO.3]，
反义5’-AGAGCGACACCCTAGAC-3’[SEQ ID NO.4]，
GAPDH(800bp)(4)
有义5’-AGCCGCATCTTCTTTTGCGTC-3’[SEQ ID NO.5]，
反义5’-TCATATTTGGCAGGTTTTTCT-3’[SEQ ID NO.6]。
将反应在PCR Express Hybaid热循环仪(Hybaid，Franklin，MA)中温育，在95℃温育2分钟循环1次，然后在94℃/(30秒)、60℃/(30秒)、72℃/(45秒)循环35次，最后在72℃延伸7分钟。扩增后，每个反应通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，并通过溴化乙啶染色观测。结果
BMSSC和DPSC在体内表达血管相关的抗原STRO-1和CD146。
我们先前已经表明了磁性激活的细胞分选(MACS)在从人骨髓抽吸物中分离和富集所有可检测的克隆发生集落的效力，基于其高度表达抗原STRO-1进行(25，26)。为进一步鉴定BMSSC，我们将STRO-1briMACS分离的细胞与另一种单克隆抗体CC9(28)一起温育，该抗体识别细胞表面抗原CD146，也称作MUC-18、Mel-CAM和Sendo-1，其存在于内皮细胞和平滑肌细胞上。这些研究通过双重颜色FACS分析确定了CC9选择性结合来自全部STRO-1+群的STRO-1明亮的表达级分(STRO-1BRT)(图1A)。使用泊松分布统计学的克隆效力分析，得出BMSSC的发生率显著增加(1个集落/5个铺板的STRO-1BRT/CD146+细胞)，当与未分级分离的骨髓相比时克隆发生集落群的富集达到2×103倍(图1B)。在STRO-1BRT/CD146-细胞级分中无集落形成被检测到(数据未显示出)。
STRO-1BRT/CD146+髓细胞的光散射性质与包含大量STRO-1+群的有核红细胞和B淋巴细胞相比典型地更大并更粒状(29)(图1C-E)。发现STRO-1BRT/CD146+分选的细胞的Cytospin制品对于红细胞(血型糖蛋白-A)和白细胞(CD45)相关标记是阴性的(数据未显示出)。确认BMSSC代表早期成骨前体细胞群是通过对高度纯化的MACS/FACS分离的STRO-1BRT/CD146+细胞进行RT-PCR分析而获得的，其不能分别检测早期和晚期成骨标记CBFA1和骨钙蛋白(图1F)。然而，发现STRO-1BRT/CD146+分选的BMSSC的子代在回体扩增之后表达CBFA1和骨钙蛋白。免疫定位研究表明CD146抗原在人骨髓切片中主要在血管壁上表达(图1G)。在冷冻的人骨髓穿刺切片中，STRO-1和CD146的定位均限于大血管(图1H)。
随后使用免疫选择以确定人DPSC是否也在原位表达STRO-1和CD146。分离DPSC的MACS或FACS分析的使用受到限制，这是由于通过处理后获得的有限数目的牙髓细胞(大约105个细胞/牙髓样品)复合的这些细胞稀少(1个集落形成细胞/2×103铺板的细胞)所致。为了解决这个问题，我们集合了得自每个实验的3-4个不同的第三磨牙的一些牙髓组织，并对牙髓组织的单细胞悬浮液基于其表达STRO-1或CD146抗原而应用免疫磁珠选择。STRO-1+级分代表大约6％的总牙髓细胞群。对比研究表明各个集落的生长速度在存在磁珠的情况下未受干扰(数据未显示出)。集落效力分析表明大部分牙髓衍生的集落形成细胞(82％)出现在较少数的，类似于BMSSC的STRO-1+细胞级分中(图2)。DPSC在STRO-1阳性级分中的平均发生率(329个集落形成细胞/105个铺板的细胞±56 SE，n＝3)比未分级分离的牙髓细胞(55个集落形成细胞/105个铺板的细胞±14 SE，n＝3)高出6倍。使用相似的策略，基于其与抗体CC9的反应性选择人牙髓细胞的不同级分。集落效力分析显示出CD146+群中也存在高比例的(96％)牙髓衍生的克隆发生集落，使用免疫磁性Dynal珠选择进行(图2)。CD146+级分中克隆发生集落的平均发生率(296个集落形成细胞/105个铺板的细胞±37 SE，n＝3)比未分级分离的牙髓细胞(42个集落形成细胞/105个铺板的细胞±9SE，n＝3)高出7倍。
免疫定位研究显示出STRO-1表达在冷冻的人牙髓组织切片中限于血管壁和围绕神经束的神经束膜，但成熟的成牙本质细胞层或纤维组织中不存在(图3A-B)。另外，CD146与STRO-1的共同定位在外层血管壁上检测到，与围绕的纤维组织、成牙本质细胞层及神经的神经束膜无反应性(图3C-D)。重要地，人成牙本质细胞特异性分化标记牙本质涎蛋白(DSP)的表达限于含有成熟成牙本质细胞的牙髓外层(图3E)，在纤维组织、神经束和血管中不存在。
血管周围标记3G5通过BMSSC和DPSC的差异表达
在本研究中，流式细胞术表明细胞表面抗原3G5由造血髓细胞大比例高度表达(54％)(图4A)。这个观测结果排除了3G5是从人骨髓抽吸物中直接分离纯化的BMSSC群的候选标记。另外，基于3G5和STRO-1表达的双重-FACS分析是不可能的，因为这两种抗体均呈现相同的同种型。然而，对于不同的3G5/CD146 FACS分选的亚级分进行的体外集落效力分析表明只有小部分(14％)的骨髓克隆发生集落在低水平表达3G5抗原(图4B)。相反，在免疫磁珠选择之后，在3G5+细胞级分中存在较大比例(63％)的克隆发生DPSC(192个集落形成细胞/105铺板的细胞±18.4 SE n＝3)(图2)。3G5表明在冷冻的人牙髓组织切片中与周细胞的特异性反应性(图3F)。
我们接着使用表达DPSC的新鲜分离的STRO-1BRT/CD146+BMSSC和CD146+分析了cytospin制品上内皮细胞(冯·维勒布兰德因子)和平滑肌细胞/周细胞(α-平滑肌肌动蛋白)的更特异性的标记的表达。发现大部分纯化的BMSSC(67％)对于是α-平滑肌肌动蛋白阳性的(图5A)，但缺乏冯·维勒布兰德因子的表达(图5B)。相似地，还发现大部分分离的DPSC(85％)表达α-平滑肌肌动蛋白，但不表达冯·维勒布兰德因子(图5C、5D)。纯化的STRO-1BRT/CD146+BMSSC和CD146+DPSC群随后在体外扩增，然后移植进无免疫应答的小鼠中，以评价其在体内的发育潜力。培养的BMSSC和DPSC的子代显示独特的能力，能分别再生骨髓和牙/牙髓微环境(图5E、F)，并且看起来与未选择的多集落衍生的BMSSC和DPSC的发育潜力相同(4)。
讨论
本研究提供了两种个体发生和发育潜力截然不同的间充质干细胞群均与其各自组织的微血管系统相关的直接迹象。
我们应用不同的免疫选择方法以论证BMSSC和DPSC主要基于其高度表达抗原STRO-1而可以有效地分别从骨髓抽吸物及酶消化的牙髓组织中回收。这个细胞表面抗原在各种基质细胞的前体上呈递，包括分离自成人和胚胎骨髓的骨髓成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及平滑肌细胞(29，32-34)。先前的研究已经暗示STRO-1是前成骨细胞群的标记，其中其表达在体外细胞增殖和分化为成熟成骨细胞之后逐步丧失(27，35，36)。还发现STRO-1抗原在人骨髓和牙髓血管的细胞外壁上呈递，与先前研究的STRO-1在不同的成人组织如脑、肠、心脏、肾、肝、肺、淋巴结、肌、胸腺中位于大血管而非毛细血管上的结果一致(6)。因此，STRO-1看起来是不同的间充质干细胞群的早期标记，并且暗示了是这些干细胞群原位的一个可能的血管周围生态位。
为了确定BMSSC和DPSC是否与血管直接相关，我们利用另一种抗体(CC9)(28)，其识别免疫球蛋白超家族成员CD146(MUC-18/Mel-CAM)，该成员已知原位在平滑肌、内皮、肌成纤维细胞和神经膜(Schwann)细胞上呈递，以及是一些人体肿瘤的标记(37)。特别地，CD146不由骨髓造血干细胞表达，也不由其祖细胞表达。虽然CD146的精确功能还未知，但已经将其与各种细胞过程包括通过跨膜信号化的细胞粘着、细胞骨架再组织、细胞定形、迁移和增殖联系起来。
为了仔细研究BMSSC群，表达STRO-1BRT的骨髓细胞经使用双重FACS分析基于其表达CD146而与STRO-1+造血细胞(主要为血型糖蛋白-A+有核的红细胞)进一步区分。纯化的STRO-1BRT/CD146+人BMSSC显示大粒细胞特有的光散射性质。我们的研究支持了VanVlasselaer及其同事(1994)(38)的发现，其从经5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的鼠骨髓中分离了部分纯化的BMSSC，并鉴别这个细胞群具有高度垂直和向前的光散射特性。令人感兴趣地，也发现新鲜分离的5-FU抗性鼠BMSSC对于两个血管周围标记Sab-1和Sab-2是阳性的(38)。相反，最近的研究显示出当BMSSC在体外培养时，大多数原始细胞群显示低度垂直和向前的光散射性质(39)，并因此也许不反映BMSSC原位的真实形态学。在本研究中，STRO-1BRT/CD146+分选的分别鉴别早期和晚期成骨细胞群的人BMSSC缺乏CBFA1和骨钙蛋白的表达(40，41)，表明BMSSC在人骨髓抽吸物中呈现前成骨细胞表型。我们发现大多数新鲜分离的STRO-1BRT/CD146+BMSSC表达α-平滑肌肌动蛋白，但不表达内皮细胞特异性标记冯·维勒布兰德因子，这提供了这种原始的前体细胞群显示一种特殊的血管周围特征的直接迹象。
本研究还表明了使用磁珠选择，基于其表达STRO-1或CD146而从人牙髓组织中直接分离和富集DPSC的效力。CD146的免疫定位看起来特异于牙髓内的微血管系统。STRO-1和CD146均共同定位于牙髓组织中大血管的外壁，暗示大部分DPSC自微血管系统中产生。然而，由于STRO-1抗体也与牙髓内神经束膜和末梢神经束反应(未公布观测结果)，因此需要进一步的研究以确定这个抗原在神经细胞发育中的作用。
发现与BMSSC相似的新鲜分离的CD146+DPSC表达α-平滑肌肌动蛋白但不表达冯·维勒布兰德因子。DPSC通过其远离牙本质形成表面的位置及其缺乏人成牙本质细胞特异性牙本质涎蛋白(DSP)的表达也显示出是不成熟的前牙本质发生细胞群，其限于含有分化的成牙本质细胞的牙髓外层。我们先前已经描述了回体扩增的人DPSC当在非诱导条件下培养时，在体外不表达前体分子牙本质涎磷蛋白(DSPP)(4)。相似的研究显示出DSPP mRNA在新鲜分离的成牙本质细胞/牙髓组织中高水平表达，但在衍生自大鼠切牙的牙乳头细胞中检测不到(43，44)。只有当DPSC在体外(45)或通过体内移植以形成整齐的牙本质基质被诱导时，DSPP被表达(4)。
回体扩增的BMSSC和DPSC的体外研究支持了这样的观点，即其子代与具有双极成纤维细胞的星形或扁平形态的培养的血管周围细胞在形态学方面相似，不是多角形内皮细胞样形态。另外，我们先前已经显示出BMSSC-和DPSC-衍生的集落的子代对于CD146和α-平滑肌肌动蛋白均呈现异源染色，但缺乏内皮细胞标记CD34和冯·维勒布兰德因子在体外的表达(4)。
观测到在血管周围生态位中存在的两种不同的间充质干细胞群如BMSSC和DPSC对于在其它成人组织中鉴别干细胞群具有进一步的意义。近来已经在骨骼肌的结缔组织及衍生自人胚胎和成人样品的皮肤中鉴别了人“储备的”多能间充质干细胞(56)。然而，这些干细胞的精确位置、发育潜力和个体发生在很大程度上仍未知。在本研究中，骨髓和牙髓中间充质干细胞生态位的鉴别可帮助阐明在体外选择性保持和扩增原始的多能细胞群的基本条件，以指导其在体内的发育潜力。
实施例2：成人骨髓MPC与基质前体细胞、造血干细胞和成血管细胞由于其高度表达STRO-1抗原并缺乏CD34表达而截然不同
出生后的骨髓看起来是与血细胞形成(造血干细胞)、内皮细胞发育(成血管细胞)及结缔组织/基质分化(基质前体细胞/骨髓基质干细胞/间充质干细胞)相关的固有(residential)干细胞和前体细胞类型的中心。我们近来的研究(Gronthos et al.2003；Shi and Gronthos2003)首次基于其高度表达STRO-1抗原并通过其共表达免疫球蛋白超家族成员VCAM-1(CD106)和MUC-18(CD146)而纯化并鉴定了人多能骨髓间充质前体细胞(MPC)。Simmons和Torok-Storb(1991a和b)的早期研究显示出骨髓衍生的STRO-1+基质前体细胞具有在体外形成粘着集落的能力，其也表达造血干细胞标记CD34(虽然水平较低)。这些研究使用CD34抗体-补体介导的细胞裂解以消除骨髓抽吸物中大部分粘着的集落形成细胞(Simmons和Torok-Storb 1991b)。重要的是注意STRO-1抗体在用人CD34+骨髓细胞免疫小鼠后产生，这也许是由于STRO-1抗原在CD34+/血型糖蛋白-A+有核的红细胞和CD34+/CD20+B-淋巴细胞上中等至低水平表达所致。我们现在使用完善的荧光激活的细胞分选技术提供了直接的迹象，即多能成人骨髓MPC表达高水平的STRO-1，但缺乏表达基质前体细胞、造血干细胞和成血管细胞标记(CD34)、白细胞抗原(CD45)、及有核的红细胞标记(血型糖蛋白-A)(图6A-C)。这些数据表明成人骨髓衍生的MPC是一种新的干细胞群，与更成熟的基质前体细胞、造血干细胞和成血管细胞截然不同(图7)。
除非特别说明，则这个实施例中的材料和方法与实施例1相同。
图6：CD34、CD45和血型糖蛋白-A在STRO-1阳性骨髓单核细胞上的表达。代表性的柱状图描述了对STRO-1阳性骨髓单核细胞进行的典型双重颜色流式细胞术图示，所述STRO-1阳性骨髓单核细胞最初通过磁性激活的分选及用CD34(A)、CD45(B)或血型糖蛋白-A(C)的抗体共同染色而分离。STRO-1抗体使用山羊抗鼠IgM-异硫氰酸荧光素鉴别，而CD34、CD45和血型糖蛋白-A使用山羊抗鼠IgG-藻红蛋白鉴别。含有克隆发生MPC群的高表达STRO-1级分通过基于区域R1和R2的荧光激活的细胞分选而分离。
图7：骨髓MPC是STRO-1阳性、CD34阴性、CD45阴性及血型糖蛋白-A阴性的。该图描述了体外粘着集落形成分析的结果，这个分析是对于通过基于如图6所示的R1和R2区域，其共表达或缺乏CD34、CD45或血型糖蛋白-A抗原而选择的每个不同分选的STRO-1阳性群进行的。这些数据以两个独立实验平均的每个细胞级分的集落形成单位的平均发生率表示。
实施例3：：多能MPC在不同人体组织中的鉴别
尽管MPC在不同组织中的存在和精确定位在很大程度上是未知的，我们近来表明了MPC看起来存在于人骨髓和牙髓组织的血管周围生态位中(Shi and Gronthos 2003)。这些观测基于组合免疫组织化学和免疫选择方法，以基于其间充质干细胞标记STRO-1、平滑肌和周细胞标记CD146、α-平滑肌肌动蛋白和周细胞特异性标记3G5的表达而鉴别和分离不同的MPC群。我们现在已经将这些研究加以扩增表明STRO-1/CD146、STRO-1/α-平滑肌肌动蛋白和3G5/CD146抗原在更广泛的组织包括心脏、肝、肾、皮肤、脾、胰腺、淋巴结中共同定位(图8)。
为证实我们的关于MPC可以衍生自非骨髓组织如牙髓的早期发现，我们使用荧光激活的细胞分选以从成人周围脂肪中分离不同的MPC群。单细胞悬浮液如前述在用胶原酶和分散酶消化脂肪组织后获得(Shi and Gronthos 2003)。脂肪衍生的细胞然后与STRO-1、CD146和3G5的抗体温育。通过FACS基于其与每个标记的阳性(区域R3)或阴性(区域R2)而选择细胞群，然后铺板进常规生长培养基(Shiand Gronthos 2003)中以评价每个细胞级分中粘着的集落形成细胞的发生率(图9)。培养12天后，计数集落(50或更多个细胞的聚集体)并显示为对于每个细胞级分铺板的每105个细胞的集落数。我们的数据表明MPC基于其STRO-1/3G5/CD146抗原的表达可衍生自脂肪组织(图10)。双重颜色流式细胞术证实仅有小部分脂肪衍生的细胞共表达STRO-1/CD146和3G5/CD146(图11)。这些发现与我们先前观测到MPC基于相同系列的血管周围标记可以分离自骨髓和牙髓组织的结果一致(Shi and Gronthos 2003)。另外，我们提供的迹象表明通过CD146选择分离的脂肪衍生的MPC具有分化为不同组织如骨、脂肪和软骨的能力(图12)，如先前所述(Gronthos et al.2003)。
近来对在不相关的组织如皮肤中检测到存在MPC的发现也进行了检验，以进一步巩固我们的假说。单细胞悬浮液如上述对于人脂肪组织所述在用胶原酶和分散酶消化全层人体皮肤之后获得。然后将皮肤衍生的细胞与使用山羊抗鼠IgM或IgG-藻红蛋白鉴别的STRO-1、CD146和3G5的抗体温育。通过FACS基于其对于每个标记的阳性(区域R3)或阴性(区域R2)而选择细胞群，然后铺板于常规生长培养基(Shi and Gronthos 2003)中以评价每个细胞级分中粘着的集落形成细胞的发生率(图13)。培养12天后，计数集落(50或更多个细胞的聚集体)并显示为对于每个细胞级分铺板的每105个细胞的集落数。数据表明MPC基于其STRO-1/3G5/CD146抗原的表达也可以衍生自皮肤(图10)。总之，这些数据提示在基于共有的表型衍生自出生后人体组织的几乎所有血管化的组织中均可以鉴别和分离多能MPC。
除非特别说明，则这个实施例的材料和方法与实施例1相同。
图8：血管周围标记在不同的人组织中的反应性。双重颜色免疫荧光染色表明了(A)STRO-1和CD146、(B)STRO-1和α-平滑肌肌动蛋白、及(C)3G5和CD146对脾、胰腺(第1组)，脑、肾(第2组)，肝、心脏(第3组)及皮肤(第4组)，20X。上存在的血管和结缔组织的反应性。STRO-1和3G5抗体使用山羊抗鼠IgM-德克萨斯红鉴别，而CD146和α-平滑肌肌动蛋白使用山羊抗鼠或IgG-异硫氰酸荧光素鉴别。共定位由黄色和橙色荧光的重叠区域表明(白色箭头所指)。
图9：通过FACS分离脂肪衍生的MPC。代表性流式细胞术柱状图描述了STRO-1、CD146和3G5如先前所述在胶原酶/分散酶消化后产生的周围脂肪衍生的的单细胞悬浮液的新鲜制品中的表达(Shi and Gronthos 2003)。抗体使用山羊抗鼠IgM或IgG-藻红蛋白鉴别。然后通过FACS基于细胞群对于每个标记的阳性(区域R3)或阴性(区域R2)而选择细胞群，然后铺板于常规生长培养基中以评价每个细胞级分中粘着的集落形成细胞的发生率。
图10：克隆发生性脂肪衍生的MPC对于STRO-1/3G5/CD146是阳性的。条线图描述了在基于其与识别STRO-1、CD146和3G5的抗体的反应性进行荧光激活的细胞分选之后，从酶消化的人周围脂肪组织的单细胞悬浮液中回收的克隆发生性集落的数目(图9)，然后在如先前对于骨髓和牙髓组织所述的标准生长培养基中培养(Shiand Gronthos 2003)。数据以两个独立实验平均的铺板于阳性和阴性细胞级分中每105个细胞获得的集落形成单位的数目表示。
图11：脂肪衍生的MPC的免疫表型分析。代表性流式细胞术柱状图描述了STRO-1与CD146(A)及3G5与CD146在胶原酶/分散酶消化后产生的周围脂肪衍生的单细胞悬浮液的新鲜制品中的共表达。STRO-1和3G5抗体使用山羊抗鼠IgM-藻红蛋白鉴别，而CD146使用山羊抗鼠IgG-异硫氰酸荧光素鉴别。大约60％和50％的CD146阳性细胞分别共表达STRO-1和3G5。这些数据提示10％或更多的CD164阳性细胞共表达STRO-1和3G5。
图12：纯化的脂肪细胞衍生的MPC在体外的发育潜力。将衍生自STRO-1+/CD146+脂肪细胞的原始MPC培养制品如先前Gronthoset al.2003所述在标准培养条件下(A)、成骨诱导培养基(B)、脂肪生成诱导培养基(C)或软骨生成条件(D)下再培养。在多重分化诱导两周后，脂肪细胞衍生的MPC显示出形成骨(B，茜素阳性矿物质沉积物)、脂肪(C，油红O阳性脂质)和软骨(D，II型胶原蛋白基质)的能力。
图13：通过FACS分离皮肤衍生的MPC。代表性的流式细胞术柱状图描述了STRO-1、CD146和3G5在胶原酶/分散酶消化后产生的全层皮肤衍生的单细胞悬浮液的新鲜制品中的表达。抗体使用山羊抗鼠IgM或IgG-藻红蛋白鉴别。然后通过FACS基于细胞群对于每个标记的阳性(区域R3)或阴性(区域R2)而选择细胞群，然后铺板于常规生长培养基中以评价每个细胞级分中粘着的集落形成细胞的发生率。
图14：克隆发生的皮肤衍生的MPC对于STRO-1bri/3G5/CD146是阳性的。条线图描述了在基于其与识别STRO-1、CD146和3G5的抗体的反应性进行荧光激活的细胞分选之后，从酶消化的人皮肤的单细胞悬浮液中回收的粘着集落的数目，然后在先前针对骨髓和牙髓组织所述的标准生长培养基中培养(Shi and Gronthos 2003)。数据以两个独立实验平均的铺板于阳性和阴性细胞级分中每105个细胞获得的集落形成单位数表示。
实施例4：回体扩增的人骨髓间充质前体细胞的免疫表型分析
我们先前已经报道了多能间充质前体细胞(MPC)可以基于表型STRO-1bright/VCAM-1(CD106)+或STRO-1bright/MUC-18(CD146)+而纯化自成人骨髓单核细胞(Gronthos et al.2003；Shi and Gronthos 2003)。MPC群在限定的培养条件下可易于在体外增殖(Gronthos et al.2003)。我们现在示出了分别使用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术，在mRNA和蛋白质水平基于与不同的细胞系相关的标记描述回体扩增MPC子代的特征的数据。
在第一系列的实验中，应用半定量RT-PCR分析检验培养的MPC群中存在的各种谱系相关基因的基因表达模式(图15)。使用ImageQuant软件，对每个细胞标记的相关基因表达参考管家基因GAPDH的表达进行评价(图15B)。另外，使用单一颜色流式细胞术，基于细胞系相关标记的表达而检验回体扩增的MPC的蛋白质表达模式(图15A)。基于培养的MPC的基因和蛋白质表达的一般表型概述示于表1。本专利中描述的MPC的基因表达模式的直接对比表明这个细胞群与先前Pittenger等于1999年所述的间充质干细胞(MSC)之间的明显不同(表1)。
除非特别说明，这个实施例的材料和方法均与实施例1的相同。
图15A：回体扩增的骨髓MPC的免疫表型表达模式。回体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，然后与鉴别细胞系相关标记的抗体温育。对于鉴别胞内抗原的那些抗体，将细胞制品用冷的70％乙醇固定以透化细胞膜，之后针对胞内标记染色。同种型匹配的对照抗体在相同条件下处理。使用COULTEREPICS设备进行流式细胞术。斑点印迹代表5,000listmode事件，表明参考同种型匹配的阴性对照抗体(细线)每个谱系细胞标记的荧光强度水平(粗线)。
图15B：培养的MPC的基因表达模式。回体扩增的骨髓MPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，并制备总细胞RNA。使用RNAzolB提取方法分离总RNA，并用作cDNA合成的模板，使用标准方法制备。各种转录物的表达通过PCR扩增评价，使用先前所述的标准方法进行(Gronthos et al.2003)。这项研究中使用的引物系列示于表2。在扩增后，每个反应混合物均通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，并通过溴化乙啶染色观测。使用ImageQuant软件参考管家基因GAPDH的表达评价每个细胞标记的相关基因表达。
图16：回体扩增的STRO-1briMPC可在体外发育为小动脉。回体扩增的骨髓STRO-1bri和STRO-1dullMPC的单细胞悬浮液通过胰蛋白酶/EDTA处理而制备，然后铺板于含有200μl matrigel的48孔平板中。将STRO-1bri(A)和STRO-1dull(B)MPC以20,000个细胞/孔铺板于补加了10ng/ml生长因子PDGF、EGF、VEGF的无血清培养基(Gronthos et al.2003)中。在37℃在5％CO2条件下培养24小时后，洗涤孔，然后用4％多聚甲醛固定。随后进行免疫组织化学研究表明索样结构表达用山羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶抗体鉴别的α-平滑肌肌动蛋白。
表1：培养的人间充质前体细胞(MPC)与培养的人间充质干细胞(MSC)之间在回体扩增之后的对比。发现抗原存在于细胞表面上、胞内或胞外基质中。MPC表达具有不同发育来源的组织的标记，即ECT-外胚层、MES-中胚层和END-内胚层。  抗原  MSC  MPC 分化细胞类型  STRO-1  -ve  +ve  胶原蛋白II  -ve  +ve 软骨细胞(MES)  胶原蛋白IV  -ve  +ve 成纤维细胞(MES)  层粘连蛋白  -ve  +ve 成纤维细胞(MES)  骨涎蛋白(BSP)  -ve  +ve 成骨细胞(MES)  骨钙蛋白(OCN)  -ve  +ve 成骨细胞(MES)  神经上皮干细胞蛋白(nestin)  ND  +ve 神经细胞(ECT)  神经胶质细胞纤维酸性蛋白  (GFAP)  ND  +ve 神经细胞(ECT)  CBFA1  -ve  +ve 成骨细胞(MES)  Osterix(OSX)  ND  +ve 成骨细胞(MES)  骨钙蛋白(OCN)  -ve  +ve 成骨细胞(MES)  Sox9  ND  +ve 软骨细胞(MES)  胶原蛋白X(COLX)  +ve  +ve 软骨细胞(MES)  瘦素  ND  +ve 脂肪细胞(MES)  GATA-4  ND  +ve 心肌细胞(MES)  运铁蛋白(TFN)  ND  +ve 肝细胞(END)  含有单加氧酶的黄素(FCM)  ND  +ve 肝细胞(END)
表2：特异性扩增人mRNA的RT-PCR引物和条件  靶基因  有义/反义(5’-3’)引物序列  产物大小  GAPDH  CACTGACACGTTGGCAGTGG/[SEQ ID NO.7]  CATGGAGAAGGCTGGGGCTC[SEQ ID NO.8]  417  瘦素  ATGCATTGGGAACCCTGTGC/[SEQ ID NO.9]  GCACCCAGGGCTGAGGTCCA[SEQ ID NO.10]  492  CBFA-1  GTGGACGAGGCAAGAGTTTCA/[SEQ ID NO.11]  TGGCAGGTAGGTGTGGTAGTG[SEQ ID NO.12]  632  OCN  ATGAGAGCCCTCACACTCCTC/[SEQ ID NO.13]  CGTAGAAGCGCCGATAGGC[SEQ ID NO.14]  289  GFAP  CTGTTGCCAGAGATGGAGGTT/[SEQ ID NO.15]  TCATCGCTCAGGAGGTCCTT[SEQ ID NO.16]  370  神经上皮  干细胞蛋  白  GGCAGCGTTGGAACAGAGGTTGGA/[SEQ ID NO.17]  CTCTAAACTGGAGTGGTCAGGGCT[SEQ ID NO.18]  460  GAIA-4  GACTTCTCAGAAGGCAGAG/[SEQ ID NO.19]  CTATCCTCCAAGTCCCAGAG[SEQ ID NO.20]  800  PDGFB-R  AATGTCTCCAGCACCTTCGT/[SEQ ID NO.21]  AGCGGATGTGGTAAGGCATA[SEQ ID NO.22]  650  Osterix  GGCACAAAGAAGCCGTACTC/[SEQ ID NO.23]  CACTGGGCAGACAGTCAGAA[SEQ ID NO.24]  247  COL X  AGCCAGGGTTGCCAGGACCA/[SEQ ID NO.25]  TTTTCCCACTCCAGGAGGGC[SEQ ID NO.26]  387  SOX9  CTC TGC CTG TTT GGA CTT TGT/[SEQ ID NO.27]  CCT TTG CTT GCC TTT TAC CTC[SEQ IDNO.28]  598  Ang-1  CCAGTCAGAGGCAGTACATGCTA AGAATTGAGTTA/[SEQ ID  300  NO.29]  GTTTTCCATGGTTTTGTCCCGCAGTA[SEQ ID NO.30]
参考文献
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                                序列表
<110>成血管细胞系统公司
<120>血管周围间充质前体细胞
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