支链多胺甾体衍生物 【发明领域】
本发明涉及具有广谱抗微生物活性的新化合物，即包含支链多胺侧链的甾体，并涉及这些化合物作为抗微生物剂在治疗感染中的用途。
【发明背景】
在抗生素领域中，耐药性是一项日益增加的对公众健康造成严重威胁的问题。多年以来对于传染病可通过目前无数(arsenal)抗菌药控制的一般认识已经导致较少新的且更有效的药物被开发出来。然而，近来病原菌间多种耐药性的广泛出现已经重新激起发现新抗生素的兴趣。尽管多年来已经认识到对许多抗生素如β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类和氨基糖苷类的耐药性以及耐药性的迅速传播，人们仍然认为如糖肽和氟代喹诺酮的储备药足以对抗大部分感染。然而，20世纪80年代末和90年代早期，许多万古霉素耐药性、多药耐药性和耐药性基因在不同种之间转移的警报，已经使耐药性问题得到卫生当局和制药工业的关注。发现新的具有抗微生物活性的化合物仍然是重要的工作。
甾体是一族活生物体内普遍存在的化合物，其最主要的例子是激素。所有甾体共有包括三个六边形环和一个五边形环的共同骨架或核，从而可被称为环戊烷并多氢菲。甾体具有关键的生物学重要性。它们决定性地影响所有主要生物化学化合物如蛋白质、碳水化合物和脂质的分解代谢和合成代谢，它们是通过诱导控制所述生物化学化合物水平的酶的合成达到此目的是。激素可分为雌激素、雄激素、孕激素、盐皮质激素和糖皮质激素。它们调节所有生物活性的重要方面，例如骨骼和肌肉增加和维持，血压、血中葡萄糖水平和性征发育。借助此大量的激素形式或者化学上密切相关的衍生物形式的生物效应，甾体还使它们自己作为适于各种疾病地潜在药物。甾体通常用于甾体生成不足的患者的代替疗法；全身和局部施用的高水平的糖皮质激素用作抗炎和免疫抑制剂；雌激素和孕激素甾体用于治疗生殖系统机能障碍并更频繁地作为避孕药。
有限数量的甾体显示抗生素作用，其中一个例子是梭链孢酸。梭链孢酸是Fusidium coccineum的发酵产品，自20世纪60年代早期已知(US专利3,072,531)。梭链孢酸(例如Fucidin，LEO药品有限公司，丹麦)临床上用于治疗传染病，例如葡萄球菌感染，并且其局部和全身均可施用(Kuchers等，1997及其中引用的参考文献；Duvold等2001及其中引用的参考文献；Christiansen，1999及其中引用的参考文献)。它通常与常规的抗生素如青霉素、红霉素或克林霉素组合施用。
新近，从角鲨鲨鱼白斑角鲨(Squalus acanthias)的胃中分离出甾体抗生素(Moore等，1993；Rao等，2000)。这种化合物基于包含直链多胺和硫酸盐官能团的甾体骨架，被称为角鲨胺(squalamine)并且已经发现具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌、真菌和原生动物的广谱抗生素性质。US5,192,756公开了天然角鲨胺作为抗微生物剂的用途。角鲨胺也已经通过化学合成制备，尽管已经发现这种工艺非常麻烦。WO 00/09137公开了大量角鲨胺模拟化合物和它们作为抗生素的用途。
WO02/14342以及B.Ding等，J.Med.Chem.45，2002，663-669页公开了其它包含多胺支链的角鲨胺模拟化合物。
支链多胺本身发挥抗生素作用尚未见报道。
发明概述
令人惊讶地是，本发明人发现包含与支链多胺偶联的甾体骨架的甾体衍生物构成具有广泛抗微生物、尤其抗菌活性的化合物。支链多胺部分赋予无抗微生物甾体抗微生物活性，且其可改善自身发挥抗微生物活性的甾体的抗微生物活性。
因此，本发明涉及式I化合物，
其中：
稠合环A、B、C和D独立地是饱和的或者全部或部分不饱和的；
C-17和C-20之间的键以实线和点线表示，表明所述键可以是单键或双键；
其中R1是氢、卤素、亲脂基、-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2，其中n是0或1且p是1至5的整数；每个Z独立地表示直链或支链烃二基，任选被C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、羟基、烷氧基、氨基、C1-6氨基烷氧基、C1-6氨基烷基、C1-6氨基烷基氨基羰基、C1-6烷基C3-8环烷基或C1-6烷基杂芳基取代；每个R独立地表示氢或C1-6烷基、C1-6氨基烷基、C1-6氨基烷氧基或C1-6氨基烷基氨基羰基，均任选被烷基或C1-6氨基烷基取代；条件是：至少一个Z被C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、羟基、烷氧基、C1-6氨基烷氧基、C1-6氨基烷基、C1-6氨基烷基氨基羰基、C1-6烷基C3-8环烷基或C1-6烷基杂芳基取代，或者至少一个R不同于氢；
R2表示卤素、C1-4烷基，任选被COOH取代；C1-4烷氧基、-COOH、-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2；
R3表示氢、卤素或O-R19，其中R19表示氢、-SO3、C1-6烷基、C1-6酰基或-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2；
R4、R7、R8、R10、R11、R12、R13、R16和R17各自独立地表示氢、卤素、羟基、-OSO3、-O-酰基、-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2；
R5、R6、R9、R14、R15和R18各自独立地表示氢或甲基，或者当稠环A、B、C、D之一不饱和时各自独立地不存在，以便在该位置满足碳原子的化合价；
条件是：R1、R2、R4、R7、R8、R10、R11、R12、R13、R16和R17中至少一个、至多三个是-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2；
和其药学上可接受的盐或酯。
本化合物的确切作用机理目前尚未可知。在不局限于具体假设的情况下，据信它们可在细胞膜上穿孔，通过形成孔可发生膜溶解。这样，本化合物能够绕过两种主要的一些其它抗生素所经历的耐药性机理，即细胞内酶降解和输出通道(Sadownik等，1995；Savage和Li，2000及其中引用的参考文献)。
另一方面，本发明涉及包含式I化合物以及药学上可接受的赋形剂或稀释剂的药物组合物。
又一方面，本发明涉及式I化合物在制备用于预防或治疗感染的药物中的用途。
再一方面，本发明涉及预防或治疗感染的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的式I化合物。
附图简介
图1表示化合物102对于金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度(MBC)。
图2表示化合物102对于酿脓链球菌的最小杀菌浓度(MBC)。
发明详述
定义
在上下文中，术语“烃”指仅仅包含碳和氢的化合物，且其中碳原子形成直链或支链骨架。
术语“烷基”应表明通过从任一碳原子除去氢原子而自直链或支链烷烃衍生的一价基团。该术语包括伯、仲和叔烷基子类，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基和异己基。
术语“链烯基”指通过从任一碳原子除去氢原子而自直链或支链烯烃衍生的一价基团。该术语包括伯、仲和叔烯基子类，如乙烯基、1-丙烯基、异丙烯基、丁烯基、叔丁烯基、戊烯基和己烯基。
术语“炔基”指通过从任一碳原子除去氢原子而自直链或支链炔烃衍生的一价基团。该术语包括伯、仲和叔炔基子类，如乙炔基、丙炔基、异丙炔基、叔丁炔基、戊炔基和己炔基。
术语“烷氧基”应表示式OR′基团，其中R′是如上所定义的烃基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
术语“烷氧基羰基”应表示式-COOR′基团，其中R′是如上所定义的烃基，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、异丙氧基羰基等。
术语“环烷基”应表示饱和的环烷基团，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。同样，术语“环烯基”应表示环烯基，例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基或环己烯基。
术语“芳基”应包括碳环芳环基团，任选地为稠合双环，例如苯基或萘基。术语“杂芳基”应包括杂环芳环基团，特别是具有1-3个选自O、S和N的杂原子的5-或6-元环，或任选地具有1-4个杂原子的稠合双环，例如吡啶基、四唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻吩基、吡嗪基、异噻唑基、苯并咪唑基和苯并呋喃基。
术语“酰基”指式-CO-R′基团，其中R′是如上指出的烃基。
术语“芳烷基”应表示具有烷基侧链的芳环，例如苄基。
术语“卤素”应表示氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”应表示式-NR″2的基团，其中每个R″独立地表示氢或烃基。
术语“氨基烷氧基”指式-OR′-NR″2基团，其中R′是烃二基，且每个R″独立地表示氢或烃基。
术语“氨基烷基”指式-R′-NR″2基团，其中R′是烃二基，且每个R″独立地表示氢或烃基。
术语“氨基烷基氨基羰基”指式-C(O)-NR″-R′-NR″2基团，其中R′是烃二基，且每个R″独立地表示氢或烃基。
术语“支链多胺”应表示式NHR-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2的化合物，其中n和p和每个R和Z独立地如先前定义，且其中至少R不同于氢，且其中至少一个Z被C1-6烷基、C1-6链烯基、C1-6炔基、羟基、烷氧基、C1-6氨基烷基、C1-6氨基烷氧基、C1-6氨基烷基氨基羰基、C1-6烷基C3-8环烷基或C1-6烷基杂芳基取代。
术语“药学上可接受的盐”应表示碱金属或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐，以及银盐和与碱如氨或适合的无毒胺的盐，例如低级烷基胺如三乙胺，羟基-低级烷基胺如2-羟基乙胺或双-(2-羟乙基)胺，环烷基胺如二环己基胺，或苄胺如N，N′-二苄基乙二胺和二苄基胺，以及适合的有机或无机酸盐，所述酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、乳酸、马来酸、邻苯二甲酸、枸椽酸、丙酸、苯甲酸、戊二酸、葡萄糖酸、甲磺酸、水杨酸、琥珀酸、酒石酸、甲苯磺酸、氨基磺酸或富马酸。
术语“药学上可接受的酯”应表示易水解的酯，如烷酰氧基烷基、芳烷酰氧基烷基、芳酰氧基烷基，例如乙酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、苯甲酰氧基甲基酯和相应的1′-乙氧基衍生物，或烷氧基羰基氧基烷基酯，例如甲氧基羰基氧基甲基酯和乙氧基羰基氧基甲基酯和相应的1′-乙氧基衍生物，或内酯如酞基酯，或二烷基氨基烷基酯，例如二甲基氨基乙基酯。易水解的酯包括式I化合物的体内可水解的酯。这类酯可通过本领域技术人员已知的常规方法制备，如引入本文作为参考的GB专利No.1490852公开的方法。
术语“抗生素”和“抗微生物”可互换使用，且应具有同样含义。
本发明优选的实施方案
在优选的实施方案中，R2、R7、R11和/或R16表示-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2。
R19的具体例子是C1-6烷基和C1-6酰基。
R7、R11和R16的具体例子是-OH。其中R11是O-SO3或O-酰基的式I化合物也是特别优选的。
本发明优选的实施方案涉及通式Ia或Ib的化合物，
其中R1、R2，、R3、R4、R7、R8、R10、R11、R12、R13、R16和R17如先前所定义。
本发明化合物的具体例子是式Ia或Ib的化合物，其中R2是-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2，特别地，其中R7和R11均为羟基；其中R11和R16均为羟基；或者其中R3是-OR19，其中R19是C1-6烷基或C1-6酰基。
本发明化合物的更具体的例子是式Ia或Ib的化合物，其中R11是-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2或C(O)-(Z)n-(NR-Z)p-N(R)2，特别地其中R2是C1-4烷基，任选被COOH取代；C1-4烷氧基或-COOH；或者其中R3是-OR19，其中R19是C1-6烷基或C1-6酰基。
在式I化合物中，且更具体地为Ia或Ib中，R1优选是亲脂基，即主要是非极性基团。据信R1位非极性基团对于本发明化合物固定于实质上也是亲脂性的细胞膜中的能力是重要的。这种亲脂基的例子是C1-10烷基、芳基、C3-8环烷基、在烷基部分具有1-10个碳原子的芳烷基、C1-10烷基芳基、C1-10烷基-C3-8环烷基、C1-10烷氧基和杂芳基。优选地，R1是直链或支链、饱和或不饱和C1-10烃基，例如式II部分，
其中表示为“*”的碳-碳键是单键或双键。
在本发明优选的实施方案中，R2和/或R11表示如下所示的式VIII、IX、X、XI、XII或XIII部分，
在特别优选的实施方案中，式I化合物选自：
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物101)，
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-11-脱氧-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物102)，
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-16-脱乙酰氧基-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物103)，
21-N-{2′-[双(2-氨基乙基)氨基]乙基}-13(17)-烯-17，20，24，25-四氢梭链孢烷(fusidan)-21-甲酰胺(化合物104)，
21-N-{2′-双(2′-氨基乙基)氨基}乙基}-3β-脱乙酰氧基-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物105)，
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-9(11)-烯-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物106)，
24-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-3α-羟基-5β-胆烷-24-酰胺(化合物107)，
22-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-23，24-联降-5-胆烯酸-22-酰胺(化合物108)，
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-梭链孢酸-21-酰胺(化合物109)，
21-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-梭链孢酸-21-酰胺(化合物110)，
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-3-OSO3-11-脱氧-17，20，24，25-四氢-梭链孢酸-21-酰胺(化合物111)，
21-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-11-脱氧-16-脱乙酰氧基-17S，20，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物112)，
21-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物113)，
22-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-23，24-联降-5-胆烯酸-22-酰胺(化合物114)，
21-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-3-OAc-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物115)，
21-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-3-OSO3-11-脱氧-17，20，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物116)，
21-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-11-脱氧-16-脱乙酰氧基-17S，20，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物117)，
3-N-{2′-[双(2′-氨基乙基)氨基]乙基}-梭链孢酸(化合物118)，
21-N-{3′-[(3′-氨基丙基)(甲基)氨基]丙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物119)，
21-N-{3′-[(3′-氨基丙基)(甲基)氨基]丙基}-11-脱氧-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物120)，
21-N-{3′-[(3′-氨基丙基)(甲基)氨基]丙基}-16-脱乙酰氧基-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物121)，
24-N-{3′-[(3′-氨基丙基)(甲基)氨基]丙基}-3α-羟基-5β-胆烷-24-酰胺(化合物122)，
21-N-{3′-[(3′-氨基丙基)(甲基)氨基]丙基}-11-脱氧-16-脱乙酰氧基-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物123)，
3-N-{3′-[双(3′-氨基丙基)氨基]丙基}-梭链孢酸(化合物124)，
3-N-{3′-[(3′-氨基丙基)(甲基)氨基]丙基}-梭链孢酸(化合物125)，
21-N-{3-({4′-[(3′-氨基-丙基)-甲基-氨基]-丁基}-甲基-氨基)-丙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物126)，
21-N-{3′-({3′-[(3′-氨基-丙基)-乙基-氨基]-丙基}-乙基-氨基)-丙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物127)，
21-N-{3′-({4′-[(3′-氨基-丙基)-乙基-氨基]-丁基}-乙基-氨基)-丙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物128)，
21-N-{3-({3′-[(3′-氨基-丙基)-乙基-氨基]-丙基}-乙基-氨基)-丙基}-11-脱氧-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物129)，
21-N-{3′-({4′-[(3′-氨基-丙基)-环丙基甲基-氨基]-丁基}-环丙基甲基-氨基)-丙基}-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物130)，
21-N-{3′-[(3′-氨基-丙基)-(3′-二甲基氨基丙基)-氨基]-丙基}-11-脱氧-17R，20S，24，25-四氢梭链孢酸-21-酰胺(化合物131)，和其药学上可接受的盐和酯。
上述化合物的命名基于支链多胺侧链的IUPAC和梭链孢烷及甾体部分的甾体命名惯例。采用可得自http://www2.acdlabs.com/ilab/的程序辅助命名。
式I包含手性中心以及碳-碳双键，它使得存在立体和几何异构体。本发明应当理解成涉及式I覆盖的纯的形式和混合物形式的所有异构体和互变异构形式。
药物组合物
本发明的组合物包含作为活性组分的至少一种式I化合物(以下称为活性成分)，包括药学上可接受的盐和其酯，以及至少一种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在所述组合物中，活性成分与载体的比例以重量计为0.5％至100％，特别是以重量计约0.1至约50％。这种组合物可制备成不同的药物制剂形式，如颗粒剂、片剂、丸剂、糖衣丸、栓剂、胶囊剂、缓释片剂、混悬剂、注射液，并且可按照可接受的药物配制原则装入瓶、管或类似容器中，例如如“Remington：药学科学与实践”，20th版，Mack出版公司，2000中所公开。药学上可接受的适于口、肠、胃肠外或局部施用的有机或无机、固体或液体载体和/或稀释剂可用于制备含有本化合物的组合物：水、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物和动物油和脂肪、苯甲醇、树胶、聚烷撑二醇、凡士林、可可油、羊毛脂和其它乳化剂，改变渗透压的盐或者确保组合物适当pH值的缓冲剂可用作助剂。
此外，这种组合物可包含其它治疗活性组分，它们在传染病的治疗中可适当地与本发明的化合物一起施用，如其它适合的抗生素，尤其这些可增强活性和/或预防抗性发生的抗生素。这样的抗生素包括青霉素、头孢菌素、四环素、利福霉素、红霉素、林可霉素、克林霉素和氟代喹诺酮。其它可有利地与本发明化合物结合的化合物，尤其是在局部制剂中结合的化合物包括例如皮质类固醇，如氢化可的松或氟羟泼尼松龙。备选地，这样的其它治疗活性组分可与本发明的组合物并行施用(或者同时或者相继)。
对于颗粒剂、片剂、胶囊剂或糖衣丸，本发明的药物组合物适当地含有25％至98％的本发明的活性成分，并且在口服混悬剂中，相应量大约为2％至20％的活性成分。
当活性成分以药学上可接受的无毒酸或碱的盐的形式施用时，优选的盐是例如易于水溶的或在水中微溶的盐，以便获得特定和适当的吸收速率。
如上指出，式I化合物和它们的盐可包含于药物制剂中，包括混悬剂、软膏剂和乳膏剂。用于口服施用的药物制剂还可以是活性成分自身或者水微溶性药学可接受盐的悬液形式，该制剂每ml载体含有20至100mg。局部治疗用药物制剂可以是含有制剂的0.5至50％量的活性组分的软膏剂或乳膏剂。局部制剂是适合的，原因在于本发明化合物对日光的稳定性和相对亲脂性。
可适当选择本发明化合物的剂量，以便可获得所需的活性而不具有严重的副作用。在人全身治疗中，该化合物和它们的盐以含有至少于50mg且不超过1000mg的剂量单位方便地施用(于成人)，优选200至750mg，式I化合物计算。
术语“剂量单位”意指单一的，即单次剂量，该剂量能够施用于患者，且易于处理和包装，保持物理和化学稳定的、含有单独的或者与一种或多种固体或液体药物稀释剂或载体混合的活性组分的单位剂量形式。
剂量单位形式中，这种化合物可以每天以适当的间隔一次或多次施用，然而，这总是取决于患者的情况，并且应按照医师开的处方。
因此，在全身治疗中，日剂量优选是0.5至3g的活性成分。
与局部使用有关的术语“使用单位”意指单一的，即单次剂量，该剂量能够局部施用于患者，每平方厘米感染面积一次应用0.1mg至10mg、优选0.2mg至1mg所讨论的活性成分。
如果注射组合物，可提供密封的含有胃肠外可接受的无菌水或油质注射液或者活性组分分散液的安瓿、小瓶或类似容器作为剂量单位。
胃肠外制剂尤其可用于治疗其中需要对治疗快速响应的病症。在患有传染病的患者的持续治疗中，片剂或胶囊剂是适当形式的药物制剂，尤其是缓释片剂形式，因为当口服给药时可获得持久的作用。
在传染病的治疗中，这种片剂可有利地含有如上述的其它活性组分。
在治疗患有传染病的患者的方法中，式I化合物或其等当量的盐或酯可适宜地以0.03g至0.7g/kg体重、每天1至3次的剂量向患者施用，优选每天0.5g至3g。优选地，活性成分以如上指出的剂量单位形式施用。
可接受治疗或可施用本发明治疗的患者包括动物，包括哺乳动物，特别是人。动物还包括家畜如马、牛、猪、羊、家禽、鱼、猫、狗和动物园动物。
传染病的治疗通常可包括确定所述疾病在治疗实际开始之前是否对治疗耐受或不应。举例来说，可自患者采集含有传染微生物的样本，例如血液或尿，然后培养该样品并接受治疗，以观察所述传染生物是否对这种治疗响应。于是，本发明还提供鉴别具有抗微生物作用的化合物的方法，包括使微生物与式I化合物接触，任选地加有其它治疗活性剂，并确定所述化合物或化合物混合物对所考察微生物是否具有毒性或静效应。
本发明的组合物不限于药物，而且还可用于非治疗范围以控制微生物生长。举例来说，在多物种培养中，在损害其它物种的情况下，抗微生物剂的选择性使它们可用于增加特定微生物(例如非致病微生物)的生长。
在以下制剂和实施例中进一步描述本发明，而不以任何方式旨在限制如权利要求所要求的本发明的范围。
制剂和实施例
制备本发明化合物的方法
甾体起始物质
起始的羧酸取代的甾体类似物可商购或通过文献中描述的方法制备。涉及梭链孢酸的甾体可按照各种文献步骤由天然梭链孢烷如梭链孢酸、烟曲霉酸、viridominic acid和源自头孢菌素P族化合物开始制备(参见例如Godtfredsen和Vangedal，1962；Arigoniet等，1964；Godtfredsen等，1965a和1965b；Godtfredsen等，1966；Diassi等，1966；von Daehne等1979及其中引用的参考文献，其内容在此引入作为参考)，或者对上述梭链孢烷进行本领域技术人员公知的简单的化学修饰制备，包括双键氢化、脱水反应、硫酸盐化和氧化。
羟基硫酸盐化：
所有含有一个或几个游离羟基的本发明化合物均可采用化学计量或过量的三氧化硫-吡啶复合物在一个羟基或者在几个羟基上选择性地硫酸盐化，分别如文献所报道(Kinney等，2000)。硫酸盐化在偶联反应A、B和C之前进行。
羟基酰化
在吡啶中，于室温、无水条件下采用过量乙酸酐进行甾体衍生物的游离羟基酰化。
双键还原
采用披钯碳作为催化剂，且乙酸、MeOH、EtOH或乙酸乙酯作为溶剂，通过催化氢化进行甾体衍生物的双键还原。将反应在室温下摇动6-20小时。
羟基脱水
在0℃无水条件下，在吡啶和二氯甲烷中用过量的亚硫酰氯处理梭链孢酸，以完成梭链孢酸衍生物的11-OH脱水。
16-乙酰氢基消除
梭链孢酸衍生物的16-乙酰氧基可如下除去：在无水条件下使相应的甲基酯在回流的无水甲醇中、在过量的镁屑存在下反应，然后通过在氢氧化钠水溶液中回流1小时除去甲基酯。
羟基氧化
含酮或醛官能团的甾体可通过本领域技术人员公知的各种氧化方法自相应的醇获得。
支链多胺起始物质
支链多胺通常选自商购可得的那些，例如化学品目录数据库(ACD)中发现的那些，但是也可通过文献中已知的方法合成(所选择的参考文献：Goodnow等，1990；Bergeron等，1994；Strmgaard等，1999；Gaell和Blagbrough，2000；Kuksa等，2000和其中引用的参考文献；Karigiannis和Papaioannou，2000和其中引用的参考文献，其内容在此引入作为参考)。
具有经酰胺键连接的支链多胺部分的甾体的合成(方法A，方案1)
本发明的支链多胺部分经酰胺键与甾核连接的化合物可由各种含羧酸的甾体例如由方案1中的四氢梭链孢酸和众多支链多胺化合物制备。通过使羧酸基团与N-羟基琥珀酸亚胺在无水THF中、在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下反应，将甾体衍生物的羧酸基团酯化以生成活性酯。然后通过将过量支链多胺在氩气下溶解于无水氯仿中、随后缓慢加入含有活化酯的氯仿溶液，使琥珀酰亚胺酯与支链多胺反应。反应在室温下进行且在6和24小时之间完成。这段时间之后，可将反应混合物浓缩，不需要额外的水处理步骤，并直接通过反相HPLC纯化，采用三氟乙酸缓冲的乙腈和水的混合物作为洗脱剂，或者通过硅胶柱色谱纯化，采用二氯甲烷、甲醇和氨水作为洗脱剂。这种方法通过方案1中的例子说明，其中甾核由四氢梭链孢酸表示。四氢梭链孢酸首先通过在无水THF中、在二环己基碳二亚胺存在下与N-羟基琥珀酰亚胺反应而转化成相应的N-琥珀酰亚胺酯。然后通过将过量(3当量)N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺在氩气下溶解于无水氯仿中、随后缓慢(历经30分钟)加入含活化酯的氯仿溶液，使所述四氢梭链孢酸酯与N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺反应。减压蒸发溶剂，所得的粗油在硅胶上纯化，采用二氯甲烷、甲醇和25％氨水的混合物作为洗脱剂。在冷冻干燥经纯化的产品后，得到白色粉末，为化合物101。
方法A
四氢梭链孢酸 四氢梭链孢酸琥珀酰亚胺酯 化合物101
方案1
具有经酰胺连接的支链多胺部分的甾体的合成(方法B，方案2)
备选地，本发明的式V化合物可如下制备：使甾体酸酐，例如方案2中的梭链孢酸酐，和过量的支链多胺，例如N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺反应，采用方法A所述的同样反应，采用琥珀酰亚胺酯作为起始物质(方案2)。
梭链孢酸酐 化合物109
方案2
酰胺键还原
方案1或2分别所述的支链多胺和琥珀酰亚胺酯或羧酸酐反应生成的酰胺键(例如式IV和V化合物)可通过使所述酰胺在回流THF中与10倍过量的乙硼烷反应5-10小时而还原成相应的胺。然后将反应混合物用4N盐酸水溶液酸化至pH1并剧烈搅拌2-4小时。随后将反应混合物冻干，将所得白色粉末在硅胶上纯化，采用二氯甲烷、甲醇和25％氨水的混合物作为洗脱剂。将经纯化的产品冻干后得到白色粉末。
方案3.式IV的C-21多胺化梭链孢酸类似物的制备，其中W表示式-(Z)n-(NR-Z)p-NR2基团。
通过酮还原胺化引入支链多胺(方法C，方案4)
其中支链多胺部分与甾核的不同位置连接的本发明化合物可由含酮或醛官能团的甾体类似物制备，其中酮或醛官能团需要以支链多胺取代。适当的甾体可得自商业来源，或者可通过本领域技术人员已知的各种方法合成(例如各种氧化方法、羧酸酯还原等)。借助还原胺化、采用报道的合成角鲨胺制备用方法(Pechulis等，1995；Weis等，1999；Kinney等，2000)，可使羰基官能化的甾体与未保护的多胺结构单元直接反应。随后，备选地，借助文献中所述的制备C-3被亚精胺链取代的角鲨胺等价物的还原胺化法(Hon-Seok Kim等，2000)，可使含氨基的甾体与适当的Boc-保护的含醛官能团的多胺片段反应。最后，Boc-保护基团可用三氟乙酸裂除并如上所述进行纯化。
该方法通过方案4的例子说明，其中梭链孢酸核由3-酮梭链孢酸表示。向3-酮-梭链孢酸(1当量)的甲醇溶液连续加入N，N-双(2-氨基乙基)乙烷-1，2-二胺(3当量)、乙酸和NaBH(OAc)3(3当量)，将得到的反应混合物搅拌6-16小时，在这之后减压蒸发甲醇，得到浅黄色油。在采用二氯甲烷、甲醇和25％氨水混合物作为洗脱剂的硅胶色谱之后，得到纯化合物118。纯化产品冻干后得到纯化合物118的白色粉末，收率70-85％。
方法C
方案4通过采用NaBH(OAc)3作为还原剂(Abdel-Magid，1996)的还原胺化而向含羰基官能团的甾核引入支链多胺片段的典型例子。
本发明化合物的纯化：
本发明所得的化合物可通过硅胶60(E.Merck)、230-400目柱色谱纯化，采用二氯甲烷、甲醇和氨水的混合物作为洗脱剂。备选地，本发明的化合物可通过反相制备高效液相色谱(HPLC)纯化，采用以三氟乙酸或乙酸缓冲的乙腈作为洗脱剂。
按照通用方法A、B和C制备的本发明实例：
抗微生物活性
体外研究已经显示本发明化合物对大量细菌的显著功效，这些细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株(葡萄球菌、链球菌、棒杆菌、分枝杆菌、变形杆菌、丙酸杆菌、假单胞菌、奈瑟氏球菌、大肠杆菌)和真菌菌株(念珠菌和曲霉菌)。生物学试验已经显示本发明化合物与报道的几种天然角鲨胺类似物(WO00/09137)相比具有较高活性。本发明化合物的抗菌活性也可与文献(Moore等，1993；Kikuchi等，1997；Rao等，2000)报道的有关化合物的活性和已知的广谱抗生素如氨苄青霉素(Kikuchi等，1997)匹敌。此外，抗生素后效应的研究针对本发明化合物的强杀菌效果。表1显示本发明化合物对大量细菌和真菌菌株的MIC(最小抑制浓度)值。最小抑制浓度采用琼脂杯试验评估。细菌菌株得自美国典型培养物保藏中心或我们自己临床分离收集。将来自新鲜隔夜培养物的菌落重悬于盐水中至0.5MacFarland，对应于108CFU/ml。将200ml MuellerHinton琼脂(Oxoid)在48℃以106 CFU/ml浓度接种，并且倾入正方形培养皿(245×245mm)。在接种过的板上挖孔，并将200μl待试化合物倾入每个孔中。化合物的稀释系列含0.25至125μg/ml之间的六个稀释度。对于链球菌，将Mueller Hinton琼脂补充以5％羊血。将板适当地培养，并采用电子卡尺测量生长抑制圈直径。利用生长抑制圈直径和样品浓度的log2之间的线性回归曲线评估MIC。微生物学试验设计符合欧洲药典第三版(1997)。抑制圈是所使用化合物浓度的函数。使用已知的抗生素，包括梭链孢酸(FA)、莫匹罗星和利奈唑烷(linezolid)，作为参考化合物。
表1 本发明化合物和它们体外活性MIC(mg/l) 微生物/菌株 101 102 103 104 105 106 107 114 117 112 111 115 116 FA 利奈唑烷 莫匹罗星 金黄色葡萄球菌 CJ247 4 4 1 16 16 4 16 16 1 1 -- -- -- 0.02 1 0.5 4 4 1 16 16 -- 16 16 1 1 16 4 4 0.02 4 1 4 4 1 16 16 4 16 16 1 1 16 4 4 0.02 16 1 4 4 1 16 16 4 16 16 1 1 16 -- 4 16 1 0.5 4 4 1 16 16 4 16 16 1 1 -- -- -- 16 -- -- 4 4 1 16 16 4 16 16 1 1 4 4 4 0.02 0.25 0.04 4 4 1 16 16 4 16 16 -- -- 4 4 16 0.2 1 -- 4 4 1 16 16 4 16 64 0.25 0.25 16 64 4 0.1 -- -- 16 16 4 16 64 4 16 64 -- -- 16 4 16 16 4 1 16 16 16 ＞64 64 16 16 -- -- -- -- -- -- -- -- -- 16 16 4 ＞64 64 16 16 16 -- -- 16 16 64 ＞64 -- -- 64 16 16 ＞64 16 16 16 ＞125 -- -- ＞125 16 125 ＞64 -- -- 4 16 4 16 64 16 4 64 -- -- 64 16 16 ＞64 -- -- 16 4 1 16 16 16 16 ＞125 -- -- 125 16 64 ＞64 -- -- 4 4 ＞125 ＞64 64 63 16 -- -- -- 64 125 64 ＞64 -- -- 金黄色葡萄球菌 CJ200 金黄色葡萄球菌 CJ234R 金黄色葡萄球菌 CJ234F 金黄色葡萄球菌 N6 表皮葡萄球菌 CK5 疮疱丙酸杆菌 FN33 干燥棒杆菌FF 酿脓链球菌 EC88 屎链球菌EI19 大肠杆菌HA165 绿脓杆菌BA17 酿酒酵母ZZ7 白色念珠菌ZA 黑曲霉ZM35
注释： 菌株：
表1列出的所有化合物的非常清 FF＝干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)
楚的抑制区表示具有杀菌作用 EC88＝酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)
CJ234(F)＝金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)(MRSA#，耐Fus.)
FA＝梭链孢酸 CJ(N6)＝金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)(耐Fus.)
CJ247＝金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)
--＝无MIC值 CJ234(R)＝金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)(MRSA#，耐利福平)
CJ1200＝金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)
CK5＝表皮葡萄球菌(Straphylococcus epidermidis)
#MRSA：抗甲氧苯青霉素(meticilline)的金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)
BA17＝绿脓杆菌(Pseudomonas)
HJ＝变形(Proteus)
EI119(P)＝屎链球菌(Streptococcus faecium(耐青霉素))
ZA＝白色念珠菌(Candida albicans)
HA165＝大肠杆菌(E.coli)
ZZ7＝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
FN33＝丙酸杆菌(Propionibacterium)
ZM6＝黄曲霉(Aspergillus flavus)
ZM35＝黑曲霉(Aspergillus niger)
化合物102最小杀菌浓度(MBC)
将106细菌接种于3ml分别含有约2×MIC、1×MIC、0.5×MIC和0×MIC(MIC对应于待试菌株)的化合物102的生长培养基中(金黄色葡萄球菌-LB肉汤，酿脓链球菌-TH肉汤)。使金黄色葡萄球菌菌株有氧生长，使酿脓链球菌在富含二氧化碳的恒温箱中无氧生长。将样品稀释并置于LA-板(金黄色葡萄球菌)或血液-琼脂板(酿脓链球菌)上，然后在37℃培养24小时，然后计数菌落数。
如图1和2所示，化合物102对葡萄球菌和链球菌具有强杀菌效果，在两倍于MIC的浓度下具有强细菌杀伤力。
表1所示数据显示：本发明化合物对试验生物普遍显示广谱活性。此外，它们对抗标准抗生素如梭链孢酸、利福平和青霉素的菌株显示活性。没有交叉耐药性为本发明化合物经不同于已知抗生素的机理发挥其抗微生物活性的推测提供了支持。为了克服日益增加的抗生素耐药性问题，鉴别具有新作用机理的抗生素至关重要。
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