重组人白细胞介素-18的工程菌及其产物的制备方法 本发明涉及一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌及其产物的制备方法。
白细胞介素-18是人的一种细胞因子(Cytokines)，它可以明显促进T细胞大量产生γ-干扰素，γ-干扰素在抗微生物感染时起着关键作用。IL-18还可增加人体中NK细胞的活性，增加它对靶细胞(如肿瘤细胞)的细胞毒性(裂解能力)，在这方面它的作用强于普遍认为有临床应用价值的人白细胞介素-12(IL-12)。此外，IL-18还可以促进GM-CSF和IL-2的产生，增加它们的活性。因此，IL-18对增强人体免疫功能、抗肿瘤功能和增加造血功能上有重要作用。它在临床应用上有潜在的应用前景。
本发明目的是提供一种人白细胞介素-18工程菌及其产物的制备方法，该方法获得的多肽活性高、表达量大。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：制备方法包括以下几个步骤；
①人外周血中白细胞分离；
②白细胞总mRNA的分离；
③人工合成含有限制性内切酶切点地引物，在合成的上游引物中导入EcoRI位点，在合成的下游引物中导入BamHI位点，并将天然IL-18的终止密码子TAG转换成大肠杆菌偏爱的终止密码子TAA，引物的序列为：
PL 5′ CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′
PR 3′ GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′
④RT-PCR 基因扩增：在含有合成引物的存在下，以mRNA为模板，通过RT-PCR基因扩增，获得IL-18基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：
10ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGA M Y F G K L E S K L S V I R
20AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG N L N D Q V L F I D Q G N R
30 40CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT P L F E D M T D S D C R D N
50GCA CCC CGG AGC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC A P R T I F I I S M Y K D S
60 70CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG Q P R G M A V T I S V K C E
80AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT K I S T L S C E N K I I S F
90AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGT K E M N P P D N I K D T K S
100 110GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AAT D I I F F Q R S V P G H D N
120AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTA K M Q F E S S S Y E G Y F L
130 140GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA A C E K E R D L F K L I L K
150AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT K E D E L G D R S I M F T V
158CAA AAC GAA GAC TAA Q N E D *
5IL-18 cDNA克隆和大肠杆菌转化：
经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接，并转化至感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即IL-18工程菌。
⑥将工程菌扩增培养，热激表达，破壁、破包含体、IL-18纯化。
以下结合实施例及附图对本发明作详细说明：
图1、重组质粒pBV220-IL-18构建图谱
图2、获得的IL-18基因序列分析
图3、克隆和转化后的质粒酶切图谱
图4a、IL-18表达量SDS-PAGE图谱
图4b、IL-18表达量SDS-PAGE扫描图谱(破壁后全蛋白)
图4c、IL-18表达量SDS-PAGE扫描图谱(破包含体后)
图5、纯化后IL-18的S DS-PAGE图谱
图6、纯化后IL-18蛋白N末端15个氨基酸序列分析图
实施例1
1.工程菌的获得
①人外周血中白细胞的分离：
取健康人的外周血，以1∶1.5(V/V)的比例加入细胞分离液，在1000rpm下离心15分钟进行梯度分离，收集白细胞部分，每毫升加入0.5μgConA，细胞培养24小时，使T淋巴细胞增殖。
②白细胞总mRNA的分离：
按Pharmacia公司微量mRNA纯化试剂盒所述方法进行(也可以其他公司的试剂盒)：
将含有107个细胞的白细胞悬液放在1.5ml塑料离心管中，1000rpm下离心，弃上清液，管中加入0.4ml提取缓冲液匀浆，再用0.8ml洗脱液稀释，1000xg下离心1分钟，得含有mRNA的上清液。
另取一支1.5ml塑料离心管，加入1ml Oligo(dT)-纤维素，1000xg下离心1分钟，除去贮存液。将含有mRNA的上清液加入到Oligo(dT)-纤维素离心管中，混合3分钟，使mRNA亲和吸附，再在16000xg下离心10秒钟，弃上清液。
在管中加入1ml高盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCL，1mmoI/LEDTA，0.5mol/L NaCl pH 7.4进行洗涤，将Oligo(dT)-纤维素悬浮，离心10秒钟，弃上清液。重复上述步骤4次。
在管中再加入1ml低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA，0.1mol/L NaCl，pH7.4)进行洗涤，重复洗涤3次。洗涤后的Oligo(dT)-纤维素加入0.3ml低盐缓冲液悬浮，放入微型柱中，在柱中的Oligo(dT)-纤维素再用0.5ml低盐缓冲液洗涤三次，离心除去洗涤液。加入0.2ml洗脱缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)离心，洗脱下来的400ml mRNA溶液中加入10μl糖原溶液，40μl乙酸钾溶液，再加入1ml-20℃冷乙醇(95％)，-20℃静量至少30分钟，在4℃离心5分钟得mRNA沉淀，沉淀在-80℃贮存，洗脱液在260nm的最大吸收量0.05，相当于RNA浓度为2μg/ml。
③RT-PCR基因扩增：
以上述mRNA为模板，加入引物，(引物序列为：
PL 5′ CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′
PR 3′ GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′)
进行RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)扩增，在95℃变性35秒后，50℃退火一分钟，再于70℃延伸1分钟，反应进行35次循环，扩增样品在琼脂糖凝胶电泳后回收IL-18 cDNA扩增带。
④IL-18 cDNA克隆和大肠杆菌转化。
经EcoRI+BamHI酶切的pBV220载体(来自中国预防医学科学院)和IL-18cDNA进行连接，连接在0.5ml塑料离心管中进行，管中加入4.5μl重蒸水，1.5μl连接反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/LMgCl2，20mmol/L DTT，1mmol/L ATP和50μg BSA.pH7.8)，2μl载体DNA，6μ 1IL-18 DNA片段和1μl T4 DNA连接酶，样品混匀后，在14-16℃水浴中保温24-72小时。
取5-7μl连接产物(载有IL-18基因的质粒)加到100-200μL的E.coli HB101感受态细胞悬液中，混匀放在冰浴中30分钟，再于42℃热击2分钟，加入1ml LB培养液(不含抗菌素)，37℃保温1小时，涂布于含有LB固体培养基(内含氨苄青霉素)37℃培养过夜，取阳性克隆的大肠杆菌菌落，扩大培养并鉴定表达量。
IL-18产物鉴定
经筛选后的大肠杆菌经三级培养(发酵罐培养)，其配方：
硫酸铵5.0克/升，磷酸氢二钾6.0克/升，
磷酸二氢钾3.0/升，柠檬酸钠0.5克/升，
硫酸镁1.5克/升，三氯化铁0.01克/升，
胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物
2.0-10.0克/升，葡萄糖80.0-100.0克/升，
微量元素(铜、钴、钙、锌、钼、锰)10-5-10-4克分子/升，湿菌体达70-80克/升。
菌体裂解、破包含体，再进行SOS-PAGE测定表明，IL-18蛋白占菌体可溶蛋白的30％以上，占包含体蛋白的60％以上，经Saphadex G-100柱纯化，得含量95％以上的IL-18蛋白，蛋白含有158个氨基酸，分子量为18KD。
图3中，1，质粒PBV220-IL18，2，EcoRI/BamHI双酶切，3，BamHI酶切，4，ECORI酶切，5，标准碱基数。
图4a中，1，未热激全蛋白，2，破壁后全蛋白，3，破包含体后全蛋白，4，标准分子量，
图4b中，IL-18占全蛋白的44.99％，
图4c中，IL-18占蛋白的61.3％，
本发明优点：
①采用含有限制性内切酶切点的引物，准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因，并克隆到热诱导载体上。②使用大肠杆菌偏爱的终止密码子，提高表达效率。③由于采用高扩增培养基，使得经扩大培养后的菌体产量高。④由于表达量高，使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。