硫化天冬氨酸修饰的退黑素衍生物及其应用技术领域
本发明涉及肿瘤药物领域，更具体来说，本发明提供了一种可以降低恶性
肿瘤放化疗副作用的化合物。
背景技术
化学治疗和放射治疗是癌症病人的主要治疗方法，但是这两种治疗措
施在临床上面临着共同的挑战。人们面对的一个很大的难题是这些疗法带
来的毒副作用，这是由于这两种治疗方法对正常组织细胞与癌细胞缺乏有
针对的选择性,而发生相同的杀伤力，甚至对增殖速率快的骨髓细胞、内皮
细胞、上皮细胞、胃肠粘膜细胞的损伤更为明显。因此，在杀伤癌细胞的
同时,正常细胞亦常常广泛地遭受池魚之殃。接受治疗患者常出现口腔溃
疡、食欲不振、腹泻、落发及白血球、血小板下降等不良反应，甚至引发
其他可致命的并发症，比如难以控制的感染、多器官功能衰竭等。并且，
大部分患者往往死于放化疗所致的并发症，而存活者的生存质量亦非常差，
并易患二次肿瘤；不良反应往往也限制了治疗剂量的给予,病人耐受不了一
个完整的治疗周期，极大地影响了疗效。只有极少部份副作用可以靠改变
给药方法予以减轻，如分散及长时间给药，或以局部给药方式，如腹膜內
或动脉给药，可能使高浓度的药物仅局限于病灶之内，以降低全身性的不
良反应，或待药物作用时间过后，即给予某种拮抗药，以部份减轻抗癌药
物对正常细胞的杀伤力。然而，局部给药方式的适应症特少，并且给药时
对病人的创伤很大，在临床上籍此降低毒副作用属无赖之举，收效极微；
所述拮抗药物同样也不具备选择性,在部分减轻药物对正常组织细胞的毒性
作用的同时，也相对地降低药物的抗癌效果。另外的解决途径是迅速治疗
发生的副作用-即对症治疗，如白血球刺激生成素(G-CSF、GM-CSF)或强
效止吐剂(5-HT3拮抗剂)的应用等。但事实证明，此种方式也只能减轻部份
症状，本质上并没有降低伤害的程度，更无预防的功效。
另一个非常棘手的难题则是肿瘤细胞在治疗过程中会逐渐产生耐受
性。众所周知，肿瘤形成后，癌细胞不断滋生、经由淋巴管及血管浸润、
转移，簇群越来越复杂，最后产生有抗药性的细胞群，此时肿瘤即到达无
法根治的地步。故抗癌治疗的毒性及无法有效控制肿瘤浸润和转移、滋生
蔓延以及肿瘤对药物的耐受，是当今肿瘤治疗的绊脚石。
基于上述抗肿瘤药物或放射治疗领域的现状以及目前的瓶颈，近年来
细胞保护剂的临床使用及血管生成抑制剂(anti-angiogenesis)和靶向抗癌药
的开发，貌似在一定程度上缓解了少部分放化疗产生的毒副作用，然而，
通过最近几年的临床肿瘤治疗的资料证实，新一代的抗癌药，比如血管生
成抑制剂以及靶向抗癌药(人源化单克隆体，特异性蛋白酶抑制剂比如吉菲
替尼，厄洛替尼等)仍然有较强烈的副反应。最新的临床研究研究表明，特
别是抗血管生成的药物（人源性抗VEGF的单克隆抗体如贝伐单抗）反而
促进某些肿瘤的血行转移。传统的抗氧化剂，如谷胱苷肽(GSH)，Vit-E,Vit-C,
CoA-Q10,谷氨酰胺，甲硫氨酸，超氧化物歧化酶(SOD)等在临床上并没有
获得确切的疗效，这可能是由于保护强度不够和缺乏选择性所致。已用于
减轻放疗副反应的药物，如氨磷汀(amifostine)，右雷佐生(Dexrazoxane)，
这些保护剂都存在以下局限性：1)本身有很强的副作用：氨磷汀的治疗剂
量和中毒剂量非常接近，用药后易导致低血压,头昏眼花或昏暈，这些副反
应发生率竟高达80%；右雷佐生本身导致白细胞减少症(白细胞减少症的发
生率高达78%)。2)适应症非常狭窄：氨磷汀主要仅适用于缓解头颈癌症病
人辐射治疗过程中的口腔干燥症状；右雷佐生是目前临床上认可的用于预
防蒽环类抗癌药诱发心脏毒性的药物。3)给药不方便，静脉给药才有效，
并且费用高昂。因此，氨磷汀和右雷佐生之类的保护剂的市场前景实际上
并不乐观。
因此，研发具有选择性的广谱细胞保护剂是解决放化疗引起毒副作用
的有效途径。褪黑素本是一改善睡眠的保健品，但新近的研究发现褪黑素
有较强的抗氧化损伤的功能，有很好的口服生物利用度，并能迅速地分布
在全身所有组织器官，应该是一个颇具潜力的减轻氧化损伤的化合物。人
们一直试图使用此类化合物减轻放化疗产生的毒副作用，在体外细胞株和
动物体内的实验结果中显示卓有成效。然而，时致今日，仍然未能成功地
用于临床，其原因是：1)干扰放化疗对肿瘤的治疗效果，不能选择性地仅
保护正常组织；2)保护的强度不够，不能减轻高剂量的射线和大剂量化疗
药所致的氧化损伤；3)机体易对褪黑素类化合物产生耐受性，保护效应持
续不到一个完整的放化疗周期；4)本身有一定的副作用，大剂量的褪黑素
主要表现为睡眠障碍和精神抑郁等；5)保护面不够宽广，对某些特定的放
化疗损伤不具有保护作用。目前尚没有人开发出具有令人满意功效的此类
药物。
针对以上问题，鉴于褪黑素具有许多优秀的成药的特性，发明人将其
作为很有开发前景的先导化合物（前药）进行优化，我们进行了大量的实
验对其进行结构改造，通过用化学加成的手段对褪黑素进行修饰，最终成
功地合成出了一种具有极佳效果的褪黑素衍生物，在保持原有抗氧化损伤
的能力外，增加了直接抗凋亡的功能。其抗凋亡能力和范围获得极大的提
升，中枢性的药理作用则得以降低，对动物的毒性降低，保护效应显著增
强，能对抗多种刺激导致的细胞损伤，当与吲哚美辛联合应用时，极大地，
选择性地增强了肿瘤组织对放化疗的敏感性，显著提高了治疗指数，并且
口服给药有效。发明人用新合成的褪黑素衍生物对晚期乳腺癌小鼠进行实
验性治疗，结果表明晚期乳腺癌小鼠的寿命平均延长2.75倍。
发明内容
在本发明的第一个方面，提供了一种以下式1所示的化合物，及其药学上
可接受的盐：
式1
在以上结构式1中，基团R1选自H、C1-C4烷基、C2-C4烯基，优选选自
H和甲基；基团R2选自氢或卤素，所述卤素优选是氯；基团R3选自C1-C4烷
基、C2-C4烯基或优选选自甲基或在本发明的另一个
实施方式中，所述盐是与选自以下金属的阳离子形成的盐：钠、锂、钾、钙、
镁、锶、铝、镁、锰、铁、镍、铜。优选所述化合物选自以下式2-5中任一个
所示的化合物：
式2，
式3，
式4；
式5。
在一个优选实施方式中，优选所述盐是与镁离子或锌离子形成的以下结构
式所示的金属盐：
本发明的第二个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含以上所
述的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料；所述
药物组合物优选还包含吲哚美辛。
本发明的第三个方面提供了一种如以下式1所示的化合物及其药学上可
接受的盐用于制备降低恶性肿瘤放化疗毒副反应的药物的应用：
式1
在以上结构式1中，基团R1选自H、C1-C4烷基、C2-C4烯基，优选选自
H和甲基；基团R2选自氢或卤素，所述卤素优选是氯；基团R3选自C1-C4烷
基、C2-C4烯基或优选选自甲基或在本发明的另一个
实施方式中，所述盐是与选自以下金属的阳离子形成的盐：钠、锂、钾、钙、
镁、锶、铝、镁、锰、铁、镍、铜。优选所述化合物选自以下式2-5中任一个
所示的化合物：
式2，
式3，
式4，
式5。
在一个优选实施方式中，所述盐是与镁离子或锌离子形成的以下结构式所
示的金属盐：
在本发明的另一个实施方式中，所述降低恶性肿瘤放化疗毒副反应的药物
优选还包含吲哚美辛。
附图说明
以下的具体描述与附图相结合用来更详细地解释本发明的技术方案，附图
说明如下：
图1显示本发明的化合物作为保护剂对γ射线致人外周白细胞损伤的保护
作用；
图2显示本发明的化合物作为保护剂对不同种类的凋亡诱导剂致人外周
白细胞损伤的保护作用；
图3显示本发明的化合物作为保护剂对γ射线致小鼠生存率的影响；
图4显示本发明的化合物作为保护剂对γ射线致人外周白细胞损伤的保护
作用；
图5显示本发明的化合物作为保护剂对紫杉醇致人外周白细胞损伤的保
护作用；
图6显示本发明的化合物作为保护剂对顺铂致人外周白细胞损伤的保护
作用；
图7显示本发明的化合物作为保护剂对γ射线致小鼠骨髓损伤的保护作
用；
图8显示本发明的化合物作为保护剂对环磷酰胺致小鼠骨髓损伤的保护
作用；
图9显示本发明的化合物作为保护剂对卡铂致小鼠血小板损伤的保护作
用；
图10A和图10B分别显示本发明的化合物作为保护剂对阿霉素致小鼠心
脏损伤的保护作用；
图11A显示本发明的化合物与吲哚美辛联用对γ射线致裸鼠移植性肿瘤
体内抑瘤效果；
图11B显示本发明的化合物与吲哚美辛联用对γ射线致裸鼠移植性肿瘤裸
鼠体内白细胞的影响；
图12A显示本发明的化合物与吲哚美辛联用对联合化疗致裸鼠移植性肿
瘤体内抑瘤效果；
图12B显示本发明的化合物与吲哚美辛联用对联合化疗对裸鼠移植性肿
瘤白细胞的影响；
图13显示本发明的化合物与硫化天冬氨酸、褪黑素以及硫化天冬氨酸和
褪黑素混合物的抗凋零实验结果。
具体实施方式
在以下内容中将会对本发明进行进一步的详细描述。但是需要指出的是，
以下的具体实施方式仅仅以示例性的方式给出本发明的具体操作实例，但是本
发明的保护范围不仅限于此。本发明的保护范围仅仅由权利要求书所限定。本
领域技术人员能够显而易见地想到，可以在本发明权利要求书限定的保护范围
之内对本发明所述的实施方式进行各种其它的改良和替换，并且仍然能够实现
相同的技术效果，达到本发明的最终技术目的。
在本发明中，除非有相反的说明，所有的比例均为重量比，所有的百分数
均为重量百分数，温度的单位为℃，压力的单位为帕。室温指实验室内常规的
环境温度，随季节和位置变化，通常为25°C。另外，本发明描述的所有数值范
围均包括端值并且可以包括将公开的范围的上限和下限互相任意组合得到的
新的数值范围。例如，如果公开了某种组分的重量百分含量为10~30重量％，
优选15~25重量％，更优选20~23重量％，则相当于同时公开了以下的数值范
围：10~15重量％、10~25重量％、10~20重量％、10~23重量％、15~30重量
％、15~20重量％、15~23重量％、20~25重量％、23~25重量％。
本发明人进行了广泛而深入的研究，开发出了以下式1所示的用硫化天冬
氨酸修饰的褪黑素衍生物：
式1
基团R1选自H、C1-C4烷基、C2-C4烯基，优选选自H和甲基；基团R2
选自氢或卤素，所述卤素优选是氯；基团R3选自C1-C4烷基、C2-C4烯基或
优选选自甲基或在本发明的一个优选实施方式中，本
发明的化合物选自下式2-5所示的化合物：
式2，式3，
式4，
式5。
由于式1-5所示的化合物包括羧基，因此可以与金属阳离子形成药学上可
接受的盐。本领域技术人员可以根据具体的给药要求而选择合适的金属阳离
子。所述药学上可接受的盐优选是下式所示的锌盐或镁盐：
可以在癌症放化疗过程中将本发明的化合物给予患者，从而对正常组织和
细胞加以选择性的保护，减轻放化疗带来的副作用，同时抑制肿瘤组织耐受性
的形成。一般来说，本发明的化合物可以用于任意种类的癌症患者，所述癌症
的例子包括：肝癌、胃癌、食道癌、肠癌、鼻咽癌、乳腺癌、淋巴癌、肾癌、
胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、骨癌、胆囊癌、唇癌、黑素瘤、舌癌、喉
癌、白血病、前列腺癌、脑瘤、血管瘤等，但是并不局限于此。实际上，任何
接受放化疗的患者均可通过摄取本发明的化合物而获得减轻放化疗副作用的
效果。
本发明的化合物可以制成任意剂型，以适当的给药方式给予正在进行放化
疗治疗的对象。例如，可以将本发明的化合物作成溶液、混悬液、乳液、片剂、
丸剂、植入物等剂型，在放化疗操作之前、过程中或之后，通过口服、静脉注
射、经皮吸收、粘膜吸收、体内植入等方式，将本发明的化合物给予患者。本
领域技术人员可以根据患者的病征种类、身体健康情况、具体放化疗方案等因
素，适当地选择本发明保护剂的用量。每日的剂量可以一次性给予，也可以分
为多次给予。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的保护剂通过口服方
式给药。例如，在本发明的一个具体实施方式中，本发明的硫化天冬氨酸修
饰的褪黑素锌盐与吲哚美辛联用，每日两次口服给药，二者的有效剂量分
别为5-12毫克/千克体重/次和0.5-1毫克/千克体重/次。
在本发明的一个优选实施方式中，本发明人还发现，当本发明的化合物与
吲哚美辛联用的时候，其对正常组织的选择性保护效果和抑制肿瘤细胞耐受性
的效果都能获得进一步提高。
下面将结合实施例具体描述本发明的技术方案。
实施例
以下合成实施例所使用的化学试剂均为购自希格玛-艾尔德里奇
(Sigma-Aldrich)公司的分析级试剂。所使用的水为去离子双蒸馏水。反应在常
温常压条件下进行。
实施例1：在此实施例中分别合成式2-5所示的化合物及其金属盐。
a.式2的硫化天冬氨酸修饰的褪黑素镁盐/锌盐的合成
在此实施例中，按照以下所示的历程合成式2的化合物：
步骤1.硫化天冬氨酸的合成：(1)在0-4°C将60%的NaH(1.8mmol)悬浮
于THF(5ml)中，加入1当量的甲基亚硫磷酸(CH3-SO2-H2PO3)，将1当量的羧
基(用t-Bu(叔丁基)保护)和胺基(用Fmoc(芴甲氧羰酰基)保护)保护的天冬氨醛
(商业产品，购于希格玛-艾尔德里奇公司，化合物1a)加入其中，室温搅拌30
分钟，然后加入1当量的乙醛(aldehyde)，继续室温搅拌120分钟，生成带有保
护剂的硫化天冬氨酸(化合物1b)；(2)加入1当量的三氟乙酸(TAF)0-4°C反应
60分钟以去除羧基保护剂(t-Bu)，得化合物1c；(3)加入1当量的哌啶和1当量
的二氯甲烷(CH2Cl2)，室温反应60分钟，去除氨基的保护剂(Fmoc)，得化合
物1d；(4)通过真空抽干去除溶剂得黄色固体，即为目标产物/硫化天冬氨酸，
将该产物溶于二氯甲烷(CH2Cl2)中，用HPLC纯化有机相，得到纯度98%的最
终产物，计算得率为82%。用双聚焦核磁质谱仪(瑟摩费干公司(Thermo
Finnegan)，美国)分析表明目标产物的分子式为C6H11NSO4，目标产物的分子
量为193.036，与硫化天冬氨酸预期的分子量(193.018)相吻合。对反应终产物
用傅立叶变换红外光谱仪(美国珀金-埃尔莫(PerkinElmer)公司生产)进行光谱分
析，硫化天冬氨酸在3500-3300cm-1区域呈现伸缩振动吸收峰(代表-NH2基
团)，这表明成功去除氨基保护剂(Pmoc)，恢复了-NH2基团；硫化天冬氨酸在
3650-3600cm-1区域出现尖锐的伸缩振动吸收峰(代表-OH基团)，说明成功去
除羧基保护剂(t-Bu)；与天冬氨酸相比较，硫化天冬氨酸在1400-1300cm-1区
域出现特征性的强而尖锐的伸缩振动吸收峰(代表-C-SO2基团)，说明硫原子已
成功加成到天冬氨酸的分子中。
步骤2.硫化天冬氨酸褪黑素的制备：将2.5ml 500mM的硫化天冬氨酸原
液(化合物1d)(溶于二氯甲烷)与2.5ml等当量的褪黑素(化合物2a)(溶于乙醇)
在5ml1Mol/L的乙酸水溶液中(pH=3-5),在室温下进行3小时的反应，在此缩
合反应过程中，使得褪黑素的酮基与硫化天冬氨酸的胺基脱水缩合形成C=N
键，然后加入200ml冰水，生成的缩合物是不溶于水的棕黄色晶型固体(化合
物2b)，通过过滤固体沉淀将其从反应体系分离，在pH值为3-5的乙酸水溶液
(250mMol/L)中进行重结晶提纯，然后用HPLC纯化，得到纯度为99%的固体
产物，计算得率为75%。对反应终产物用Nicolet6700-傅立叶变换热红外光谱
仪(美国瑟摩-费舍尔科学(Thermo Fisher Scientific)公司生产)进行光谱分析，褪
黑素在1680-1850cm-1区域高强度的伸缩振动吸收峰(代表C=O基团)发生位
移，硫化天冬氨酸在3500-3100cm-1区域中强度的伸缩振动吸收峰(代表NH2
基团)消失，在1620-1580cm-1区域出现一特异中弱强度的伸缩振动吸收峰，
表明分子中存在C＝N键，证明硫化天冬氨酸的-NH2与褪黑素的-C=O发生脱水
缩合形成C=N键。采用双聚焦核磁质谱仪(瑟摩费干公司，美国)分析表明目标
产物的分子式为C19H25N3SO5，目标产物的分子量为407.36，与预期偶联物的
分子量(407.28)吻合。1H-NMR(Varian Mercury Plus 400Mhz核磁共振仪，美
国瓦力安(Varian)公司生产)测定结果如下:1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.17(s,
1H),7.43(s,3H)7.81(s,2H),7.73(s,1H),1.8(s,3H,C-CH3),3.6(s,3H,O-CH3),7.66
(s,2H),6.09(d,2H,J1/416.0Hz,CH=CHSO2CH3),11.37(d,1H,COOH)。结果证明，
制得的产物为以上式2所示的化合物，在合成历程中记作2b。
步骤3.硫化天冬氨酸褪黑素锌/镁盐的制备：将步骤2的产物溶于50ml
无水乙醇制得400mM的硫化天冬氨酸褪黑素乙醇溶液，另外将碳酸锌/镁溶于
50ml水中制备50ml 200mM的碳酸锌/镁溶液(也可以使用氢氧化镁和氢氧化
锌作为原料)。先将100ml硫化天冬氨酸褪黑素溶液加入500ml的三角烧瓶中,
在电磁搅拌下,将100ml碳酸锌/镁缓慢加入。在50℃反应2小时。持续加热
(50℃)使乙醇挥发，然后加入300ml冰水，在4℃静置1小时，得到棕黄色固
体物硫化天冬氨酸褪黑素锌/镁盐(反应历程中记作化合物3b)，用冰水淋洗三次
以去除无机盐等杂质，用HPLC测得产物纯度为99%，计算得率为85%。用红
外光谱仪(Nicolet6700-傅立叶变换热红外光谱仪,美国瑟摩-费舍尔科学
(Thermo Fisher Scientific)公司生产)比较硫化天冬氨酸褪黑素和硫化天冬氨酸
褪黑素镁/锌的红外光谱，硫化天冬氨酸褪黑素在3650cm-1处有一特异尖锐的
羧基阴离子吸收峰，硫化天冬氨酸褪黑素锌/镁该处特异的羧基阴离子吸收峰移
位至3750cm-1，并且吸收峰变得宽而平，表明硫化天冬氨酸褪黑素中的羧基阴
离子与金属阳离子结合。原子吸收分光光度计(S4AA System美国瑟摩-费舍尔
科学(Thermo Fisher Scientific)公司生产)分析锌/镁离子，表明一个锌/镁离子结
合两个分子的硫化天冬氨酸褪黑素。
b.式3所示的化合物及其镁/锌盐的合成。
重复以上a所述的步骤，但是使用2a’代替其中的原料2a，合成得到最终
产物。对反应终产物用Nicolet6700-傅立叶变换热红外光谱仪(美国瑟摩-费舍尔
科学(Thermo Fisher Scientific)公司生产)进行光谱分析，2a’在1680-1850cm-1
区域高强度的伸缩振动吸收峰(代表C=O基团)发生位移，硫化天冬氨酸在
3500-3100cm-1区域中强度的伸缩振动吸收峰(代表NH2基团)消失，在
1620-1580cm-1区域出现一特异中弱强度的伸缩振动吸收峰，表明分子中存在
C=N键，证明硫化天冬氨酸的-NH2与褪黑素的-C=O发生脱水缩合形成C＝N
键。采用双聚焦核磁质谱仪(瑟摩费干公司(Thermo Finnegan)，美国)分析表明
目标产物的分子式为C18H23N3SO5，目标产物的分子量为393.262，与预期偶联
物的分子量(393.286)吻合。由此证明制备得到了式3所示的化合物。用红外光
谱仪对得到的镁/锌盐进行分析，比较式3化合物及其盐的红外光谱，式3的化
合物在3650cm-1处有一特异尖锐的羧基阴离子吸收峰，其盐该处特异的羧基阴
离子吸收峰移位至3750cm-1，并且吸收峰变得宽而平，式3的化合物中的羧基
阴离子与金属阳离子结合。原子吸收分光光度计分析锌/镁离子，表明一个锌/
镁离子结合两个分子的式3的化合物。
c.式4所示的化合物及其镁/锌盐的合成。
重复以上a所述的步骤，但是使用2a”代替其中的原料2a，合成得到最终
产物。对反应终产物用Nicolet6700-傅立叶变换热红外光谱仪(美国瑟摩-费舍尔
科学(Thermo Fisher Scientific)公司生产)进行光谱分析，2a”在1680-1850cm-1
区域高强度的伸缩振动吸收峰(代表C=O基团)发生位移，硫化天冬氨酸在
3500-3100cm-1区域中强度的伸缩振动吸收峰(代表NH2基团)消失，在
1620-1580cm-1区域出现一特异中弱强度(稀疏)的伸缩振动吸收峰，表明分子
中存在C＝N键，证明硫化天冬氨酸的-NH2与2a”的-C=O发生脱水缩合形成
C=N键。采用双聚焦核磁质谱仪(瑟摩费干公司(Thermo Finnegan)，美国)分
析表明目标产物的分子式为C19H24ClN3SO5，目标产物的分子量为441.756与预
期偶联物的分子量(441.531)吻合.用红外光谱仪对式4的化合物的盐进行分
析，比较式4的化合物与其镁/锌盐的红外光谱，式4的化合物在3650cm-1处
有一特异尖锐的羧基阴离子吸收峰，而其锌/镁盐该处特异的羧基阴离子吸收峰
移位至3750cm-1，并且吸收峰变得宽而平，表明式4的化合物中的羧基阴离子
与金属阳离子结合。原子吸收分光光度计分析锌/镁离子，表明一个锌/镁离子
结合两个分子的式4的化合物。)
d.式5所示的化合物及其镁/锌盐的合成。
重复以上a所述的步骤，但是使用2a”’代替其中的原料2a，合成得到最
终产物。对反应终产物用Nicolet6700-傅立叶变换热红外光谱仪(美国瑟摩-费舍
尔科学(Thermo Fisher Scientific)公司生产)进行光谱分析，2a”’在1680-1850
cm-1区域高强度的伸缩振动吸收峰(代表C=O基团)发生位移，硫化天冬氨酸
在3500-3100cm-1区域中强度的伸缩振动吸收峰(代表NH2基团)消失，在
1620-1580cm-1区域出现一特异中弱强度(稀疏)的伸缩振动吸收峰，表明分子
中存在C＝N键，证明硫化天冬氨酸的-NH2与2a”’的-C=O发生脱水缩合形成
C=N键。采用双聚焦核磁质谱仪(瑟摩费干公司(Thermo Finnegan)，美国)分
析表明目标产物的分子式为C22H28N4SO6，目标产物的分子量为476.522与预
期偶联物的分子量(476.493)吻合.用红外光谱仪对式5的化合物的盐进行分
析，比较式5的化合物与其镁/锌盐的红外光谱，式5的化合物在3650cm-1处
有一特异尖锐的羧基阴离子吸收峰，而其锌/镁盐该处特异的羧基阴离子吸收峰
移位至3750cm-1，并且吸收峰变得宽而平，表明式5的化合物中的羧基阴离子
与金属阳离子结合。原子吸收分光光度计分析锌/镁离子，表明一个锌/镁离子
结合两个分子的式5的化合物。)
在以下实施例中使用制备实施例1a-1d制备的化合物作为保护剂进行生物
实验。另外还使用本领域已知的保护剂(氨磷丁)进行了对比实验。以下实施例
使用的氨磷丁、紫杉醇、顺铂、卡铂、阿霉素、吲哚美辛、环磷酰胺、5-氟尿
嘧啶，肿瘤坏死因子(TNF)，Fas配体(Fas Ligand)，重组人白细胞介素-2，以及
所有的相关试剂均购自希格玛-艾尔德里奇(Sigma-Aldrich)公司和EMD化学
有限公司(EMD Chemicals Inc)，钴60放射治疗机为Theratron，购自加拿大的
原子能(Atomic Energy Agency)公司，G50型生物γ辐照器购自美国的霍普威尔
(HOPEWELL)公司。
在以下的实施例和附图1-13中，用“修饰的褪黑素”或“硫化天冬氨酸
修饰的褪黑素”表示本发明式2-5的化合物；用“修饰的褪黑素锌/镁”或“硫
化天冬氨酸修饰的褪黑素锌/镁”表示其相应的金属盐。例如，实施例2是使用
实施例1a制备的化合物进行的实验，则图中“修饰的褪黑素”以及“修饰的
褪黑素锌”即分别表示该式2所示的化合物及其锌盐。
实施例2：实施例1a合成的化合物及其锌盐作为保护剂对钴60γ射线
致人外周白细胞损伤的保护作用实验。
在该实施例中，分离健康人的外周白细胞(淋巴细胞)在96孔细胞培养
板中在RPMI1640培养基(含10%新生小牛血清，1000IU/ml重组人白细胞
介素-2，1%青霉素，1%链霉素)中常规培养。使用褪黑素(实施例1a中用来
制备式2的化合物的原料2a)，以及实施例1a中制备的硫化天冬氨酸褪黑
素(化合物2b)和硫化天冬氨酸褪黑素锌(化合物3b)，氨磷丁(临床已经使用
的保护剂作为阳性对照)分别作为保护剂添加到体外培养的人外周白细胞，
终末浓度分别为：褪黑素(3μM和15μM)和硫化天冬氨酸褪黑素(3μM和
15μM)，硫化天冬氨酸褪黑素锌(3μM和15μM)，氨磷丁(200μM和
1000μM)。给药12小时之后(氨磷丁照射前30分钟给药)，使用G50型生物
γ辐照器以1GY/分钟的剂量率对所述人外周白细胞照射8分钟，总辐照剂
量为8GY。照射后72小时，用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测细胞存活率，
用酶标仪在570nm波长处测定OD吸光度值，吸光度越高，细胞数越多，
反之，吸光度越低，细胞数越少，由此反映活细胞的数量。实验独立重复3
次(3复孔/药物处理组)．每次测量重复三次，取其平均值作为单次实验值．对
数据进行方差分析。对照组细胞不给任何药物，也不给予照射，照射组细
胞仅接受总剂量为8GY的钴60γ射线照射,不给任何药物干预。以对照组
的细胞存活数作为100％，其它实验测得的细胞存活数与对照样相比较得到
的百分数即为细胞存活率，结果汇总见图1。图中的对照实验表示没有给予
保护剂也没有进行辐射处理的细胞样品。从图1的实验结果可以看出，在
模拟的放疗条件下，与现有技术已知的褪黑素、氨磷丁等保护剂相比，使
用实施例1a制备的式2所示的硫化天冬氨酸褪黑素及其锌盐可以显著提高
细胞的存活率。特别是当使用低浓度的保护剂，在现有的褪黑素，氨磷丁
等保护剂完全无效的时候，化学修饰的褪黑素仍然能有效地保护细胞，使
细胞存活率接近增加2倍，达40％。在大剂量一次照射的情况下，高剂量
的安磷丁对白细胞保护要稍微强于学化学修饰的褪黑素锌。
实施例3实施例1a合成的化合物作为保护剂对阿霉素、FAS配体(FasL)
和(TNF+环磷酰胺)致人外周白细胞损伤的保护作用
重复实施例2的实验步骤，但是区别在于，本实施例不再使用钴60γ射线
进行辐照，而是在各细胞样品分别给予褪黑素，实施例1a制备的硫化天冬氨
酸褪黑素或其锌盐(细胞培养液中药物的终末浓度均为15微摩尔/升)之后12小
时，以及给予氨磷丁(细胞培养液中药物的终末浓度为1000微摩尔/升)之后30
分钟，向细胞培养液中分别加入阿霉素，FasL和(TNF+环磷酰胺)使其在培养
基中的终末浓度分别为100纳摩尔/升，50纳摩尔/升和(20纳摩尔/升+5000纳
摩尔/升)。在给予阿霉素，FasL和(TNF+环磷酰胺)48小时之后通过MTT法检
测细胞存活率，结果汇总见图2。从图2的实验结果可以看出，在模拟的化疗
条件下，与现有技术已知的氨磷丁保护剂相比，使用实施例1a合成的硫化天
冬氨酸褪黑素或硫化天冬氨酸褪黑素锌盐可以获得显著提高的细胞存活率。引
人注目的是，褪黑素和氨磷丁不能保护细胞使其免于遭受FasL和(TNF+环磷
酰胺)所致的细胞凋亡，只有本发明的经化学修饰的褪黑素才能有效地抑制
FasL和(TNF+环磷酰胺)诱导的细胞凋亡，说明经化学修饰的褪黑素除了具有
抗氧化损伤的功能外，还能直接抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的活性。这证明
化学修饰的褪黑素不但增强了抗凋亡的力度，而且扩展了抗凋亡效果所针对的
化疗药物的范围，是一广谱的细胞凋亡抑制剂。
实施例4实施例1a合成的化合物作为保护剂对γ射线照射的小鼠存活率
的影响(体内实验)
该实验以体重20克左右的10周龄雄性小鼠(C57BL/6J)为实验对象，以12
只小鼠为一组。对照组中的12只小鼠既未给予γ射线辐照，也没有给予保护
剂；以“照射＋修饰的褪黑素锌”组为例，表示施加钴60的γ射线照射前给予
硫化天冬氨酸褪黑素锌。本实施例使用的硫化天冬氨酸褪黑素和硫化天冬氨酸
褪黑素锌是由实施例1a制得的。首先对各组小鼠相应地给予保护剂，具体用
量如下：褪黑素:23毫克/千克/天(0.1毫摩尔)，硫化天冬氨酸褪黑素：52毫克/
千克/天(0.1毫摩尔)，硫化天冬氨酸褪黑素锌：59毫克/千克/天(0.1毫摩尔)，
氨磷丁：400毫克/千克/天(1毫摩尔)。除氨磷丁为腹腔注射外(氨磷丁照射前
30分钟给药)，其余保护剂一律灌胃给药。给药12小时后用钴60γ射线以7Gy
的剂量进行全身照射，辐射源距小鼠80厘米，剂量率0.2Gy／分钟，照射时间
为35分钟。照射一次，照射后连续给药5天，每天一次。记录小鼠的存活数
率，小鼠的存活数与实验组小鼠总数(12只)相比较得到的百分数即为小鼠存活
率，结果汇总见图3。生理盐水灌胃的对照组小鼠受7Gy照射在第30天死亡
11只，存活率为8.33％，褪黑素组在第30天存活3只，存活率为25％，硫化
天冬氨酸褪黑素组在第30天存活6只，存活率为50％，硫化天冬氨酸褪黑素
锌组在第30天存活9只，存活率为75％，氨磷丁组在第30天存活7只，存活
率为58％。经化学修饰的褪黑素明显降低高剂量射线所致动物的死亡率。
本发明人通过上述的体内外实验还发现硫化天冬氨酸褪黑素镁/锌的抗凋
亡能力要比硫化天冬氨酸褪黑素要高15-20%左右，同时，将硫化天冬氨酸修
饰的褪黑素制成盐的另外一个目的是使化合物更加稳定。
实施例5实施例1b合成的化合物作为保护剂对钴60γ射线致人外周白细
胞损伤的保护作用实验
在该实施例中，分离健康人的外周白细胞(淋巴细胞)，加入重组人白细胞
介素-2(1000单位/ml，每2天加一次)进行体外培养。使用实施例1b制备的硫
化天冬氨酸修饰的褪黑素锌盐(即式3所示的化合物的锌盐)、氨磷丁等化合物
分别作为保护剂添加到体外培养的人外周白细胞内培养物，终末浓度分别为硫
化天冬氨酸褪黑素锌(15μM)，氨磷丁(1000μM)。给保护剂12小时之后(氨磷丁
照射前30分钟给药)，使用钴60γ射线照射1GY/分钟的剂量对所述人外周白细
胞照射2分钟，单次照射的总剂量为2GY，每天照射一次，连续照射5天，每
次照射前均给予保护剂，于最后一次照射后的第2天，用MTT法检测细胞存
活率。对照组细胞不给任何药物，也不给予照射，照射组细胞仅接受总剂量为
10GY的γ射线照射,不给任何药物干预。以对照组的细胞存活数作为100％，
其它实验测得的细胞存活数与对照组相比较得到的百分数即为细胞存活率，结
果汇总见图4。从图4的实验结果可以看出，在模拟的放疗条件下，与现有技
术已知的氨磷丁保护剂相比，使用实施例1b制备的硫化天冬氨酸褪黑素锌可
以显著提高细胞的存活率，在连续多次照射的情况下硫化天冬氨酸褪黑素锌
的保护效果要优于氨磷丁。
实施例6实施例1d合成的化合物作为保护剂对紫杉醇致人外周白细胞损
伤的保护作用实验
本实施例使用实施例1d制备的产物(即式5的化合物的锌盐)进行实验。
重复实施例5的实验步骤，但是区别在于，本实施例不再使用钴60γ射线进行
辐照，而是在各细胞样品给予实施例1d制备的产物的锌盐(细胞培养液中药物
的终末浓度为15微摩尔/升)之后12小时，氨磷丁(细胞培养液中药物的终末浓
度为1000微摩尔/升)之后30分钟，向细胞培养液中加入紫杉醇，使其终末浓
度为3.5纳摩尔/升，连续给予紫杉醇5天，每次给予紫杉醇前均给予保护剂，
在最后一次给予紫杉醇48小时之后通过MTT法检测细胞存活率，结果汇总见
图5。从图5的实验结果可以看出，在模拟的化疗条件下，与现有技术已知的
氨磷丁保护剂相比，使用实施例1d合成的硫化天冬氨酸褪黑素锌可以获得显
著提高的细胞存活率，效果明显优于氨磷丁。
实施例7实施例1c合成的化合物作为保护剂对顺铂致人外周白细胞损伤
的保护作用实验
本实施例使用实施例1c合成的化合物(即式4所示的硫化天冬氨酸修饰的
褪黑素的锌盐)，重复实施例6的实验步骤，但是区别在于，本实施例不再使
用紫杉醇处理细胞，而是在各细胞样品给予硫化天冬氨酸褪黑素锌(细胞培养
液中药物的终末浓度为15微摩尔/升)之后12小时，氨磷丁(细胞培养液中药物
的终末浓度为1000微摩尔/升)之后30分钟，向细胞培养液中加入顺铂，使其
终末浓度为5微摩尔/升，连续给予顺铂5天，每次给予顺铂前均给予保护剂，
在最后一次给予顺铂48小时之后通过MTT法检测细胞存活率，结果汇总见图
6。从图6的实验结果可以看出，在模拟的化疗条件下，与现有技术已知的氨
磷丁保护剂相比，使用实施例1c的硫化天冬氨酸褪黑素锌可以获得显著提高
的细胞存活率。
实施例8实施例1b合成的化合物作为保护剂对γ射线致小鼠骨髓细胞损
伤的保护作用(体内实验)
本实施例使用实施例1b合成的化合物(即式3的化合物的锌盐)进行实验。
该实验以体重20克左右的10周龄雄性小鼠为实验对象，以9只小鼠为一组。
照射组只给予γ射线辐照，不给予保护剂，对照组中的9只小鼠既未给予γ射
线辐照，也没有给予保护剂；以“照射＋修饰的褪黑素锌”组为例，表示施加钴
60γ射线照射前给予硫化天冬氨酸褪黑素锌。首先对各组小鼠相应地给予保护
剂，具体用量如下：硫化天冬氨酸褪黑素锌：56毫克/千克/天，氨磷丁：400
毫克/千克/天。除氨磷丁为腹腔注射外(照射前30分钟给氨磷丁)，其余保护剂
一律灌胃给药。给药12小时后用钴60γ射线以2GY的剂量进行全身照射，辐
射源距小鼠80厘米，剂量率0.25Gy／分钟，照射时间为8分钟。每天照射一
次，连续照射5天，每天照射前给予保护剂，停止照射后每天仍然给予保护剂
连续给药5天，再喂养5天。分别于第3天，第8天，第13天脱颈处死小鼠(每
次处死3支小鼠)。无菌条件下取出取小鼠右侧完整股骨，剪去股骨上端，用
装有6号针头的注射器(事先用RPMI1640培养液冲洗)由骰骨下端刺入，将骨
髓腔内的全部骨髓细胞冲入盛有10ml培养液的广口瓶中(反复冲3次)。然后，
换4号针头吹打细胞，制备单细胞悬液。取100ul单细胞悬液+0.9ml白细胞稀
释液，按白细胞计数法计数有核细胞数，进行单因素方差分析，数据用x±s表
示。每组中3只小鼠的细胞计数结果取平均值作为最终测试结果。以对照组的
结果作为100％细胞存活，通过将各组的最终测试结果与对照组进行比较，获
得相应的细胞存活率百分数，结果汇总见图7。从图7的实验结果可以看出，
在模拟的放疗条件下，与现有技术已知的氨磷丁保护剂相比，使用实施例1b
制备硫化天冬氨酸褪黑素锌在照射期间可获得与氨磷丁相似的骨髓保护功能，
然而，硫化天冬氨酸褪黑素锌有显著促进放疗后骨髓恢复的功效，氨磷丁则无
该功能。
实施例9实施例1c制备的化合物作为保护剂对环磷酰胺致小鼠骨髓
细胞损伤的保护作用(体内实验)
本实施例使用实施例1c制备的化合物(即式4的化合物的锌盐)进行实
验。重复实施例8的步骤，但是区别在于，本实施例不再进行钴60γ射线
辐射，而是在给予保护剂之后12小时通过腹腔注射，以35毫克/千克的剂
量给予小鼠环磷酰胺。按照上述剂量连续给予环磷酰胺5天并连续给予保
护剂5天，每天先给保护剂后给环磷酰胺，停止给环磷酰胺后每天仍然给
予保护剂连续5天，再喂养3天。分别于第3天，第8天，第13天脱颈处
死小鼠(3支小鼠/次)。取小鼠右侧完整股骨分离骨髓并计算骨髓细胞存活
率。结果汇总见图8。从图8的实验结果可以看出，在模拟体内化疗条件下，
与现有技术已知的氨磷丁等保护剂相比，使用实施例1c制备的硫化天冬氨
酸褪黑素锌在化疗期间可获得与氨磷丁相似的骨髓保护功能，然而，硫化
天冬氨酸褪黑素锌有显著促进化疗后骨髓恢复的功效，氨磷丁则无此功能。
实施例10实施例1a制备的化合物作为保护剂对卡铂致小鼠血小板损伤
的保护作用(体内实验)
本实施例使用实施例1a制备的产物(即式2的化合物的锌盐)进行实验。重
复实施例9的步骤，但是区别在于，本实施例不再用环磷酰胺处理小鼠，而是
在给予保护剂之后12小时通过腹腔注射，以30毫克/千克的剂量给予小鼠卡铂。
按照上述剂量连续给予卡铂5天并连续给予保护剂5天，每天先给保护剂后给
卡铂，停止给卡铂后每天仍然给予保护剂连续给药5天，继续喂养。分别于第
7天，第14天，第21天抽取小鼠全血，用血细胞分析仪测定血小板的数目。
结果汇总见图9。从图9的实验结果可以看出，在模拟体内化疗条件下，与现
有技术已知的氨磷丁等保护剂相比，使用实施例1a制备的硫化天冬氨酸褪黑
素锌在化疗期间可获得与氨磷丁相似的骨髓保护功能，然而，硫化天冬氨酸褪
黑素锌有显著促进化疗后血小板恢复的功效，氨磷丁则无此功能。
实施例11实施例1a制备的化合物作为保护剂对阿霉素致小鼠心脏毒性的
保护作用(体内实验)
重复实施例10的步骤，保护剂剂量不变，但是区别在于，本实施例不再
用卡铂处理小鼠，而是在给予保护剂之后12小时通过腹腔注射，以较大剂量
(5毫克/千克)的阿霉素给予小鼠。按照上述剂量连续给予阿霉素5天并连续给
予保护剂5天，每天先给保护剂后给阿霉素，停止给阿霉素后每天仍然给予保
护剂连续给药5天，再喂养3天后，将存活下来小鼠脱颈处死(3支小鼠/组)，
将心肌组织制成石蜡切片，末端标记法检测细胞凋亡。同时，在小鼠处死时，
留取全血用全自动生化分析仪器(UniCel DxC 600 Synchron，贝克曼公司
(Beckman)美国)测定阿霉素及合用保护剂后小鼠血清心肌酶谱(谷草转氨酶
/AST、乳酸脱氢酶/LDH、肌酸激酶同工酶/CKMB)的变化。结果汇总见图10A
和10B。从图10A的实验结果可以看出，在模拟体内化疗条件下，与现有技术
已知的氨磷丁等保护剂相比，使用实施例1a制备的硫化天冬氨酸褪黑素锌在
化疗期间可获得比氨磷丁更有效的心肌保护功能，硫化天冬氨酸褪黑素锌显著
降低阿霉素所致的心肌细胞凋亡。从图10B可知，硫化天冬氨酸褪黑素锌处理
组的小鼠的血清酶的含量显著低于对照组，优于氨磷丁处理组，说明硫化天冬
氨酸褪黑素锌可抑制阿霉素导致的心肌坏死。
通过以上实施例可以看到，本发明合成的用硫化天冬氨酸修饰的褪黑素衍
生物或其金属盐可以用来有效地减轻各种放化疗带来的副作用，对正常组织细
胞施加更充分的保护，有效地解决了目前癌症治疗过程中无法克服的高副作用
问题。
另外，在肿瘤治疗过程中所使用的保护剂往往也同样能够对肿瘤细胞带来
保护作用，因此保护剂在降低恶性肿瘤细胞放化疗副作用的同时，也可能使得
肿瘤对放化疗具有耐受性。本发明人通过深入的研究发现，通过将硫化天冬氨
酸修饰的褪黑素衍生物或其金属盐与吲哚美辛联用，可以在有效保护正常细胞
的同时显著降低对肿瘤细胞的保护效果，由此实现了选择性的保护作用。在一
下实施例中显示了此种选择性。
实施例12吲哚美辛与本发明保护剂联用条件下对γ射线致裸鼠移植性肿
瘤体内抑瘤效果和正常组织的选择性效果(体内实验)
在本实施例中使用实施例1a合成的产物(即式2的化合物的锌盐)进行实
验。在无菌条件下，将处于对数生长期的乳腺癌细胞(MCF-7)悬液(用生理盐水
将细胞浓度调至1×107w/mL)接种于实验雌性裸鼠右侧腋背部皮下，每只裸鼠接
种量为0.3ml，即含细胞数为3×106/只。10天后出现4-6毫米大的皮下移植瘤。
将荷瘤裸鼠随机分为组，每组3只。(1)对照组,不做任何处理;(2)照射组,不给
任何保护剂;(3)放射治疗+硫化天冬氨酸褪黑素锌；(4)放射治疗+吲哚美辛；(5)
放射治疗+(硫化天冬氨酸褪黑素锌+吲哚美辛)；(6)放射治疗+氨磷丁。首先按
照以下所述的剂量对各组荷瘤裸鼠给予以下化合物：吲哚美辛(10毫克/千克/
天，灌胃给药)和保护剂(硫化天冬氨酸褪黑素锌;56毫克/千克/天，氨磷丁:400
毫克/千克/天，除氨磷丁(照射前30分钟)皮下注射外，其余保护剂一律灌胃给
药。给药后12小时用钴60-γ射线对荷瘤裸鼠进行照射治疗，剂量为2GY，辐
射源距动物80厘米，剂量率0.25GY／分钟，照射时间为8分钟，分次照射，
每天照射一次，每次2GY,连续照射5次(共5天)。每次照射前给予保护剂。
在照射期间，每周用精密电子天平测量裸鼠体重，接种后每天观察肿瘤的生长
情况及有无红肿、破溃。成瘤后，检查移植瘤的表面形态及活动度，每2～3
天用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径(a)及最短径(b),按公式V=0.5ab2计算肿
瘤体积，求其平均值，绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率，肿瘤生长抑制率＝(对
照组平均体积-照射组平均体积)/对照组平均体积×100%。并分别在照射后5、
15、20、25、30天分别取小鼠尾静脉血进行白细胞计数,用美国产的BECKMAN
LH750五分类全自动血细胞分析仪检测白细胞数目。各组内裸鼠肿瘤组织的相
对体积百分数汇总见图11A。从图11A可以看到，与已知的保护剂氨磷丁相比，
硫化天冬氨酸褪黑素锌与吲哚美辛联合使用的时候，可以显著地抑制肿瘤细胞
对放疗的耐受性，由此获得更显著的放疗效果，导致肿瘤组织的体积显著减小。
更为重要的是，从图11B可以看到，硫化天冬氨酸褪黑素锌与吲哚美辛联合使
用的时候没有增强射线对正常白细胞的杀伤作用，不会对正常组织细胞造成不
利的影响，这显示了本发明的硫化天冬氨酸褪黑素锌与吲哚美辛联合使用所表
现出的针对肿瘤细胞的选择性抑制效果，而单用吲哚美辛可有轻度增加射线
对正常白细胞的损伤，而硫化天冬氨酸褪黑素锌则可以减轻吲哚美辛这样的副
作用。由图11A可以看出，单用硫化天冬氨酸褪黑素锌有一定程度的保护肿瘤
组织免受射线的损伤，使肿瘤对放射治疗变得不敏感，有轻度降低疗效之虑，
这是由于硫化天冬氨酸褪黑素锌有强大的抗凋亡能力，硫化天冬氨酸褪黑素锌
在进入细胞缺乏一定的选择性，故也能在一定程度上保护肿瘤细胞，虽然其保
护强度低于对正常组织的保护强度。不希望受到硫化天冬氨酸褪黑素锌有一定
程度的保护肿瘤组织免受放化疗的损伤的限制，发明人认为，吲哚美辛是一抗
炎药，主要通过抑制COX-2而发挥作用，COX-2同时还是一抗凋亡蛋白，其
高表达使细胞对放化疗抵抗，所以抑制COX-2能增强细胞对放化疗的敏感性，
由于肿瘤细胞高表达COX-2，加之肿瘤组织一般伴有炎症病理改变以及弱酸环
境，这些因素使得具有弱酸性质的吲哚美辛能选择性地优先地进入并积聚在肿
瘤组织内，从而使肿瘤细胞对治疗变得更敏感，能有效地对抗硫化天冬氨酸褪
黑素锌对肿瘤的保护，而对正常细胞无明显细胞毒效应。吲哚美辛与硫化天冬
氨酸褪黑素锌同时使用或将它们制成复方制剂均可以在临床达到对放化疗减
毒增敏的效果。
实施例13吲哚美辛与保护剂对联合化疗(阿霉素+5-氟尿嘧啶+环磷酰胺)
致裸鼠移植性肿瘤体内抑瘤效果和正常组织的影响
本实施例使用实施例1b合成的产物(即式3的化合物的锌盐)进行实验。
重复实施例12的步骤，保护剂剂量不变，区别在于本实施例不再进行钴60-γ
射线照射，而是通过联合应用化疗药物(阿霉素：2毫克/千克/次，5-氟尿嘧啶：
25毫克/千克/次，环磷酰胺：30毫克/千克/次)行腹腔注射给药对荷瘤裸鼠进
行化疗。按照上述剂量每天给化疗药一次，连续用药5天，化疗前每天给予保
护剂连续5天，停用保护剂后的第3天脱颈处死裸鼠、取肿瘤组织和正常胃窦
组织制成石蜡切片，用末端标记法检测细胞凋亡的发生情况，并测量计算正常
组织(胃窦组织)和肿瘤组织的相对存活百分数汇总见图12A。并在最后一次化
疗后的第3天从小鼠尾静脉采血，用血细胞分析仪检测白细胞数汇总见图12B。
具体来说，图12A中横坐标左侧的一组数据表示正常组织的相对存活百分数，
而横坐标右侧的一组数据表示肿瘤组织的相对存活百分数。从图12A中可以看
出，当实施例1b的硫化天冬氨酸褪黑素锌与吲哚美辛结合使用的时候，正常
组织的相对存活百分数与单独使用硫化天冬氨酸褪黑素锌时的结果基本相等，
而肿瘤细胞的存活率则显著下降。由此可见，与单独使用硫化天冬氨酸褪黑素
锌的情况相比，如果硫化天冬氨酸褪黑素锌与吲哚美辛联合使用，可以显著增
强化疗药对肿瘤细胞的杀伤，降低肿瘤细胞对化疗药的耐受性，同时不会对正
常组织细胞造成不利的影响，这显示了本发明的硫化天冬氨酸褪黑素锌与吲哚
美辛联用所表现出的针对肿瘤细胞的选择性效果。从图12B中可以看出，天冬
氨酸褪黑素锌与吲哚美辛联用，也没有增强化疗药对造血系统的抑制。
实施例14本发明的保护剂与硫化天冬氨酸的抗凋亡性质比较
为了进一步证明本发明保护剂的优异性能，申请人进一步测试了硫化天冬
氨酸、褪黑素、硫化天冬氨酸＋褪黑素、硫化天冬氨酸修饰的褪黑素降低阿霉
素对人肾胚胎细胞(HEK293)的损伤的效果。
该实施例使用实施例1a合成的产物，即式2所示的化合物。在此实施例
用，分离人肾胚胎细胞(HEK293)如实施例2所述进行体外培养。向细胞培养液
中加入阿霉素，使其终末浓度为25纳摩尔/升。给予阿霉素2小时后，使用褪
黑素(实施例1a中用来制备式2的化合物的原料2a)，硫化天冬氨酸(实施例
1a中的原料1d)以及实施例1a中制备的硫化天冬氨酸褪黑素(化合物2b)，
分别作为保护剂添加到体外培养的人肾胚胎细胞(HEK293)中，终末浓度分别
为：硫化天冬氨酸(3μM、15μM和75μM)，褪黑素(3μM、15μM和75μM)、
硫化天冬氨酸＋褪黑素(摩尔比例1:1，各自的浓度为3μM、15μM和75μM)，
硫化天冬氨酸修饰的褪黑素(3μM、15μM和75μM)。给予保护剂48小时之
后用MTT法检测细胞的存活情况，汇总结果见图13。图中对照组表示未
给予保护剂也没有给予阿霉素的细胞样，阿霉素组表示仅给予阿霉素而没
有给予保护剂的细胞样。从图13可以看到，在相同用量的情况下，硫化天
冬氨酸修饰的褪黑素的保护效果显著优于硫化天冬氨酸、褪黑素以及硫化
天冬氨酸和褪黑素的混合物。
实施例15本发明的保护剂的小鼠急性毒理资料（LD50）
在本实施例中，通过以下步骤测定式2的硫化天冬氨酸修饰的褪黑素
及其锌盐的小鼠半数致死量（LD50）：该实验以体重20克左右的10周龄雄
性小鼠为实验对象，以9只小鼠为一组。采用灌胃给药途径进行试验，一次
性给予硫化天冬氨酸修饰的褪黑素和硫化天冬氨酸修饰的褪黑素锌,使小鼠
陆续死亡。观察至给药后15天，记录每组小鼠的死亡数目，结果显示小鼠
口服硫化天冬氨酸修饰的褪黑素的LD50为2050mg/kg，硫化天冬氨酸修饰
的褪黑素锌的LD50为1525mg/kg。硫化天冬氨酸修饰的褪黑素锌对小鼠的
急性毒性要强于硫化天冬氨酸修饰的褪黑素，可能是锌离子减弱了小鼠对其
化合物的耐受。
综上所述，本发明人通过对褪黑素及褪黑素衍生物进行修饰，开发出
了一类具有极佳性能的保护剂。该保护剂能够更显著地减少放化疗带来的
负面影响，并且在与吲哚美辛联用的时候可以表现出出人意料的选择性，
在降低放化疗毒副反应的同时还可以显著抑制肿瘤组织对放化疗的耐受
性。从而在很大程度上一举解决了肿瘤治疗的两大挑战-副作用和耐药。