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1、(10)申请公布号 CN 102827125 A(43)申请公布日 2012.12.19CN102827125A*CN102827125A*(21)申请号 201210210868.5(22)申请日 2012.06.21C07D 311/30(2006.01)C07D 311/40(2006.01)A01N 43/16(2006.01)A01P 13/00(2006.01)(71)申请人浙江大学地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号(72)发明人陈英旭 肖溪 黄皓旻(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司 33200代理人周烽(54) 发明名称大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵。
2、的制备方法和应用(57) 摘要本发明公开了一种大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵的制备方法和用途，该方法首先将大麦用乙醇提取，减压蒸馏得粗提物；然后用石油醚或6碳以上的烷烃萃取，再用氯仿、二氯甲烷或乙醚萃取，然后用正向硅胶柱分离，最后制备液相分离，得到大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵；该大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵作为水华藻类抑制剂，可用于控制或治理由于水体富营养化而引起淡水湖泊藻类水华的暴发；本发明所述旋光异构体赛克灵的制备方法，所用材料为农业废弃物，材料来源广泛，成本低，适于大规模推广；该方法制备的旋光异构体赛克灵用于抑制蓝藻生长，具有生态安全性好、使用方便、无二次污染等特点。(51)Int.Cl.。
3、权利要求书1页 说明书8页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 8 页1/1页21.一种大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵的制备方法，其特征在于包括以下步骤： （1）将大麦在50-70 条件下烘干48-96小时，粉碎至20-50目，在20-95下用体积百分比为20-80 %的乙醇提取3-5次，每次提取2-6小时，合并提取液；将合并的提取液在40-50下于旋转蒸发仪中减压蒸馏去除溶剂，得到粗提物；（2）将步骤1得到的粗提物溶于水后，加入体积为水的1-1.5倍的石油醚或6碳以上的烷烃萃取，取水相；在水相中加入体积为水的1-1.5倍的氯仿、二氯甲烷或乙醚萃取，。
4、取有机相；（3）将步骤2得到的有机相用正向硅胶柱分离，洗脱剂由二氯甲烷和甲醇按体积比19:1混合组成，收集洗脱液；（4）对步骤3收集的洗脱液进行制备液相分离，取第四个峰的细分流分；（5）对步骤4的细分流分进行制备液相分离，得到对应的2个纯化合物，这2个纯化合物即为一对旋光异构体：大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵，其分子式为：C27H26O11，名称为：5,7-二羟基-2-4-2-羟基-1-羟甲基-2-(4-羟苯基)羟乙基-3,5-甲氧基苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮,3-甲氧基。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的大麦为收割期的大麦的地上部分。3.根据权利要求1所述的制备方法，其。
5、特征在于，所述步骤（4）和步骤（5）中的制备液相分离过程中，制备色谱柱可为Zorbax Stable Bond C18柱，色谱条件为以乙腈和质量配比为0.01的甲酸水溶液按体积比2-4:6-8混合的混合溶剂为流动相进行梯度测定，在检测波长254nm下，采集10-40 min的色谱数据，确定相应特征次级物质色谱峰。4.一种大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵的用途，其特征在于，所述大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵作为水华藻类抑制剂，用于控制或治理由于水体富营养化而引起淡水湖泊藻类水华的暴发。权 利 要 求 书CN 102827125 A1/8页3大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵的制备方法和应用 技术领域0001。
6、 本发明属于水体污染控制领域，特别地，涉及一种大麦化感抑藻黄酮木质素类化合物塞克灵的制备方法和用途。 背景技术0002 近十几年来中国环境问题日趋严重，其中之一表现为大量氮、磷等营养性污染物直接进入水体，导致水体生态系统失衡。蓝藻极易在富营养化淡水水体中暴发生长，形成水华。蓝藻水华的暴发会严重威胁到城市饮用水供应安全，对人类健康和社会经济发展有着深远的负面影响。 0003 现有的藻类控方法有物理法、化学法和生物法。目前最常用有效的是通过化学药剂(统称杀藻剂)来控制水中藻类的繁殖，但杀藻剂本身具有的广谱生物毒性，对水体生态系统造成难以修复的二次化学污染，破坏水质，引起更严重的后果。而物理技术和传。
7、统的生物技术则存在着操作时间长、难度大、费用高等缺点。因此，人们热切寻求一种行之有效地而且没有二次污染或其他生态危害效益的长期抑制藻类过渡生长的方法。 0004 有研究表明植物所产生的化感物质来源广泛、生态安全性好，对藻类具有专一的抑制性，可作为藻类抑制剂使用。“Tibetan Hulless Barley Efficiently Inhibited Bloom-Forming Cyanobacterium Microcystis aeruginosa”（发表于Chemosphere.2010,9(81),1118-1123）已报道以西藏大麦为代表的东方型大麦具有显著的抑藻活性，但文中仅采用浸。
8、泡大麦秸秆的方法获得藻类抑制剂，并未对其进一步纯化，明确其中有效抑藻的成分，因此共存的多组分（尤其是浸提液中含有的氮、磷营养成分）可能会影响其后期抑制效果。申请人在2011年申请的专利（专利公开号为：CN102415416A，名称为：“一种从大麦中制备新型水华藻类抑制剂的方法”）中指出大麦秸秆的氯仿及乙酸乙酯提取液具有明显的抑藻活性，但该专利中仅进行了简单的极性萃取分离，没有对提取物的活性成分进行进一步分离，未能明确说明其中起抑藻作用的主要物质。由于提取物中物质组成的复杂性，明确其中主要成分的化学结构及其制备方法十分必要。针对上述不足，本专利在前期研究基础上，明确了黄酮木质素类旋光异构体为大麦。
9、中主要的抑藻化感物质，并开发了从大麦中制备该物质的方法。 发明内容0005 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种大麦化感抑藻旋光异构 体赛克灵的制备方法和用途，该方法使用的材料来源广泛、抑藻效果良好。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵的制备方法，包括以下步骤： 0007 （1）将大麦在50-70条件下烘干48-96小时，粉碎至20-50目，在20-95下用体积百分比为20-80%的乙醇提取3-5次，每次提取2-6小时，合并提取液；将合并的提取液在40-50下于旋转蒸发仪中减压蒸馏去除溶剂，得到粗提物； 说 明 书CN 102827125。
10、 A2/8页40008 （2）将步骤1得到的粗提物溶于水后，加入体积为水的1-1.5倍的石油醚或6碳以上的烷烃萃取，取水相；在水相中加入体积为水的1-1.5倍的氯仿、二氯甲烷或乙醚萃取，取有机相； 0009 （3）将步骤2得到的有机相用正向硅胶柱分离，洗脱剂由二氯甲烷和甲醇按体积比19:1混合组成，收集洗脱液； 0010 （4）对步骤3收集的洗脱液进行制备液相分离，取第四个峰的细分流分； 0011 （5）对步骤4的细分流分进行制备液相分离，得到对应的2个纯化合物，这2个纯化合物即为一对旋光异构体：大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵，其分子式为：C27H26O11，名称为：5,7-二羟基-2-4-2-。
11、羟基-1-羟甲基-2-(4-羟苯基)羟乙基-3,5-甲氧基苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮,3-甲氧基。 0012 进一步地，所述的大麦为收割期的大麦的地上部分。 0013 进一步地，所述步骤（4）和步骤（5）中的制备液相分离过程中，制备色谱柱可为Zorbax Stable Bond C18柱，色谱条件为以乙腈和质量配比为0.01的甲酸水溶液按体积比2-4:6-8混合的混合溶剂为流动相进行梯度测定，在检测波长254nm下，采集10-40min的色谱数据，确定相应特征次级物质色谱峰。 0014 一种大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵的用途，所述大麦化感抑藻旋光异构体赛克灵作为水华藻类抑制剂，用于控制或。
12、治理由于水体富营养化而引起淡水湖泊藻类水华的暴发。 0015 本发明的有益效果是：本发明所述旋光异构体赛克灵的制备方法，所用材料为农业废弃物，材料来源广泛，成本低，适于大规模推广；该方法制备的旋光异构体赛克灵用于抑制蓝藻生长，具有生态安全性好、使用方便、无二次污染等特点。 具体实施方式0016 本发明旋光异构体赛克灵的制备方法，包括以下步骤： 0017 1、将大麦在50-70条件下烘干48-96小时，粉碎至20-50目，在20-95下用体积百分比为20-80%的乙醇提取3-5次，每次提取2-6小时，合并提取液；将合并的提取液在40-50下于旋转蒸发仪中减压蒸馏去除溶剂，得到粗提物。 0018 。
13、2、将步骤1得到的粗提物溶于水后，加入体积为水的1-1.5倍的石油醚或6碳以上的烷烃萃取，取水相；在水相中加入体积为水的1-1.5倍的氯仿、二氯甲烷或乙醚萃取，取有机相。 0019 3、将步骤2得到的有机相用正向硅胶柱分离，洗脱剂由二氯甲烷和甲醇按体积比19:1混合组成，收集洗脱液。 0020 4、对步骤3收集的洗脱液进行制备液相分离，取第四个峰的细分流分。 0021 制备色谱柱可为Zorbax Stable Bond C18柱，色谱条件为以乙腈和质量配比为0.01的甲酸水溶液混合溶剂为流动相进行梯度测定，在检测波长254nm下，采集10至40min的色谱数据，确定相应特征次级物质色谱峰。 0。
14、022 5、对步骤4的细分流分进行制备液相分离，得到对应的2个纯化合物，这2个纯化合物即为一对旋光异构体：赛克灵A和赛克灵B； 0023 赛克灵A的结构式如下： 说 明 书CN 102827125 A3/8页50024 0025 赛克灵B的结构式如下： 0026 0027 制得的赛克灵的分子式为：C27H26O11，名称为：5,7-二羟基-2-4-2-羟基-1-羟甲基-2-(4-羟苯基)羟乙基-3,5-甲氧基苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮,3-甲氧基。 0028 实验证明，赛克灵具有抑藻活性，可用于控制或治理由于水体富营养化而引起淡水湖泊藻类水华的暴发。 0029 下面根据实施例详细描述本发。
15、明，本发明的目的和效果将变得更加明显。 0030 实施例1 0031 黄酮木质素类旋光异构体赛克灵的制备方法 0032 取5.0Kg大麦的地上部分，在50条件下烘干96小时，得到干燥的植物材料。取1千克干燥的大麦植物粉碎至20目，用5L含量为80%的含水乙醇对其进行浸润，于95条件下提取3次，每次提取4小时，合并得到大麦醇提取液；将大麦醇提取液在40条件下于旋转蒸发仪中减压蒸馏去除溶剂，得到浸膏A；将浸膏A溶于水后，加入体积为水的1-1.5倍的石油醚萃取，取水相；在水相中加入体积为水的1-1.5倍的氯仿萃取，取氯仿相，浓缩氯仿相提取物后得到浸膏B； 0033 其次对浸膏B进行硅胶柱（100-2。
16、00目）层析，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，以体积比为100：0、49：1、19：1、9：1、4：1和0：100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液并去除溶剂，对各洗脱成分进行抑藻活性测试后，得到19:1的洗脱组分C抑藻效果最好。对洗脱组分C进行制备液相分离，制备色谱柱为Zorbax Stable Bond C18柱（4.6mm250mm，5m，Agilent，柱温30度），色谱条件为以乙腈（A）和0.01甲酸水溶液（B）混合溶剂为流动相进行梯度测定。0至40min内，使A浓度从20%增加到40。紫外检测波长范围为190到400nm。在检测波长254nm下，采集10至40min的色谱数据，确定相应特征次级。
17、物质色谱峰。 0034 依据出峰情况分为7个不同流分，分别旋蒸干后转至小青霉素瓶，水浴上挥去有说 明 书CN 102827125 A4/8页6机溶剂，放冰箱冷冻，转至冷冻干燥机中冻干，称重，即得到各细组分的制备流分，其中4#（即保留时间为25-30min）细分流分具有最强抑藻能力。 0035 最后对4#细分流分进行数次制备液相分离，将不同的峰分别接入不同的接收管中，干燥称重。若未能完全分离各峰，则重复以上过程一次，确保接收管中得到的为纯化合物，最终得到保留时间分别为22-25min和26-30min的2个纯化合物，其重量分别为15.4和12.0毫克，经过NMR分析鉴定得这2个纯化合物即为一对旋。
18、光异构体：赛克灵A和赛克灵B，其分子式C27H26O11，具体为5,7-二羟基-2-4-2-羟基-1-羟甲基-2-(4-羟苯基)羟乙基-3,5-甲氧基苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮,3-甲氧基（注：英文名称为5,7-Dihydroxy-2-4-2-hydroxy-1-hydroxymethyl-2-(4-hydroxyphenyl)ethoxy-3,5-dimethoxyphenyl-4H-1-benzopyran-4-one,3-Methoxy），俗名赛克灵（salcolin）。 0036 该旋光异构体具有以下的波谱特特性： 0037 表1：赛克灵A和B的NMR结果（13C谱） 0038 。
19、00390040 表2：赛克灵A和B的NMR结果（1H谱） 0041 说 明 书CN 102827125 A5/8页70042 实施例2 0043 与实施例1不同之处在于： 0044 取3.0Kg大麦的地上部分，在60条件下烘干64小时，得到干燥的植物材料。取0.6千克干燥的大麦植物粉碎至20目，用4L含量为20%的含水乙醇对其进行浸润，于20条件下提取5次，每次提取6小时，合并得到大麦醇提取液，在50下减压浓缩获得浸膏。浸膏水复溶后，加入体积为水的1-1.5倍的石油醚萃取，取水相；在水相中加入体积为水的1-1.5倍的氯仿萃取，取氯仿相，并去除溶剂得到氯仿提取物。将氯仿提取物进行硅胶柱（100。
20、-200目）分离，洗脱剂为体积比为19：1的二氯甲烷和甲醇混合物，收集洗脱液并去除 溶剂，将上述洗脱组分进行制备液相分离，色谱条件与实施例1相同，制备得到7个细分组分，将4#（即保留时间为25-30min）细分组分进行数次制备液相分离，将主要的峰I和峰II分开，得到保留时间分别为22-25min和26-30min2个纯化合物，其重量分别为10.7和6.9毫克，通过常规的藻类抑制实验得到两者均具有显著的抑藻活性。 0045 实施例3 0046 与实施例1不同之处在于： 0047 取4.5Kg大麦的地上部分，在70条件下烘干48小时，得到干燥的植物材料。取1.5千克干燥的大麦植物粉碎至20目，用8。
21、L含量为40%的含水乙醇对其进行浸润，于50条件下提取3次，每次提取2小时，合并得到大麦醇提取液，在45下减压浓缩获得浸膏。水复溶后，加入体积为水的1-1.5倍的石油醚萃取，取水相；在水相中加入体积为水的1-1.5倍的氯仿萃取，取氯仿相，并去除溶剂得到氯仿提取物。将氯仿提取物进行硅胶柱（100-200目）分离，洗脱剂为体积比为19：1的二氯甲烷和甲醇混合物，收集洗脱液后并去除溶剂，将上述洗脱组分进行制备液相分离，色谱条件与实施例1相同，制备得到7个细分组分，将4#（即保留时间为25-30min）细分组分进行数次制备液相分离，将主要的峰I和峰II分开，得到保留时间分别为22-25min和26-3。
22、0min 2个纯化合物，其重量分别为25.1和17.4毫克，通过常规的藻类抑制实验得到两者具有显著的抑藻活性。 说 明 书CN 102827125 A6/8页80048 实施例4 0049 赛克灵抑藻活性实验： 0050 在250ml锥形瓶中加入100ml培养基、1ml对数生长期的铜绿微囊藻和适量实施例1中的赛克灵A或B，使其最终浓度为25mg/L，以不投加赛克灵的为对照组。利用显微镜和血球计数板对初始藻密度进行记数，控制接种密度为105-106个/ml。铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa，FACHB 469）购自中科院水生所下属中国淡水藻种库，所用培养基为BG11培养基。
23、（其配方见表3），恒温光照培养箱，培养条件为281、光照2400lx、光暗比12：12。活化接种2次（每次培养1星期）后调整藻生长周期为对数期，计数，待用。 0051 表3：BG11培养基的配方 0052 药品名称 工作液浓度（g/L） 药品名称 工作液浓度（g/L）NaNO31.5 柠檬酸铁铵 0.006K2HPO4.3H2O 0.04 EDTA(二钠盐) 0.001MgSO4.7H2O 0.075 Na2CO30.02CaCl2.2H2O 0.036 A5+Co溶液* 1ml柠檬酸 0.006 蒸馏水 919ml00530054 表中，*A5+Co溶液配方（加入1000ml蒸馏水中）如下：。
24、 0055 药品名称 加入量（g） 药品名称加入量（g） 药品名称加入量（g）H3BO32.86g CuSO4.5H2O 0.079g ZnSO4.7H2O 0.222gMnCl2.H2O 1.81g Na2MoO4.2H2O 0.390g Co(NO3)2.6H2O 0.049g0056 藻细胞培养15天，培养期间每天轻微摇动2次，且每5天将实验锥形瓶随机交换位置。第1天、第5天和第15天对培养的藻细胞进行取样检测。 0057 藻类抑制率的计算： 0058 抑制率%=（Csample-Ccontrol）100/Ccontrol； 0059 其中Csample为实验组藻密度，Ccontrol为。
25、对照组藻密度。 0060 实验结果如下： 0061 参见表4，数据表明上述获得的黄酮木质素类旋光异构体赛克灵均具有显著的抑藻活性，而且赛克灵作用的中期效果较为明显，而在添加药剂长期之后，抑制活性有所下降。这也说明赛克灵杀藻的作用并非直接致死，而是减缓藻种群生长的速度。因此，其不会导致蓝藻在强外界压力下的进一步进化和变异，释放更多的藻毒素，危害水资源安全，具有较好的生态安全性性，适合在自然水体中使用。但使用时要注意每隔一段时间补充添加赛克灵，以维持其抑藻效果。 0062 表4： 0063 抑制率/% 赛克灵A 赛克灵B1d - 5.45d 68.8 61.415d 16.9 20.40064 上。
26、述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 说 明 书CN 102827125 A7/8页90065 实施例5： 0066 在1L锥形瓶中加入500ml BG11培养基、5ml对数生长期的藻和适量实施例1中的赛克灵A或B，使其最终浓度为35mg/L，以不投加赛克灵的为对照组。利用显微镜和血球计数板对初始藻密度进行记数，接种密度为105-106个/ml。铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa，FACHB 469）购自中科院水生所下属中国淡水藻种库，所用培养基为BG11培养基（其。
27、配方见表3），恒温光照培养箱， 培养条件为281、光照2400lx、光暗比12：12。活化接种2次（每次培养1星期）后调整藻生长周期为对数期，计数，待用。 0067 藻细胞培养15天，培养期间每天轻微摇动2次，且每5天将实验锥形瓶随机交换位置。第1天、第5天和第15天对培养的藻细胞进行取样检测。 0068 藻类抑制率的计算： 0069 抑制率%=（Csample-Ccontrol）100/Ccontrol； 0070 其中Csample为实验组藻密度，Ccontrol为对照组藻密度。 0071 实验结果如下： 0072 参见表5，数据表明上述获得的黄酮木质素类旋光异构体赛克灵的抑藻效果与实施例。
28、1中的结果相一致 0073 表5： 0074 抑制率/% 赛克灵A 赛克灵B1d 1.1 4.25d 78.2 74.915d 40.1 33.40075 实施例6： 0076 在500ml锥形瓶中加入300ml BG11培养基、3ml对数生长期的藻和适量实施例1中的赛克灵A或B，使其最终浓度为25mg/L，以不投加赛克灵的为对照组。利用显微镜和血球计数板对初始藻密度进行记数，接种密度为105-106个/ml。铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa，FACHB 469）购自中科院水生所下属中国淡水藻种库，所用培养基为BG11培养基（其配方见表3），恒温光照培养箱，培养条件为2。
29、81、光照2400lx、光暗比12：12。活化接种2次（每次培养1星期）后调整藻生长周期为对数期，计数，待用。 0077 藻细胞培养25天，培养期间每天轻微摇动2次，且每5天将实验锥形瓶随机交换位置。第1天、第5天、第10天、第15天和第25天对培养的藻细胞进行取样检测。在第11天对赛克灵进行补充，分别加入5mg赛克灵A和赛克灵B至各自的反应体系中。 0078 藻类抑制率的计算： 0079 抑制率%=（Csample-Ccontrol）100/Ccontrol； 0080 其中Csample为实验组藻密度，Ccontrol为对照组藻密度。 0081 实验结果如下： 0082 参见表6，数据表明上述获得的黄酮木质素类旋光异构体赛克灵的抑藻效果与实施例1中的结果相一致。在补充赛克灵后，抑藻作用回升，达到显著的抑 制效果。在不补充赛克灵的情况下，抑制活性有所下降。 0083 表6： 0084 说 明 书CN 102827125 A8/8页10抑制率/% 赛克灵A 赛克灵B1d - -5d 70.7 67.310d 33.4 38.615d 75.1 70.125d 7.2 4.80085 上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。 说 明 书CN 102827125 A10。