从天然产物中获得的高分子量脂族伯醇及其用途 【技术领域】
本发明涉及具有提高纯度的高纯度、高分子量直链脂族伯醇(下文称作脂族醇)的生物活性混合物，它从天然存在源，例如蜂蜡中分离。更具体地说，本发明涉及通过液体提取从皂化和/或未皂化蜂蜡中获得的高纯度、高分子量直链脂族伯醇的混合物，其中混合物中的所得脂族醇包含20～34个碳原子。
背景技术
各种蜡，尤其是蜂蜡一直是人们感兴趣的物质。这不仅是因为它们的工业应用，而且还因为它们的化学组成。蜂蜜中蜂蜡的含量在0.9％～1.13％地范围内，取决于用来从蜂蜜中分离蜂蜡的方法。这种蜡包含酯、烃、游离脂肪酸、游离醇和很多的少量化合物。
从蜂蜡中获得的脂族醇天然混合物已经由几位作者研究出其组成和主要特征。从不同蜡中获得的不同脂族醇混合物也已经被报道。(J.A.Lamberton，et al.，Australian Journal of Chemistry，13：261-268(1959)；A.Hom and J.S.Martic，Journal of Science Food andAgriculture，10：571(1957)；Kreger，(1948)；Wimbero，(1904)；andMitsui and Col，(1942))。这些研究建议了基于用氢氧化钾醇溶液均匀皂化而获得脂族醇的方法。
另一种方法报道了通过高效真空来提取天然脂族醇混合物。用于化学分离混合衍生物和提取残留蜡的高真空蜡蒸馏使用石油醚来完成。为了通过氧化铝色谱来进一步纯化，蒸发溶剂并且酰化残留固体。最后，通过碱水解获得脂族醇，然后在乙醇中重结晶，熔点范围为从62℃到82℃。
几位作者已经表明了直链脂族醇天然混合物的降低血脂作用(F.Liu，et al.，″Active Constituents Lowering Blood-Lipid in Beeswax，″Zhongguo Zhong Yao Zhi，21(9)：553-4，576(1996))；(H.Sho，et al.，″Effects of Okinawa Sugar Cane Wax and Fatty Alcohols on Serum andLiver Lipids in the Rats，″J Nutri Vitaminol，30(6)：553559(1984))；(S.Kato，K.Hamatani，etal.，″Octacosanol Effects Lipid Metabolism in RatFed on a High Fat Diet，″Br J Nutr，73(3)：433-441(1995))；和(Kabiry，etal.，″Tissue Distribution of Octacosanol in Liver and Muscle of RatsAfter Serial Administration，″Ann Nutr Metab，39(5)：279-284(1995))；和(I.Gouni-Berthold，et al.，″Policosanol：Clinical pharmacology andtherapeutic significance of a new lipidlowering agent，″Am Heart J，143：356-365(2002))。许多使用直链脂族醇天然混合物的基于临床研究的调查研究已经出版。
从动物和植物蜡(天然源的蜡)中获得脂族醇天然混合物的程序在现有技术中也是公知的。这种现有技术程序是基于在20℃～100℃用次临界和超临界状态流体提取剂来提取醇混合物的。选择性提取可以使用这种程序来实施，但是当该程序用于蜂蜡时，仅能获得10％到15％的C-20到C-34醇混合物。
另一方案(S.Inaa，K.Furukama，T.Masui，K.Honda，J.Ogasawara，and G.Tsubikamoto，″Process for Recovering Primary Normal AliphaticHigher Alcohols″JP 60-119514(1996))建议了用于蜡的非常相似的提取方法，该方法基于次临界和超临界状态流体(含乙烯的CO2)。
有几种不同的商业食物增补剂、食物和药物旨在降低总血胆固醇(降低脂质、LDL胆固醇和总胆固醇水平)，它们被认为是有效、安全且良好耐药性的，但是大多数产生不同的不利副作用。既然降脂治疗必须是慢性给药的，所以安全且耐药性对于它们的决定性验收是非常重要的。
已经描述了在高脂血病人中经常可以见到使用某些降脂药物的治疗降低了血小板过度凝聚的趋势，并且实验数据已经表明抗凝聚效应是由这些化合物作为中介的。但是，只有某些降低胆固醇的药物表现出这种特性。
动脉粥样硬化是动脉内膜变化的可变组合，它由脂质、复合糖类、血和血液产物、纤维组织和钙沉积的病灶积聚构成，经常也与内侧的变化有关。因此，动脉粥样硬化被认为是一种多因素过程并且包括高脂血症的危险。
在贡献于动脉粥样硬化发展的因素中，血小板凝聚具有非常重要的地位。血小板释放出的颗粒含量活化花生四烯酸，它代谢成环状内过氧化物(endoperoxides)。这些化合物主要转变成血栓烷A2(TXA2)，一种强的血管收缩剂和血小板凝聚剂。血小板凝聚可以由大量化合物引起，例如胶原、ADP和肾上腺素。因此，不同的用来测试公认抗血小板药物的试验性“活体内”、“活体外”或“试管内”模型通常测试它们对由这些试剂诱导的血小板凝聚的影响。这些试验还用于测试在健康志愿者和患有诱导过度凝聚疾病如高胆固醇血症和糖尿病的病人中血小板的凝聚。
胶原诱导血小板凝聚是最经常使用的测试之一。因此，例如静脉注射胶原导致体内不可逆的血管内血小板凝聚，并且血小板的凝聚进入血管的微循环中，随后降低循环血小板的数量并且同时增加血浆丙二醛(MDA)的浓度。另外，在某些情况下注射胶原会诱导由血栓形成产生的死亡。在这些模型中，抗血小板药物通常阻止循环血小板含量的降低和MDA浓度的增加，以及胶原诱导的死亡。
某些表现出血小板抗凝作用的药物能用于治疗血栓形成疾病、心肌梗塞和中风，但是并不是所有的药物都表现出这些优点。另一方面，有一些抗血栓形成药物，例如链激酶和尿激酶主要通过溶解过程影响血液凝固，但不影响血小板凝聚。既然缺血性心血管疾病、中风和血管周边的障碍病状是动脉粥样硬化的主要顺列，所以通常测试几种药物对这些并发症的影响。因此，理论上表现出胆固醇降低特性并且还能通过对这些过程涉及的其它事件起作用而阻止这些并发症的药物肯定对治疗这些病人是有利的。同样地，TXA2水平的降低不仅与抗血小板和抗血栓形成作用相关，而且与抗局部缺血(antischemic)作用相关。抗局部缺血药物的药理学筛选通常包括评价它们对脑诱导全局缺血的影响。因此，不同药物对鼠大脑局部缺血的保护效应已经通过这类对某种非甾族抗炎药(NSAID)的评价被确定，这类药物能抑制环加氧酶催化的反应，并且用于特定的血栓素合成酶和前列腺环素(PGI2)类似物的抑制剂(M.G.Borzeix and J.Cahn，″Effects of NewChemically Metabolically Stable Prostacyclin Analogues on EarlyConsequences of a Transient Cerebral Oligemia inRats，″Prostaglandins，35(5)：653-664(1998))。其它的试验性模型，例如在蒙古沙土鼠试验中诱导的全局缺血也被经常使用。
【发明内容】
本发明的方法和所得组合物最初通过使包含以酯形式存在脂族醇的天然产物接受均相皂化步骤来开始，然后皂化产物被回收、干燥并研磨至粒度100～500微米。可选地，皂化步骤可以被完全跳过，并且未皂化的天然产物可干燥并研磨至粒度100～200微米。
接着，包含脂族醇(皂化或未皂化)的天然产物颗粒被放入常规的固液提取器，引入溶剂与天然产物颗粒接触并加热。热过滤所得溶液除去固体。然后，将提取液冷却到2℃～10℃的温度范围，使脂族醇固化形成悬浮液。过滤悬浮液，回收固体(第一固体)并风干。从这一步骤获得的固体被送入纯化器，在纯化器中它们与第二种热有机溶剂接触并溶解。然后，热过滤该溶液并冷却。冷却时形成的固体(第二固体)被再次收集并真空干燥。第二固体与另一种融解该固体的热有机溶剂接触并溶解。热过滤该溶液，再冷却重新使固体固化。这些第三固体被收集、干燥并粉化，它们是最终产物。
最终产物包含从20到34个碳原子的脂族醇混合物，包括具有下面定量组成的1-二十烷醇、1-二十二烷醇、1-二十四烷醇、1-二十六烷醇、1-二十七烷醇、1-二十八烷醇、1-三十烷醇、1-三十二烷醇和1-三十四烷醇：
1-二十烷醇 C-20 0～5％
1-二十二烷醇 C-22 0～5％
1-二十四烷醇 C-24 12～27％
1-二十六烷醇 C-26 13～28％
1-二十七烷醇 C-27 0～5％
1-二十八烷醇 C-28 15～25％
1-三十烷醇 C-30 25～40％
1-三十二烷醇 C-32 5～15％
1-三十四烷醇 C-34 0～5％。
这些固体可以直接使用或者重新配制给人或动物给药，从而减轻和/或预防高胆固醇血疾病、总胆固醇、LDL胆固醇、冠心病(心脏病发作和中风)、发炎或免疫调节疾病、心血管疾病、和/或神经变性病症。日剂量被建立在每天1～100毫克脂族醇(优选地3～20毫克)，并且可以以任何类型或形态的食物、胶囊、片剂或液体形态摄取。
【附图说明】
附图被结合入本发明并作为本发明的一部分，它们阐明了本发明的优选实施方案并且与说明书一起用来解释本发明的原理。
其中：
图1是描述根据本发明方法的皂化步骤的流程图。
图2是描述根据本发明方法的皂化步骤得到理论产率的反应图。
图3是描述根据本发明方法的提取步骤的流程图。
图4是描述根据本发明方法的第一次纯化步骤的流程图。
图5是描述根据本发明方法的第二次纯化步骤的流程图。
图6表示可选天然产物中总脂族醇含量的范围。
【具体实施方式】
本发明组合物是通过从起始材料皂化(任选)、提取并纯化得到的高纯度、高分子量直链脂族伯醇(下文称作脂族醇)的混合物，起始材料例如但不局限于天然蜡，例如但不局限于蜂蜡、巴西棕榈蜡和小烛树蜡；蜜蜂花粉；油类，例如但不局限于花生油、芝麻油、鳕鱼肝油、米糠油、燕麦油和迷迭香针叶油；以及粉末，例如但不局限于米糠，它们主要包含天然脂族醇与羧酸的酯。对于本发明讨论的其余内容来说，典型地以蜂蜡作为起始材料，但是应当理解成所公开的本发明方法和从中获得的组合物可以使用上述起始材料来实现。
本发明的方法最初通过使蜂蜡接受均相皂化步骤来开始，然后皂化蜂蜡干燥并研磨至粒度100～500微米。或者，不同纯度的未皂化蜂蜡可以被用作起始材料，并且初始干燥且研磨至粒度100～200微米。皂化或未皂化蜂蜡的颗粒被放入常规的固液提取器，而且引入热有机溶剂并与蜂蜡颗粒接触。悬浮液被混合，然后热过滤除去任何固体。
然后，所得提取液被维持在2℃～10℃的温度范围，使脂族醇固化并形成悬浮液。过滤悬浮液，回收第一固体并风干。然后，干燥后所得的干燥固体被送入纯化器，在纯化器中它们与第二种热有机溶剂接触并溶解在其中。然后，冷却该溶液，并且第二固体被收集并真空干燥。从第二次纯化步骤获得的干燥固体与另一种能溶解该固体的热有机溶剂接触。热过滤该溶液并冷却，而且该第三固体被收集、干燥并粉化成最终产物。
从皂化或未皂化蜂蜡中获得的最终产物包含从20到34个碳原子的脂族醇混合物，包括具有下面定量组成的1-二十烷醇、1-二十二烷醇、1-二十四烷醇、1-二十六烷醇、1-二十七烷醇、1-二十八烷醇、1-三十烷醇、1-三十二烷醇和1-三十四烷醇：
1-二十烷醇 C-20 0～5％
1-二十二烷醇 C-22 0～5％
1-二十四烷醇 C-24 12～27％
1-二十六烷醇 C-26 13～28％
1-二十七烷醇 C-27 0～5％
1-二十八烷醇 C-28 15～25％
1-三十烷醇 C-30 25～40％
1-三十二烷醇 C-32 5～15％
1-三十四烷醇 C-34 0～5％。
该产物已经被开发用来降低LDL胆固醇和总胆固醇、增加HDL胆固醇并改善LDL胆固醇/总胆固醇的比例。
已经发现使用蜂蜡作为脂族醇混合物源提供了许多使用甘蔗蜡作为来源所不能获得的利益。例如，许多因素与很难控制的甘蔗蜡纯度水平相关，因此很难获得能满足始终获得均匀纯度产品要求的甘蔗蜡可靠来源。
具体而言，甘蔗蜡的纯度水平受甘蔗种类、植物年龄、甘蔗生长的土壤和气候条件以及用来生长甘蔗的肥料水平及类型的影响。另外，用来从外壳中提取蜡的操作程序类型也影响纯度的水平。当使用蜂蜡作为醇混合物的来源时，这些因素都不是重要的。此外，蜂蜡特性的微小变化可以通过混合就下面进一步描述的参数而言能满足特定标准的选定蜡来校正。
此外，已经发现皂化(任选)、提取和纯化过程中特定操作参数的优选水平能进一步提高分离的脂族醇的纯度水平，并且提高从蜂蜡回收醇的百分数。这些操作参数包括下面的参数：固体的粒度(即皂化蜂蜡的粒度)、碱浓度、固体和液体间的关系(即固体∶液体的比例)、温度范围、流体方式(regimen)、结晶方式、热过滤方式、离心方式和接触时间。在实验室的实验设计下以及中试工厂和工业水平下建立了这些参数的优选水平(在美国专利第6,225,354号中公开)。
本发明中蜂蜡均相皂化方法的程序包括在80℃～100℃的温度下熔化蜂蜡、在40～100rpm的连续搅拌下向其中加入氢氧化钾(10.7M)的水溶液。皂化过程在80rpm的连续搅拌下持续3小时。已经确定每磅蜡需要38克到47克氢氧化钾来完成皂化。本发明中蜂蜡的均相皂化过程增加了脂族醇的理论产率，如图2所示。当蜂蜡被皂化或未被皂化时，产率是唯一受影响的参数。
100～500微米在优选的实施方案中，冷却的皂化蜂蜡被研磨，得到直径的粒度，优选地直径为250微米。研磨的皂化蜂蜡颗粒被放入常规的固液提取器中。热的有机溶剂提取剂被引入提取器中，与其中所含皂化蜂蜡颗粒接触。优选地，用丙酮作为提取剂。但是，适当溶剂的其它实例也可以使用，例如但不局限于戊酮、甲苯、苯、乙醇、庚烷、丙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、己烷、正丁醇、三氯乙烷、丁酮、乙醚、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、环己烷、氯仿以及它们的混合物。蜂蜡颗粒与液体提取剂的比例从1∶4到1∶8，优选地为1∶6。或者，除了加入热的有机溶剂外，水也可以用作提取剂，并且提取参数在下面被进一步讨论。在50℃到60℃的温度范围内，优选地在56℃，提取进行3到7个小时，优选4小时。蜂蜡颗粒优选地在提取期间被搅拌，例如使用旋转搅拌器在与溶剂接触时搅拌颗粒。有利地，搅拌器在40～100rpm，优选地在80rpm下旋转。在提取程序期间，脂族醇在提取剂中增溶因此留下蜡状残留物。在完成提取时，包含溶解于其中的脂族醇的提取剂通过过滤从蜡状残留物分离。
接着，提取液被引入固体脂族醇的室中。有利地，通过在冷却装置中降低提取液的温度来固化这些脂族醇，从而在提取剂中形成固体(即脂族醇在有机溶剂溶液中)。优选地，冷却装置中的温度应该均匀。为了确保其中均匀的温度，可以在容器中提供搅拌器。搅拌器在40～80rpm，优选地在60rpm下旋转。固化期间在2℃～10℃下，优选地在6℃维持温度约18小时。
真空过滤或者离心从冷却装置中获得的悬浮液或混合物，从而回收固体。常规地用冷却的溶剂的洗涤固体。通过在1200～1400rpm下离心混合物或悬浮液约2小时来分离固体和液体。离心期间，颗粒可以用清洁的提取溶剂洗涤，从而除去母液中可能存在的污染材料。
回收并干燥离心步骤获得的清洁固体混合物(第一固体)。可以使用真空干燥。真空干燥步骤期间，可以使用400毫巴的压力和达到50℃的温度。
从真空干燥步骤获得的干燥的第一固体被送到纯化器中，在那里与另一种热的有机溶剂接触，该溶剂优选地是庚烷，庚烷与固体的比例为40∶1。可以使用其它的热有机溶剂，例如但不局限于戊酮、甲苯、乙醇、庚烷、丙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、己烷、环己烷、正丁醇、三氯乙烷、丁酮、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚以及它们的混合物。脂族醇固体被溶解在热的庚烷中形成溶液。在引入冷却装置中固体前，热过滤该溶液。固化步骤中可以使用与从丙酮初始固化中使用的相同类型的冷却装置。通过用搅拌器在40～80rpm，优选地在60rpm下搅拌来使庚烷溶液的温度保持均匀。再固化期间的温度被维持在15℃～25℃，优选地为20℃。再固化步骤在庚烷溶剂中形成了固体混合物或悬浮液。
庚烷中的固体悬浮液或混合物被引入过滤或离心装置中，在该装置中以与从丙酮溶剂中回收固体的相同方式分离固体。在第二次过滤步骤期间，固体可以用清洁的溶剂(冷却的庚烷)洗涤。
然后，回收并干燥从第二次过滤步骤中获得的颗粒(第二固体)。可以使用真空干燥。真空干燥步骤期间，可以使用400毫巴的压力和高达50℃的温度。
从庚烷纯化步骤获得的干燥固体被送到纯化器中，在那里与另一种热的有机溶剂接触，该有机溶剂优选地是丙酮，用量为1份固体40丙酮。可以使用其它的热有机溶剂，例如但不局限于戊酮、甲苯、乙醇、庚烷、丙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、己烷、环己烷、正丁醇、三氯乙烷、丁酮、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚以及它们的混合物。固体被溶解在丙酮中。热的丙酮溶液通过热过滤系统。过滤的丙酮溶液然后被引入冷却装置中再次固化。固化以与从丙酮中初始固化醇相似的条件进行。因此，在这次固化步骤中使用相同类型的冷却装置。通过用搅拌器在40～80rpm，优选地在60rpm下搅拌来使热丙酮溶液的温度保持均匀。再固化期间的温度被维持在2℃～25℃，优选地为6℃。再固化步骤在丙酮溶剂中形成了固体混合物或悬浮液。
丙酮中的固体悬浮液或混合物被引入过滤器中，在其中以与从第一次丙酮溶剂中过滤固体悬浮液或混合物相同的方式来过滤。在第三次过滤步骤期间，晶体可以用清洁的冷却溶剂(丙酮)洗涤。回收并干燥从第三次过滤步骤中获得的颗粒(第三固体)。可以使用真空干燥。真空干燥步骤期间，可以使用400毫巴的压力和高达35℃的温度。
在颗粒被干燥后，它们将被配制成常规的药学制剂来给药，例如片剂、胶囊等。
所得的产率(即相对皂化蜂蜡中的脂族醇重量的醇重量回收百分数)约为40％，纯度典型地从80％～99％。所得天然混合物包含从20到34个碳原子的脂族醇，熔点在61℃到65℃。通过这种方法获得的脂族醇天然混合物可以用气相色谱或HPLC来分析。
在另一个实施方案中，在脂族醇纯化的第一次提取步骤(如前面所述)中用水来代替丙酮。
皂化如前面所述进行。冷却的皂化蜂蜡或者未皂化的蜂蜡被研磨得到直径100～500微米的粒度，优选地直径为250微米。研磨的皂化蜂蜡颗粒被放入常规的固液提取器中。水和消泡剂，例如但不局限于Dow-Coming US1520消泡剂被引入混合物中。蜂蜡颗粒与水的比例从1∶6到1∶12，优选地为1∶10。混合物被在室温下剧烈搅拌3～7小时，优选地4小时，然后用10微米的例如但不局限于聚酯或尼龙的滤布、以及布氏漏斗过滤。蜂蜡颗粒优选地在提取期间被搅拌，例如使用旋转搅拌器在与溶剂接触时搅拌颗粒。有利地，搅拌器在40～100rpm，优选地在80rpm下旋转。在提取程序期间，肥皂(脂肪酸盐)在提取剂中被增溶，留下脂族醇固体。然后干燥回收的(第一)固体。
然后，由此获得的第一固体被按照在第一个实施方案第二步骤中详细讨论的方式处理，其中水提取的固体被溶解在热的有机溶剂中，优选地是庚烷。可以使用其它的热有机溶剂，例如但不局限于戊酮、甲苯、乙醇、庚烷、丙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇、己烷、环己烷、正丁醇、三氯乙烷、丁酮、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、乙醚以及它们的混合物。脂族醇固体被溶解在热的庚烷中形成溶液。可以向该热的溶液中加入硅藻土，例如但不局限于Celite545。除去加热源，剧烈搅拌溶液，直至温度冷却至室温。通过用搅拌器在40～80rpm，优选地在60rpm下搅拌来使热庚烷溶液的温度保持均匀。溶液用布氏漏斗过滤。布氏漏斗中的固体在室温下用新鲜的庚烷漂洗。
然后，将庚烷固体放入带有搅拌棒的烧杯中并用丙酮在大约40℃～65℃，优选地在55℃下提取2小时。用预热的布氏漏斗热过滤该提取液。提取液在约5℃下冷却过夜，收集并干燥固体沉淀物。
整个过程得到良好的产物纯度。使用水作为第一提取溶剂是有效的，能得到纯度64％并具有58％脂族醇回收率的产物。
在另一个实施方案中，皂化蜂蜡与温水的比例为1∶5到1∶10(优选地为1∶5)。混合物被搅拌。搅拌时，以2份乙醇对1份匀浆的比例加入乙醇，接着加入浓硫酸至pH为2.5到1.0。然后，该混合物被冷却到约50℃～60℃，优选地55℃，并且包含脂族醇的上层(凝结层)分离并用冷水处理。任选这些固体可以用乙醇洗涤。然后使用粗过滤器过滤回收并洗涤。
本发明从蜂蜡中获得脂族醇天然产物的程序与其它现有技术的程序相比具有一些优点。
与先前报道的产率低于5％的结果相比，本发明的优点(当使用皂化蜂蜡时)涉及实际生产率(10重量％～15重量％)。本发明程序的另一个优点涉及典型获得的纯度(80％～99％)，该纯度显著高于现有技术方法中的纯度。因此，本发明的方法是简单的并且适于大规模生产。
本发明的组合物具有新的令人惊奇的药学特性，包括抗血小板、抗炎、抗血栓形成和抗局部缺血特性。另外，本发明组合物能用于阻止泡沫细胞发育并治疗高胆固醇血症；它也可以对血管内皮提供保护作用并且能用于阻止早期动脉粥样硬化病变(血栓形成)。
用本发明高纯脂族醇天然混合物配制的药物组合物、食品和食物增补剂可以对人和动物给药。这种从蜂蜡获得的天然混合物当用于减轻和/或预防高胆固醇血疾病、总胆固醇、LDL胆固醇、冠心病(心脏病发作和中风)、发炎或免疫调节疾病、心血管疾病以及神经变性病症时，日剂量建立在每天1～100毫克(优选地3～20毫克)，并且可以以任何类型或形态的食物、胶囊、片剂或液体形式摄取。
考虑下面的实施例时本发明将变得更明显，这些实施例被提出来进一步阐述本发明的原理，而且没有打算以任何方式限制本发明。
实施例1
有机溶剂提取
皂化：
使用水浴在80℃～85℃加热几千克蜂蜡2.5个小时，直至蜂蜡完全融化。一旦蜂蜡完全熔化，在30分钟内逐滴加入1.22L的10.7MKOH水溶液，同时继续搅拌并加热。混合物在搅拌下保持该温度3个小时。3小时后，皂化的蜡被倒入盘中并在60℃～65℃下于真空炉中干燥。然后将7.5千克冷却的干燥皂化蜡研磨成粉末。
提取
皂化的固体被放入含有45升丙酮的72升圆底烧瓶中。将丙酮回流并保持3小时。然后停止加热并且使固体沉降。提取液通过粗棉布倾倒入5加仑的桶中。另外45升新鲜的丙酮被加入圆底烧瓶的固体中并且重复进行提取并倾倒，得到总共3次过滤的提取液。提取液在4℃～8℃冷却40～45小时，并且使用布氏漏斗和Whatman#4滤纸过滤回收固体。2.8千克回收固体被风干48小时。
庚烷纯化
通过保持溶液在55℃～65℃下搅拌2小时将丙酮提取的固体(第一固体)溶解在60升庚烷中。热溶液被倒入5加仑的桶中，桶被密封并冷却到5℃，保持27小时。然后，使用装备50微米单丝尼龙布的布氏漏斗过滤溶液。布氏漏斗中的固体用另外1.5升新鲜庚烷漂洗，并且在真空炉中于45℃和15英寸Hg下干燥固体，得到1.9千克庚烷固体。
丙酮纯化
庚烷固体(第二固体)用36升丙酮在回流下提取2小时。该提取液被热过滤并倒入密封桶中。向固体中加入等体积的新鲜丙酮并且重复提取另外2小时。提取液在约5℃冷却42小时，并且使用Whatman#4滤纸在布氏漏斗上回收固体沉淀。布氏漏斗中的固体用另外1.5升新鲜丙酮漂洗，并且在真空干燥炉中于35℃干燥17小时，得到0.94千克最终产品。
实施例2
单中心(single center)研究
在公开标签的单中心研究中使用上面实施例1中描述的最终产品来评价脂族醇在降低LDL胆固醇、增加HDL胆固醇、降低总胆固醇和改善LDL胆固醇/HDL胆固醇比例方面的有效性和耐药性，结果总结如下，涉及14个受治疗者，每天摄取10毫克脂族醇，持续6周。受治疗者的食物没有控制。所有数据以mg/dL报道。
总胆固醇
表1 受治疗者 T1 T2 ％Chg T3 ％Chg 1 218 243 11％ 229 5％ 2 200 216 8％ 212 6％ 3 170 150 -12％ 157 -8％ 4 207 155 -25％ 171 -17％ 5 256 217 -15％ 221 -14％ 6 206 196 -5％ 170 -17％ 7 314 253 -19％ 268 -15％ 8 176 167 -5％ 171 3％ 9 161 164 2％ 159 -1％ 10 156 167 7％ 173 11％ 11 240 N.T. N/A 220 -8％ 12 212 185 -13％ 184 -13％ 13 260 212 -18％ 224 -14％ 14 231 208 -10％ 241 4％ 平均 215 195 -9％ 200 -7％ p* 0.06 0.36
T1＝基线(在摄取脂族醇前)
T2＝每天10毫克脂族醇，3周
T3＝每天10毫克脂族醇，6周
N.T.＝未试验，N/A＝不可用
*通过Wilcoxon统计分析与基线比较
甘油三酯
表2 受治疗者 T1 T2 ％Chg T3 ％Chg 1 162 143 -12％ 211 30％ 2 64 100 56％ 63 -2％ 3 97 128 32％ 109 12％ 4 428 203 -53％ 300 -30％ 5 198 108 -45％ 213 8％ 6 96 111 16％ 49 -49％ 7 270 238 -12％ 204 -24％ 8 68 74 9％ 67 -1％ 9 69 92 33％ 68 -1 10 82 109 33％ 108 32％ 11 48 N.T. N/A 99 106％ 12 213 220 3％ 196 -8％ 13 125 186 49％ 185 48％ 14 155 119 -23％ 118 -24％ 平均 148 141 -5％ 142 4％ p* 1.00 0.86
T1＝基线(在摄取脂族醇前)
T2＝每天10毫克脂族醇，3周
T3＝每天10毫克脂族醇，6周
N.T.＝未试验，N/A＝不可用
*通过Wilcoxon统计分析与基线比较
HDL胆固醇
表3 受治疗者 T1 T2 ％Chg T3 ％Chg 1 41 42 2％ 40 -2％ 2 48 45 -6％ 60 25％ 3 32 31 -3％ 33 3％ 4 38 41 8％ 49 29％ 5 59 69 17％ 63 7％ 6 50 51 2％ 58 16％ 7 61 54 -11％ 66 8％ 8 49 45 -8％ 54 10％ 9 54 49 -9％ 48 -11％ 10 60 56 -7％ 71 18％ 11 63 N.T. N/A 62 -2％ 12 42 35 -17％ 41 -2％ 13 42 34 -19％ 38 -10％ 14 61 57 -7％ 63 3％ 平均 50 47 -6％ 53 5％ p* 0.11 0.008
T1＝基线(在摄取脂族醇前)
T2＝每天10毫克脂族醇，3周
T3＝每天10毫克脂族醇，6周
N.T.＝未试验，N/A＝不可用
*通过Wilcoxon统计分析与基线比较
LDL胆固醇
表4 受治疗者 T1 T2 ％Chg T3 ％Chg 1 144.6 172.4 19％ 147.0 2％ 2 139.2 151.0 8％ 139.0 0％ 3 118.6 93.0 -22％ 102.0 -14％ 4 N/A 73.4 N/A 62.0 N/A 5 157.4 126.0 -20％ 115 -27％ 6 136.8 122.8 -10％ 100 -27％ 7 199.0 151.4 -24％ 161.0 19％ 8 113.4 107.2 -5％ 104.0 -8％ 9 93.2 96.6 4％ 97 4％ 10 79.6 89.2 12％ 80.0 1％ 11 167.4 N.T. N/A 138.0 -18％ 12 127.4 106.0 -17％ 104.0 -18％ 13 183.0 140.8 -23％ 149.0 -19％ 14 139.0 127.2 -8％ 154.0 11％ 平均 138.0 120.0 -13％ 118.0 -15％ p* 0.11 0.03
T1＝基线(在摄取脂族醇前)
T2＝每天10毫克脂族醇，3周
T3＝每天10毫克脂族醇，6周
N.T.＝未试验，N/A＝不可用
*通过Wilcoxon统计分析与基线比较
心血管疾病危险(CDR)
表5 受治疗者 T1 T2 ％ChgT3 ％Chg 1 5.32 5.79 9％5.73 8％ 2 4.17 4.80 15％3.53 -15％ 3 5.31 4.84 -9％4.76 -10％ 4 5.45 3.78 -31％3.49 -36％ 5 4.34 3.14 -28％3.51 -19％ 6 4.12 3.84 -7％2.93 -29％ 7 5.15 4.69 -9％4.06 -21％ 8 3.59 3.71 3％3.17 -12％ 9 2.98 3.35 12％3.31 11％ 10 2.60 2.98 15％2.44 -6％ 11 3.81 N.T. N/A3.55 -7％ 12 5.05 5.29 5％4.49 -11％ 13 5.92 6.24 5％5.89 -1％ 14 3.79 3.65 -4％3.83 1％ 平均 4.40 4.32 -2％3.91 -11％ p* 0.26 0.01
T1＝基线(在摄取脂族醇前)
T2＝每天10毫克脂族醇，3周
T3＝每天10毫克脂族醇，6周
N.T.＝未试验，N/A＝不可用
*通过Wilcoxon统计分析与基线比较
如上面表中的数据所示，LDL胆固醇降低了15％，这表示统计显著性在97％置信水平。
总胆固醇降低7％是统计不显著的。而3周后的数据表明降低9％并且统计显著性在94％置信水平，6周后的数据不支持这种趋势。最可能的解释是本研究并未控制的饮食原因。
重要地是应注意到在未控制的饮食下并没有不平常地见到在研究期间总胆固醇和LDL胆固醇的增加。这已经在其它脂族醇研究中的空白对照剂(placebo)组中表明，参见M.Canetti，et al.，″A two-yearstudy on the efficacy and tolerability of aliphatic alcohols in patients withtype II hyperlipoproteinemia，″Int J Clin Pharm Res，15(4)：159-165(1995)。
观察到HDLL-胆固醇水平7％的增加、92％置信水平，这并不是出人意料的。先前对人的研究已经表现出HDL水平的增加。
CDR降低11％，99％置信水平。这是由于总胆固醇降低和HDL胆固醇水平增加，并且这是预期的。
甘油三酯没有改善，这也是预期的。大多数使用脂族醇的研究已经表明甘油三酯没有显著降低。
数据看起来是有希望的。先前对来自甘蔗的脂族醇的研究，P.Pons，et al.，″Effects of successive dose increases of aliphatic alcohols onthe lipid profile of patients with type IIhypercholesterolaemia andtolerability totreatment，″Int J Clin Pharm Res，14(1)：27-33(1994)，表明在每天5毫克剂量下8周内总胆固醇降低8％，在16周内前8周每天5毫克，后8周每天10毫克下总胆固醇降低14％。他们还报道从相同的研究中LDL胆固醇降低了11％和22％。这些数据和目前的结果一致，并且如果研究持续时间增加，期望能见到LDL胆固醇和总胆固醇的墕降低。
实施例3
水提取
下面评价用水提取来作为脂族醇纯化(如上面实施例1中公开)的第一次丙酮提取步骤的替代选择。初步实验表明用水提取作为第一步能够提供与通过典型的第一次丙酮提取所获得的相似纯度的产品。该途径通过跟踪固体和过程中脂族醇的回收率并且通过庚烷和丙酮纯化步骤获取第一产物来实行，从而表明该途径获得适当产物的能力。实验和结果描述如下。
皂化
如前面所述进行皂化。
第一次提取
大约100.3克皂化的蜂蜡(31％纯度，31克脂族醇)被放入含有1升水和3滴Dow-Corning US1520消泡剂的2升圆底烧瓶中。混合物被剧烈振荡3分钟，然后使用10微米单丝尼龙滤布和布氏漏斗过滤。另外1升新鲜的水被用来进一步洗涤固体。留下的第一固体被干燥，得到28克纯度64％且回收率为58％的脂族醇。
庚烷纯化：
在搅拌下，通过油浴保持溶液在70℃下1小时而将上面水提取的固体(第一固体)溶解在500毫升庚烷中。向该热的溶液中，加入14克Celite545并且悬浮液在该温度下再搅拌1小时。停止加热并在室温下搅拌溶液过夜。然后，溶液用装备VWR417滤纸的布氏漏斗过滤溶液。布氏漏斗中的第二固体用另外300毫升的新鲜庚烷在室温下漂洗。
丙酮纯化
庚烷固体(第二固体)被放入带搅拌棒的烧杯中并用500毫升丙酮在大约55℃下提取2小时。使用预热的布氏漏斗和10微米聚酯布热过滤该提取液并倒入密封的烧杯中。使用热风器阻止溶液在过滤期间冷却。提取液被在大约5℃下冷冻过夜，然后使用Whatman #4滤纸在布氏漏斗上收集固体沉淀。分析所得终产品固体，纯度为97％。
结论
整个过程得到良好的产物纯度。使用水作为第一提取溶剂是有效的步骤。
实施例4
可选水/提取
包含约5.1克脂族醇的约20.0克皂化蜂蜡与100毫升温水(60℃)混合，直至混合物形成微乳液。在搅拌下加入185毫升95％的乙醇并且混合物被加热到60℃～70℃。接着，加入1.6毫升浓硫酸。继续搅拌并加热，直至溶液沸腾且所有固体消失。混合物被放在一边冷却并探测温度。当温度达到55℃时，上层凝结的脂族醇被分离并放入冷水烧杯中。脂族醇在粗过滤器中收集、并用水和室温的乙醇洗涤。回收大约8.7克脂族醇，脂族醇纯度为46％，回收率约78％。
实施例5
脂族醇提取和蜂蜡纯化的可选溶剂
下面调查用于从蜂蜡中提取脂族醇的可选溶剂。接下来的分离和纯化方法基本上是先前描述的过程。使用微粒化的皂化蜂蜡作为起始材料。八种不同的溶剂用来提取并纯化脂族醇，并且与当前溶剂系统比较。试验的溶剂系统如下：丙酮/庚烷/丙酮、庚烷/丙酮/乙酸乙酯、乙酸乙酯/丙酮/乙酸乙酯、丁酮/己烷/丁酮、异丙醇/庚烷/异丙醇、异丙醇/环己烷/异丙醇、乙醚/己烷/乙醚、乙醇/庚烷/乙醇、以及甲醇/己烷/甲醇。除了乙醚提取外，所有提取用索氏提取器来实施。由于其低沸点和极易挥发性，乙醚提取在室温下进行。确定中间体和终产物中的总脂族醇含量，并且比较产物的纯度(参见表6)。下面使用第一溶剂系统(丙酮/庚烷/丙酮)作为实例来概要描述整个程序。
实验：
用溶剂1(即丙酮)提取：
约35克皂化蜂蜡被加入称皮重的抽提套管(33×118毫米)中。索氏提取器与500毫升的圆底烧瓶组装。向烧瓶中加入约245毫升的溶剂1并且与索氏提取器系统相连。该系统被回流大约4～5小时，并且提取液被快速倒入400毫升烧杯中。提取液在约0℃～4℃下冷冻过夜。然后，冷冻的提取液过滤通过Whatman#1滤纸，并且收集的固体用大约245毫升溶剂1在室温下洗涤。固体被风干(样品A)。
用溶剂2(即庚烷)提取
约12克样品A被称重加入称皮重的抽提套管(25×100毫米)中。然后，向500毫升圆底烧瓶中加入240毫升溶剂2，并且烧瓶与索氏提取器系统相连。液体被回流。溶液被回流大约4～5小时。停止加热并且溶液被快速倒入400毫升烧杯中。提取液在约0℃～4℃下冷冻过夜。然后，冷冻的提取液过滤通过Whatman#1滤纸，并且通过向过滤系统中倒入约84毫升室温溶剂2来洗涤固体。固体被风干(样品B)。
用溶剂3(即丙酮)提取
约5克样品B被称重加入称皮重的抽提套管(25×100毫米)中。然后，向250毫升圆底烧瓶中加入245毫升溶剂3，并且烧瓶与索氏提取器系统相连。系统被回流大约4～5小时。停止加热并且提取液被快速倒入400毫升烧杯中。提取液在约0℃～4℃下冷冻过夜。然后，冷冻的提取液过滤通过Whatman#1滤纸，并且通过向过滤系统中倒入约245毫升室温溶剂3来洗涤固体。固体被风干(样品C)。
脂族醇分析
分析早间体和终产物中的总脂族醇含量和脂族醇回收率。结果总结如下。
各提取液中脂族醇含量的比较
表6
使用不同溶剂系统的脂族醇纯度和回收率 溶剂系统号 脂族醇纯度 (％) 脂族醇回收率 (％) 纯度×回收率 的变化 起始材料 22～32 N/A 1 丙酮 43～55 41～54 10.5 庚烷 69～84 95～100 26.8 丙酮 92～96 92～100 20.6 综合 30.7 2 庚烷 33.1 79.9 4.9 丙酮 87.1 103 55.6 EtOAc 88.2 95.2 1.0 综合 47.9 3 MEK 38.6 84.4 9.8 己烷 62.7 97.9 23.6 MEK 77.6 97.7 14.6 综合 40.8 4 IPA 33.5 82.8 6.8 庚烷 46.1 89.6 11.3 IPA 50.5 96.2 4.2 综合 16.8 5 EtOAc 56.3 92.5 27.1 庚烷 86.0 93.6 27.8 EtOAc 87.2 82.3 1.0 综合 42.9 6 IPA 34.0 97.5 6.8 环己烷 72.5 60.5 23.3 IPA 72.5 91.3 0 综合 24.5 7 Et2O 33.2 88.7 5.5 己烷 92.0 40.4 23.8 Et2O N/D N/D 综合 23.3 8 EtOH 40.2 102 13.5 庚烷 45.4 79.5 4.1 EtOH 53.7 88.6 7.4 综合 19.2 9 MeOH 32.8 27.2 1.6 己烷 50.1 97.5 16.9 MeOH 46.7 40.9 0 综合 2.1
讨论
起始材料(皂化蜂蜡)用GC分析并表现出27.9％的脂族醇含量。该材料按上面描述由索氏提取器处理。脂族醇的纯度取决于提取溶剂有很大的变化。除了甲醇溶剂系统外，所有产物的组成比与起始材料相似。
在第一次溶剂提取中，乙酸乙酯得到最高的纯度(56％)，其它所有溶剂得到33％以上纯度的提取液。乙醇提取得到具有40％纯度的最好回收率(～100％)。丙酮作为第一提取溶剂(在当前过程中)表现出不好的回收率(41～45％)并且是所测试溶剂系统的最差回收率之一，但是纯度是第二最好的。因为提取装置中的堵塞问题，使用庚烷或乙酸乙酯的第一次索氏提取器提取是困难的。乙醚提取在室温搅拌下进行。乙醚溶液的过滤也是非常困难的，因为提取液形成微乳液，所以。第一次提取的过滤困难可以排列如下(最困难到最不困难)：乙醚＞甲醇＞乙醇＞庚烷＞异丙醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞丁酮。基于纯度×回收率的变化，所有第一次溶剂处理的成功可以排列如下：乙酸乙酯＞乙醇＞丁酮＞异丙醇＞乙醚＞庚烷＞丙酮＞甲醇(如表6中所列)。
在第二次溶剂提取中，使用庚烷来提取乙醚第一次提取液，脂族醇的纯度增加到高达92％。庚烷/丙酮和乙酸乙酯/庚烷溶剂系统能够实现高于86％的纯度。丙酮/庚烷、异丙醇/环己烷和丁酮/己烷在77％到63％纯度之间。在其它溶剂系统中，例如甲醇/己烷、异丙醇/庚烷和乙醇/庚烷都低于50％的纯度。对于下面的溶剂系统的第二次提取脂族醇回收率在90％以上：庚烷/丙酮、丁酮/丙酮、/丙酮庚烷和甲醇/己烷。即使从丁酮/丙酮提取中得到的纯度是最高92％，但是其回收率为40％，不可接受。因为更多的不纯物已经被除去，所有第二次溶剂材料的提取和过滤比第一次步骤更流畅地进行。庚烷和己烷作为第二次提取溶剂在提取和过滤中比他们作为第一次提取溶剂时表现出更少的困难。
在第三次溶剂提取中，丙酮/庚烷/丙酮溶剂系统的脂族醇纯度达到90％以上，庚烷/丙酮/乙酸乙酯和乙酸乙酯/庚烷/乙酸乙酯溶剂系统达到80％以上。甲醇/己烷/甲醇溶剂系统的第三次溶剂提取仅表现出约40％的回收率。除了甲醇和乙醇外，所有最后的提取、过滤和干燥都容易控制。甲醇中的溶解性太高，以至于在过滤期间有大量的损失，并且该提取物也很难干燥。在最后的甲醇提取中只有约40％的脂族醇固体被回收。
在九种溶剂系统中，庚烷/丙酮/乙酸乙酯、丁酮/己烷/丁酮和乙酸乙酯/庚烷/乙酸乙酯得到比当前溶剂系统(丙酮/庚烷/丙酮)更好的结果。应当提及在用这三种溶剂系统处理期间有一些问题。在使用庚烷或乙酸乙酯作为第一提取溶剂中，提取也有困难。索氏提取器经常被堵塞并不容易溶解。庚烷提取液的过滤比使用庚烷作为第二溶剂提取(当前产生方法)时甚至更困难。乙酸乙酯提取液的过滤比庚烷提取液更快。即使丁酮/己烷/丁酮溶剂系统没有实现80％的纯度目标(它是78％)，但它表现出所有处理步骤中的最好行为。提取、过滤和干燥步骤都容易进行。
具有最好综合表现的终产品是使用丁酮和乙酸乙酯作为第三溶剂的情况。这能够应用于当前过程，以至于最终研磨步骤能够被限制。
实施例6
脂族醇的可选天然源
A.可选蜡样品的制备
对于蜡样品(例如小烛树蜡或巴西棕榈蜡)，每种都精确地称重(20克)，加入80毫升烧杯中并放入95℃的油浴中。向熔化的蜡中缓慢加入3.5毫升的10.7M KOH。样品在搅拌下皂化3小时，并且在室温下风干18小时以上。干燥的皂化蜡被使用咖啡磨研磨成小颗粒。准确称重18克样品并转入25×100毫米抽提套管中，然后用126毫升丙酮在索氏提取器中提取5小时。
B.可选油样品的制备
对于油样品(例如花生油、芝麻油、挪威鳕鱼肝油、燕麦油和米糠油)，每种都精确地称重(20克)，加入80毫升烧杯中并放入95℃的油浴中。搅拌下缓慢加入3.5毫升的10.7M KOH。样品在室温下保持3小时。油状皂化材料被皂化过夜并在0℃冷冻约5小时。20克样品被快速称重加入25×100毫米抽提套管中，并用200毫升丙酮在索氏提取器中提取5小时。
C.可选粉末样品的制备
对于粉末样品(例如米糠或蜜蜂花粉)，精确称重22克每种样品，加入100毫升烧杯中并放入95℃的油浴中。搅拌下缓慢加入3.9毫升的10.7M KOH和45毫升去离子水。样品被加热3小时并且风干约18小时。皂化的蜡被使用咖啡磨研磨成小颗粒。20克样品被转入25×100毫米的抽提套管中，并且用250毫升丙酮在索氏提取器中提取5小时。
D.可选针叶样品的制备
称重30克迷迭香针叶，加入48×123毫米抽提套管中。向500毫升圆底烧瓶中加入庚烷(300毫升)并且在索氏提取系统中提取5小时。庚烷提取液用旋转蒸发仪在50℃蒸发干燥。固体在95℃的油浴中加热并且加入15毫升去离子水，制备浆料。通过缓慢加入0.4毫升的10.7M KOH并且在该温度下保持3小时来进行皂化。所得皂化的固体被冷冻约18小时并且使用咖啡磨研磨成小颗粒。2克样品转入25×100毫米的抽提套管中，并且用100毫升丙酮在索氏提取器中提取5小时。
所有最终的丙酮提取物被在不超过50℃下单独蒸发至干。基于每种丙酮提取物中总脂族醇含量计算起始材料中脂族醇的百分数。所有上述处理材料的脂族醇含量范围列于表6中。每种脂族醇百分数的气相色谱分析列于下面的表7中。来自蜂蜡的脂族醇数据是来自当前的GMP过程。在蜂蜡发现的最多脂族醇高达30％的脂族醇。巴西棕榈蜡包含约17％、小烛树蜡约为5％、迷迭香约3％并且米糠油约2％脂族醇。
表7
脂族醇可选来源米源 脂族醇 脂族醇 每种脂族醇百分数起始材料 丙酮提 取物中 ％ 起始 材料中 ％ C-20 C-22 C-24 C-26 C-27 C-28 C-30 C-32 C-34蜜蜂花粉 2.5 0.12 8 19 13 11 3 0 27 8 0米糠粉 0.8 0.17 3 2 3 2 2 11 68 8 0迷迭香 47.9 2.6 0 0 0 7 2 68 16 8 0巴西棕榈蜡 49.2 16.9 0 0 3 0 0 5 16 77 0小烛树蜡 8.5 5.3 0 0 0 5 13 16 42 24 0天然燕麦油 1.0 0.95 36 0 0 0 0 0 54 0 0米糠油 2.0 1.86 5 14 8 5 7 14 27 18 0花生油 0.2 0.06 0 0 0 0 0 0 100 0 0芝麻油 0.3 0.15 0 0 0 0 0 0 100 0 0巴西棕榈蜡粉 21.1 5.6 0 0 0 0 0 50 21 74 0鳕鱼肝油 0.2 0.14 0 0 0 0 0 100 0 0 0皂化蜂蜡(当前方法) 51.0 30.6 0 0 18 17 0 19 31 15 0
实施例7
使用色谱纯化脂族醇
调查使用二氧化硅柱来纯化皂化蜂蜡中脂族醇的可行性。因为直接向柱上应用庚烷固体会使之立即堵塞，所以过去的实验都失败了。但是，已经发现将材料包覆到硅藻土上，然后再将组合物应用到柱上会使堵塞最小化。
实验A：
提取：
大约131克皂化蜂蜡被放入带有1升水和3滴Dow-Corning US1520消泡剂的1加仑瓶中。混合物被剧烈振荡3分钟，然后使用10微米单丝尼龙布和布氏漏斗过滤。另外1升新鲜的水被加入布氏漏斗中的固体上，用来进一步洗涤固体。收集的固体被风干(39.8克，纯度约30％)48小时。
柱纯化
在搅拌下，通过油浴在70℃下保持溶液1小时而将水不溶性的固体溶解在200毫升庚烷中。向该热的溶液中，加入20克Celite 545并且在该温度下再搅拌1小时。溶液被混合并冷却到室温，并且使用布氏漏斗过滤。
固体(54.01克)被干燥并且用咖啡磨研磨。制备柱子(5厘米直径，100克Mallinkrodt Silicar 6512)并且向其中加入研磨的固体。柱子用庚烷、25％丙酮/庚烷、丙酮和甲醇洗脱。所有部分被在5℃的冰箱中冷冻过夜，然后使用布氏漏斗和VWR 417滤纸过滤。所得固体被风干并分析。结果总结如下。
表8 体积(升) 洗脱溶剂 纯度(％) 固体(克) 脂族醇(克) 起始材料 31 131 40.7 0.5 100％庚烷 N/A 0 0 1 25％丙酮/庚烷 96 2.44 2.34 1 25％丙酮/庚烷 93 2.87 2.67 1 100％丙酮 83 0.49 0.40 1 100％丙酮 N/A 0 0 1 100％甲醇 4 0.61 0.02
结论
这种方法提供了良好纯度的产物。脂族醇回收率为46％。进一步工作能从这种过程中改善回收率。
使用第二个柱子。该柱子通过整个将皂化蜂蜡混入二氧化硅中，然后装载入二氧化硅柱中并真空洗脱来操作。该柱工作良好并且表现出很少堵塞。
实验B
使用底部带有烧结玻璃料的2.5厘米直径的柱子。约18.6克皂化蜡(22％脂族醇)被放入带有34.5克二氧化硅凝胶和200毫升1∶1四氢呋喃/庚烷的1升圆底烧瓶中。该浆料被旋转蒸发至干，然后固体在咖啡磨中被研磨成粉。这种材料被放入柱中。使用真空泵来抽吸溶剂通过柱子，结果如下。以下面的方式洗脱。
表9 体积(升) 洗脱溶剂 纯度(％) 固体(克) 脂族醇(克) 0.3 100％庚烷 20 2.086 0.44 0.1 100％庚烷 100 0.162 0.16 0.15 50％庚烷/丙酮 65 0.901 0.60 0.15 50％庚烷/丙酮 66 0.461 0.30 0.25 50％庚烷/丙酮 66 0.480 0.32 0.6 50％庚烷/丙酮 65 1.272 0.83 0.15 100％丙酮 56 0.121 0.07
结果
合并二种过柱后部分得到纯度约为65％、回收率为56％的脂族醇。柱子在丙酮洗脱期间堵塞，所以不能进行进一步的回收。
实施例7
剂量单位的溶出
麦芽糖糊精(75.1克)、硬脂酸钙(2.3克)和脂族醇(95％纯度，4.52克)被完全混合在一起并且所得粉末被用来填充#0硬胶囊。平均胶囊填充重量为192毫克并且每个胶囊包含10毫克脂族醇。这些胶囊的溶解在500毫升0.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SLS)中在37℃使用USP搅拌桨(装置2)以100rpm来测量。使用装有30微米过滤器的套管在60和120分钟后从溶解容器中移去样品。
溶解样品用ELSD检测通过HPLC来分析。HPLC分析使用4.6×150毫米Luna(2)C-8柱，以每分钟1.5毫升流动甲醇。标准曲线通过注入相当于20、10、5、4和2ug/mL的纯脂族醇标准在溶解介质中的溶液来产生。
在样品的色谱中仅观察到痕量的脂族醇。溶解的脂族醇总量相应于在剂量单位中0.5～0.7毫克或5～7％的量。
用多晶纤维素代替麦芽糖糊精来制备第二种干混合胶囊制剂。这些胶囊的溶解使用上述的条件并且也是不好的(低于10％)。
在第三种变化中，通过放入10克在带有5个不锈钢球(直径0.8厘米)的125毫升塑料瓶中并且将瓶放在振荡器上24小时来将脂族醇微粉化。微粉化的脂族醇与麦芽糖糊精和硬脂酸镁一起配制，以至于每个胶囊包含10毫克脂族醇、259毫克麦芽糖糊精和11毫克硬脂酸镁。使用上述条件的这些胶囊的溶解并不好于未微粉化的脂族醇观测到的结果(＜10％)。
实施例8
剂量单位的溶出
模拟的湿颗粒化配方如下：27.5毫克脂族醇(85％纯度)被放入含有4毫升丙酮的小容器中，为了溶解脂族醇，丙酮被加热至沸腾，并且为了用脂族醇薄膜包覆麦芽糖糊精，加入759毫克麦芽糖糊精并与丙酮溶液混合。在糊状物被冷却至室温后，丙酮被在真空下除去。脂族醇在400毫克这种样品中的溶解通过与500毫升溶解介质在37℃下搅拌1小时来确定。带有ELSD检测的HPLC分析表明11.9毫克的脂族醇中7.6毫克包含在溶解1小时后的样品中(64％)。
实施例9
剂量单位的溶出
模拟的明胶软胶囊配方如下：31.6毫克脂族醇(85％纯度)、996毫克低芥酸菜籽油(canola oil)和74毫克大豆卵磷脂被一起混合并加热至约60℃，因此脂族醇被溶解在植物油中。在除去某些溶解的卵磷脂后，混合物被冷却到室温，它凝结形成均匀的悬浮液。大约912毫克含有10毫克脂族醇的混合物接受模拟溶解试验，使用搅拌棒和500毫升溶解介质在约37℃下进行。数据表明大约100％的脂族醇溶解在这种配方中。
第二次实验使用由脂族醇(61.2毫克，85％纯度)、低芥酸菜籽油(1713毫克)和卵磷脂(108毫克)组成的配方，并且相似于前面的实验来制备。包含15毫克脂族醇的凝胶部分被放入#0明胶硬胶囊中并且使用实施例1中描述的条件测试脂族醇溶解。带有ELSD检测的HPLC分析表明溶解1小时后15毫克中的10毫克包含在剂量单位中(67％)。
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