预防性和治疗性治疗链球菌感染的方法 发明背景
1、发明领域
本发明涉及含有C组链球菌噬菌体相关性细胞溶素酶和载体的组合物，其中所述载体用于把该C组链球菌噬菌体相关性细胞溶素酶释放至哺乳动物的口、喉或鼻腔。所述组合物特别适用于预防性和治疗性治疗链球菌感染包括通常称之为链球菌咽喉炎的感染。
2、现有技术描述
已知对于无症状个体或者患有轻度喉咙痛、扁桃腺炎或脓疱病的带症状个体来说，A组链球菌已经显示为能够以载体状态存在的重要病原体。如果不予以治疗，这些链球菌感染能够导致肾小球性肾炎、风湿热和可能永久性的风湿性心脏病。随着抗生素特别是青霉素类抗生素的问世，按照合适的抗生素治疗处方方案，病原生物容易得到消除。
由于被感染的个体(通常为儿童和年轻人)能够把A组链球菌传递给其他人，特别是在托儿所和学校，因此必须在抗微生物治疗开始后至少24-72小时把已知的被感染个体从这些环境中分离开。在对照研究中表明：早期诊断和合适的治疗能够使令人讨厌的病原体的总循环传染降低，并且能够降低或减少A类感染的后遗症(关节热或肾炎)。
美国专利US 5,604,109(Fischetti等)教导：通过应用C组链球菌噬菌体相关性细胞溶素酶进行诊断分析，能够对A组链球菌抗原进行快速和灵敏检测。这种检测能够有助于迅速鉴定被感染个体，然后使被感染个体接受常规抗生素治疗。
然而，还存在一个问题就是是否能有效抵抗链球菌感染。患有链球菌咽炎的患者具有高度传染性，并且能够把病原体传递至密切接触者，从而导致脓毒性咽喉炎流行。这个问题在人群密度较大的人与人密切接触的学校和军队显得尤为突出。而且，需要防止链球菌感染地预防方法，这是因为由于多方面原因，通常的抗生素预防应用是不合适的。
发明概述
本发明(其引用美国专利US 5,604,109中的内容作为参考)提供含有C组链球菌噬菌体相关性细胞溶素酶和载体的组合物，所述载体用于把该C组链球菌嗜菌体相关性细胞溶素酶释放至动物例如人的口、喉或鼻腔。这样的组合物特别能够用作：预防性治疗以防止在接触已感染个体后被感染，或者对已经被感染的患者进行链球菌A喉感染的治疗性治疗，从而减轻感染。
由于口腔或鼻腔中存在细胞溶素，因此当链球菌从被感染个体引入时，至少有一些侵入的链球菌被杀死，因此通过防止感染达到预防效果。通过降低感染以及促进减少链球菌传播至其它个体的方式，细胞溶素酶这种快速和特异性(致死性)抗已有链球菌感染的活性具有治疗效果。
在本发明的一个方案中，细胞溶素酶的给药形式为：糖果、口香糖、锭剂、糖锭、片剂、粉末、气雾剂、液体(例如含漱剂)或液体喷雾剂。在本发明另一个实施方案中，细胞溶素酶以鼻喷雾剂给药。
治疗链球菌A感染的方法包括：把有效剂量的可药用量C组链球菌嗜菌体相关性细胞溶素酶施用于需要治疗的哺乳动物的口腔或鼻腔，让细胞溶素酶接触口腔粘膜并停留必要的一段时间从而使其饱和口腔粘膜；然后以同样的方式施用另外剂量的这种细胞溶素酶直至治疗完成时为止。根据含有细胞溶素酶的载体的不同，所述酶可以被给药至喉或鼻的粘膜壁(mucosal lining)。
除了能够有效地抵抗A组链球菌感染外，所述组合物还能以类似方式用于抵抗C组链球菌感染。并且，所述酶还能以类似方式抵抗E组链球菌。
发明详述
据发现当链球菌从被感染个体侵入时，细胞溶素在口腔中停留一段时间能够杀死侵入的链球菌，从而预防感染并提供预防性治疗以防止链球菌感染。在被感染的个体中，通过降低感染以及减少链球菌传播至其它个体的方式，细胞溶素酶这种快速和特异性(致死性)抗链球菌感染的活性还产生治疗效果。
被特定的噬菌体(称C1)感染后，C组链球菌生物体产生酰胺酶muralytic(细胞溶素)酶，将其分离并收集，这些方法记载于第5,604,109号美国专利中。或者，通过任意其它已知方法，也可以分离和收集这种C组链球菌酶(也称为细胞溶素酶)，这种酶对A、C和E组链球菌的细胞壁具有独特的特异性。
用于预防性和治疗性治疗链球菌感染的组合物含有：细胞溶素酶和应用工具(例如载体系统或口服给药模式)以释放于口腔或鼻腔粘膜壁。
当把这种酶加入到载体系统或口腔给药模式中期间或之前，优选把该酶置于稳定的缓冲环境中用于维持pH范围在约4.0-约8.0、更优选约5.5至约7.5和最优选约6.1。
所述稳定的缓冲剂应该使细胞溶素酶显示最佳活性。该缓冲剂可以是还原剂例如二硫苏糖醇。所述稳定的缓冲剂还可以含有或可以是金属螯合剂例如乙二胺四乙酸二钠盐，或者其也可含有磷酸盐或柠檬酸盐酸磷酸盐缓冲剂。
为了防止变质，所述稳定的缓冲剂还可含有抗菌剂或抑菌剂作为防腐剂，例如其可含有少量苯甲酸钠。
应用方式包括但不限于直接、间接、载体和特殊方式或者任意方式的组合。把细胞溶素酶直接应用至鼻粘膜可以通过的方式为鼻喷雾剂、滴鼻剂、鼻软膏、洗鼻剂、鼻注射液、鼻填充物或者通过把软膏直接施用于鼻孔、鼻桥或面部或者上述方式的任意组合，或者通过类似的应用方法或其它已知的鼻载体施用。施用于口腔或喉部可以通过的方式为应用喉锭剂或通过应用漱口剂、含漱剂、溶液剂、喷雾剂、糖果和胶等。因此，可以施用细胞溶素的形式包括但不限于锭剂、糖锭、糖果、注射剂、口香糖剂、片剂、粉剂、喷雾剂、液体制剂、软膏和气雾剂。
加有细胞溶素酶的锭剂、片剂或胶可以含有糖、玉米浆、各种染料、非糖甜味剂、矫味剂、任意的粘合剂或这些物质的组合。类似地，任意胶基产品可以含有阿拉伯胶、巴西棕榈蜡、柠檬酸、玉米淀粉、食品着色剂、矫味剂、非糖甜味剂、明胶、葡萄糖、甘油、胶基、紫胶、糖精钠、糖、水、白蜡、纤维素、其它粘合剂以及上述物质的组合。
锭剂还可以含有糖、玉米淀粉、阿拉伯胶、黄蓍胶、茴香脑、亚麻籽、含油树脂、矿物油和纤维素、其它粘合剂以及这些物质的组合。在本发明另一实施方案中，应用糖取代物替换葡萄糖、蔗糖或其它糖。
还可以把该酶置于鼻喷雾剂中，其中鼻喷雾剂为载体。所述鼻喷雾剂可以是长期作用的喷雾剂或暂时释放的喷雾剂，并且可以通过本领域公知的方式制备。
所有这些用于细胞溶素酶的载体均可以通过常规方式制备，但优选任何漱口剂或类似产品不含有乙醇以防止酶变性。类似地，在制备过程期间，当把细胞溶素酶置于止咳糖、胶、糖果或锭剂中时，应该在锭剂或糖果硬化之前但在止咳糖或糖果稍微冷却后将细胞溶素酶放置好，这样可以避免酶变性。
可以把所述酶加入到这些液体形式或冻干状态的物质中，因此所述酶遇到液体时会被溶解。所述酶也可以是例如微胶粒或脂质体形式，或者其它被包封形式，或者以前药形式或缓释形式给药以便提供延长的储存期和/或释放效果。
治疗感染的细胞溶素酶的有效剂量或含量将部分取决于以下因素：该细胞溶素酶是用于预防还是治疗、用药者接触链球菌的持续时间、和/或感染的性质、个体体积和重量等。合适剂量的确定容易由本领域技术人员确定。含有该酶的组合物的应用持续时间也取决于以下因素：所述应用是否用于预防目的，用于预防目的时所述应用可以是例如每天或每周，持续确定的时间例如1周、1月或更长；或者所述应用是否用于治疗目的，当用于治疗目的时，可能应用更加强的方案例如应用2、3、4、5、6、7、10或14天或更长。因此，治疗性治疗可能横跨数天或数周，可以以天为基础，并可能在一天期间有多个间隔。
为了达到效果，所述酶应该以足够量存在以提供有效数目的酶单位来接触口、喉或鼻腔。如果接触口、喉或鼻腔的酶单位太少，即使是长时间接触也不会产生需要的有益效果。因此，所有应用的剂型应该在一段时间内提供大约最少量的数量单位，这样所述剂型将把酶提供至口、喉、或鼻腔。在鼻腔或口腔环境中，被认为提供有效含量或剂量活性单位酶浓度的范围是约100单位至约100,000单位。据信，从约100单位至约10,000单位的较宽范围是可以接受的。这样的单位可以存在于小体积载体中例如1ml或更小体积的载体例如液体或唾液中(例如锭剂)，或者也可以存在于大体积例如若干毫升含漱剂中。因此，通常载体的体积越大，达到活性酶有效浓度所需的单位总数越大。因此，在鼻或口腔中，可接受浓度可以是约100单位/毫升至约100,000单位/毫升流体中。在此范围内，约100单位/毫升至约10,000单位/毫升的浓度是可以接受的。
因此，在实践中，接触活性酶单位的时间可以影响活性酶单位在每毫升剂量中所需要的浓度。例如，被考虑提供缓释的载体(某些鼻喷雾剂、锭剂和被包封酶)能够提供每毫升较低浓度的活性酶单位，但持续时间较长。相反，较短的持续治疗(例如含漱剂)能够提供每毫升较高浓度的活性酶单位。所有在感染部位提供有效浓度活性酶或提供足够预防效果的含有足够细胞溶素酶的任何剂量完全属于常规实验范围之内，因此完全在本发明范围之内。
本发明的组合物还可含有至少一个其它添加剂，所述添加剂能有效地用于治疗性或预防性治疗链球菌感染或者减轻其症状。另外，这些试剂还可以有效地用于某些其它治疗和/或起预防作用，例如减轻疼痛。一些试剂可以是局部活性或全身活性，并可含有抗生素或疼痛减轻药物包括例如局部用抗菌剂用于减轻咽喉痛。或者，可以在应用本发明组合物处理之前或之后给予这样的试剂。抗生素的剂量应该能有效地用于治疗性或预防性治疗链球菌感染或用于治疗这些感染的症状。
当这些治疗用于任意的动物或哺乳动物时，优选把这些产品应用于人。
让含有各个剂量细胞溶素的载体接触口腔粘膜必要的时间以便提供期望的预防或治疗效果。把细胞溶素酶给药至口腔粘膜的方式可以为任意方式，例如：含漱剂、口腔清洗剂(mouth rinses)、锭剂、糖锭、口香糖、糖果、粉剂、和鼻或口腔喷雾剂，条件是其安全并其能提供期望的预防或治疗效果。根据本发明，本领域技术人员可以知道用于给药细胞溶素酶的其它可能方法和组合物。
实施例1
C组嗜菌体细胞溶素酶制备如下：在18mm试管中，在37℃下的ToddHewitt培养基中把C组链球菌株26RP66(ATCC#21597)或任意的C组链球菌株培养至其在650nm处的OD为0.23。以1份嗜菌体比4份细胞的比例把C组噬菌体(C1)(ATCC#21597-B1)以5×106的效价加入。然后让该混合物在37℃温度下维持18分钟，期间把感染细胞倾入到冰块上以把溶液的温度降低至15℃以下。然后在冷冻离心机中收集被感染细胞，将其以原始体积的1/300悬浮于0.1M的磷酸缓冲液中，所述缓冲液的pH为6.1，并含有5×10-3M的二硫苏糖醇和10μg DNA酶。这些细胞将溶解释放出嗜菌体和细胞溶素酶。以100,000Xg离心5小时以除去大部分细胞碎片和嗜菌体，把酶溶液分成等份试样，然后测试其溶解A组链球菌的能力。
测定许多酶的单位/毫升数目使其成为酶的最高稀释的倒数，从而在15分钟内把A组链球菌的悬浮液的OD650从0.3降低至0.15。在典型的酶制剂中，在单个12升批量中生成4×105至4×106单位。
根据所需要的培养时间，酶的应用需要最少量的细胞溶素酶单位。用含有稳定缓冲物质的合适调节剂稀释酶，所述调节剂能使酶稳定并发挥最大酶活性。优选的方案为应用冷冻干燥的细胞溶素酶。所述稳定缓冲物质可以含有还原剂，该还原剂可以是二硫苏糖醇，浓度为0.001M-1.0M，优选0.005M。所述稳定的缓冲物质可以含有金属螯合剂，其可以是0.00001M至1.0M、优选0.005M浓度的乙二胺四乙酸二钠盐。该稳定缓冲物质可以含有柠檬酸磷酸盐缓冲剂，浓度为0.001 M-1.0M，优选0.05M。所述稳定的缓冲剂的pH值范围是约4.0-8.0、优选6.1。稳定的缓冲物质可以含有作为防腐剂的杀菌剂或抗菌剂。这样的防腐剂可以是叠氮化钠，其浓度为0.001％至0.1％，优选0.02％。
用于产生细胞溶素的嗜菌体原料的制备可以按照上述在细胞溶素酶制备中用于感染嗜菌体和C组链球菌的相同方法进行。然而，此制备方法并不把被感染细胞倾入到冰上，在37℃温度下培养的时间共持续1小时，以使嗜菌体和酶在总体积中溶解和释放。为了把嗜菌体用于随后的细胞溶素生成，必须灭活残余酶，或者将这些酶除去以防止从没有C组噬菌体的细胞而不是嗜菌体感染的细胞中溶解。
实施例2
按照实施例1制备的酶稀释至浓度为100单位/毫升的缓冲液中，所述缓冲液的组成为：0.05M柠檬酸盐磷酸盐缓冲液(其pH为6.1并含有0.1％的兔免疫球蛋白、0.005M(亚乙基二硝基)四乙酸二钠盐(EDTA)、0.005M二硫苏糖醇、0.02％叠氮化钠、0.01％N-乙酰基葡糖胺。把用A组链球菌抗体标记的胶体金溶胶(OD5201.5)悬浮于0.02M Tris缓冲液(其pH为8.2，含有1.0％牛血清白蛋白、0.02％叠氮化钠、300K单位肝素)中，将1份此悬浮液加入到3份酶试剂中，混合，并通过0.22微米滤器过滤，每试管中含有200微升等份样品，进行冷冻干燥。该冷冻干燥的酶在升高的温度下(即45℃)能稳定短时间(2周)，在室温下能长期(大于1年)保持稳定。
实施例3方法
1.把A组链球菌株S43/192/39R(抗链霉素型)培养1天(从冷冻血肉汤中)；将500μl置于50ml含有1％酵母提取物和100pl链霉素/ml的Todd Hewitt(TH)肉汤中。
2.培养至OD650为0.59。
3.在3000rpm下离心15分钟以沉淀细菌。
4.把这些生物体重新悬浮于1ml体积TH w/o抗生素(3×105/100μl，由平板计数确定)。
5.把0.5这些浓度的细胞加入到1.5ml pH6.1的磷酸缓冲液中作为对照。
6.在给药至小鼠前5分钟，把0.5ml浓缩的细胞悬浮液与0.5ml嗜菌体细胞溶素在pH6.1磷酸缓冲液中的溶液混合，其中所述嗜菌体细胞溶素溶液被预先稀释至10,000单位/毫升。
把5只接受60μl“对照”溶液的小鼠分开，等量口腔用药和鼻腔用药。
把5只接受60μl细胞溶素和细菌混合物的小鼠分开，等量口腔用药和鼻腔用药。在5％绵羊血、蛋白胨琼脂培养皿上进行喉擦洗，所述培养皿含有500μg/ml链霉素。在37℃温度下培养表面皿过夜。得到下列结果：
7/22 7/23 7/24 7/28
1天 2天 3天 7天
菌落形成单位细胞溶素L1 0 0 0 0L2 0 0 0 0L3 0 0 0 0L4 0 1 0 0L5 0 0 1 0对照C1 26 14 7 0C2 ＞400 17 100 83C3 9 0 15 0C4 ＞400 ＞400 ＞400 220C5 2 2 30 0
这些结果显示：在此模型系统中，嗜菌体细胞溶素与A组链球菌仅仅接触5分钟就能防止所述链球菌集居于小鼠上呼吸道。
实施例4
为了复制可能发生的情况，在链球菌进入环境、动物、细菌前把细胞溶素置于口腔(即通过锭剂释放)，然后按照实施例3(1-5)同样的方式制备细胞溶素，但在本实验中，动物作如下处理：
细胞溶素组：让5只小鼠接受25μl细胞溶素，然后立即让其接受50μl细菌悬浮液。
对照组：让5只小鼠接受25μl缓冲液，然后立即让其接受50μl细菌悬浮液。
24小时细胞溶素
L6 -
L7 -
L8 -
L9 -
L10 -对照组
C6 -
C7 +
C8 -
C9 +
C10 +
结果：当加入链球菌时，对于口腔中含有细胞溶素的动物有0/5的比例被菌集，而对于接受缓冲液的动物有3/5的比例被菌集链球菌。因此，如果在加入A组链球菌之前存在细胞溶素可以防止菌集。
实施例5
在37℃下，在Todd Hewitt培养基中培养AM组6型链球菌过夜。用无菌细胞溶素缓冲液(50ml磷酸盐缓冲液，pH6.1)洗涤生物体1次。然后把细胞沉淀物悬浮于5ml同样的缓冲液中。
在含有5mM DTT的细胞溶素缓冲液中，把嗜菌体细胞溶素稀释至两倍合适的单位，然后把混合物进行无菌过滤。
把1.0ml细菌悬浮液加入到1.0ml合适的细胞溶素稀释液中，然后在37℃温度下培养该混合物。以一定的时间间隔除去样品，进行适当稀释，将其置于血血琼脂培养皿中以测定细菌数目。
把由1.0ml细菌悬浮液组成的对照样品单独加入到1.0ml细胞溶素缓冲液中。除去等分样品，然后在10倍稀释液中稀释，把等份样品置于血琼脂培养皿中以测定细菌数目。结果 含细胞溶素的细菌数细胞溶素单位 起始数目 5秒 30秒 60秒 5分钟 10分钟1000 5×106 0 0 0 0 0(平均2 exp)100 8.6×106 1530 1196 771 64 6(平均4 exp)10 9.8×106 ＞3000 ＞3000 ＞3000 ＞3000 ＞3000(平均3 exp)
根据上述教导可以对本发明作出许多改进和变动。因此应该理解：本发明的范围由权利要求书确定，而不限于说明书具体说明的方案。