脉络宁注射液及其工艺方法.pdf

脉络宁注射液及其工艺方法
技术领域
本发明涉及一种脉络宁注射液及其工艺方法，属于中药领域。
背景技术
脉络宁注射液是治疗血栓性疾病的一种理想药品。脉络宁注射液是从金银花、石斛、玄参、牛膝药物中经化学提取而制成的一种复方中药注射剂。有清热养阴、活血化瘀等功能，临床用于治疗血栓塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等闭塞性疾病。
四味药的主要成分与药理作用：
金银花为忍冬科植物忍冬lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。主要含黄酮类化合物：木犀草素、绿原酸、异绿原酸、木犀草素-7-葡萄糖甙(木犀草甙)、5-羟基-3’，4’，7-三甲氧基黄酮等。以上成分绿原酸，在热水中溶解度较大，易溶于乙醇，极微溶于乙酸乙酯，具有较广泛抗菌作用，有止血、增高白血球及抗病毒作用；木犀草素溶于乙醇和碱性溶液；木犀草甙微溶于水、甲醇、乙醇，可溶于热水、热甲醇及乙醇。对心血管的作用：木犀草素、木犀草甙有降低兔实验型动物粥样硬化中胆甾醇的作用，皮下注射有增强毛细血管的作用，其中木犀草素可使动脉压增加而降低静脉压，增加冠状动脉血流量。
石斛为兰科植物黄草石斛Dendrobium chrysanthum Wall.干燥茎。黄草石斛为铁皮石斛、罗河石斛、广东石斛、细径石斛等的加工品。主要含石斛碱、石斛次碱、6-羟基石斛碱。据报道，尚分离得五种季胺生物碱。还分离得阿牙品、滨蒿内酯等。生物碱易溶于乙醇、甲醇；滨蒿内酯易溶于甲醇、乙醇、氯仿等。其中石斛碱有止痛作用，对血压和呼吸有抑制作用等；滨蒿内酯有降血压作用。0.4-10mg/kg静注或十二指肠给药，对全麻或局麻大鼠、猫与兔均有显著降压效果。此作用不被六烃季胺和阿托品阻断，不被苄胺唑啉所加强，也不能对抗肾上腺素的升压作用。以1/50-1/10静注射量作椎动脉注射时，降血压强度和全量静注大致相等，提示其降压作用可能为中枢性的。滨蒿内酯对在位兔心和猫心的收缩力有增强作用。滨蒿内酯还可使离体兔心冠脉流量增加。
玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄参主要化学成分为环烯醚萜、苯丙素苷、三萜皂苷和有机芳酸四种类型。其中主要有效成分为桂皮酸，溶于醇，易溶于乙酸乙酯。桂皮酸临床中发现有升高白细胞作用，近年动物实验证实有升白作用，动物实验还发现能提高外周白细胞及血小板数等。
牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata BL.干燥根。牛膝主要化学成分三萜皂苷，水解后生成齐墩果酸，并含有蜕皮甾酮和牛膝甾酮。此外，尚含有寡聚糖、多糖等。其中主要成分之一为蜕皮甾酮，蜕皮甾酮易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯。药理实验表明对动物有降低血糖和胆固醇的作用。
脉络宁注射液自八十年代初上市至今只有10ml小针一个剂型，虽然疗效好，但使用不方便，需要用葡萄糖注射液或氯化钠注射液稀释后使用，使用过程中污染途径多，临床易出现输液反应。
公开了申请号为92107848.X的脉络宁静脉注射液的工艺方法，其特征在于：将金银花、牛膝、玄参、石斛四味药按重量计为：金银花10-40％，牛膝14-35％，玄参40-15％，石斛35-10％的比例配伍后，加水浸煮，将煎液浓缩成半固体状，以乙醇淀析，醇液回收乙醇后用醋酸乙酯抽提，提取液用蒸馏水转溶，滤取水溶液加适量吐温-80及20％NaOH溶液调节其PH值至8.5-9.0，即得成品。此专利公开的工艺方法生产的脉络宁注射液中没有对有效成分进行定性定量的分析，无法很好的控制产品质量。而且通过用于临床发现吐温-80会引起高血压、心动过速、组胺水平升高，同时还有溶血现象。
注射剂本身是用于危重病人的，为了使脉络宁这一疗效确切的品种为更多的患者解除病痛，为了减少使用过程中的污染途径，提高产品质量，确保产品疗效，应该开发不同形式的脉络宁产品。
技术内容
本发明的目的在于提供一种脉络宁注射液，该注射液(静滴液)有效成份含量稳定，减少了产品的毒副作用，具有清热养阴、活血化瘀等功能，可用于治疗血栓塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等闭塞性疾病。
本发明的另一目的在于提供一种制备脉络宁注射液的工艺方法，该方法克服上述缺点，产品质量稳定，提高了产率及产品疗效，同时减少使用过程中的污染，避免吐温-80引起的高血压、心动过速、组胺水平升高和溶血的副反应。
为了实现发明目的，本发明提供了一种脉络宁注射液，是由金银花、石斛、玄参、牛膝等量混合，经化学提取而制成的一种复方中药输液剂，其特征在于，有效成份的含量为：绿原酸含量平均值为0.05-0.12mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.02-0.04mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.005-0.03mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为2.5-4.5μg/ml；总黄酮含量平均值为1.0-2.5mg/ml。
优选的，有效成份的含量为：绿原酸含量平均值为0.08-0.12mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.03-0.04mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.01-0.03mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为3.5-4.5μg/ml；总黄酮含量平均值为1.5-2.5mg/ml。
最优选的为，绿原酸含量平均值为0.10mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.039mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.022mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为3.9μg/ml；总黄酮含量平均值为1.75mg/ml。
以绿原酸的含量为指标表征本发明所述金银花的含量；以肉桂酸的含量为指标表征本发明所述玄参的含量的指标；以蜕皮甾酮为指标表征本发明所述牛膝的含量；以滨蒿内酯为指标表征本发明所述石斛的含量。
本发明所述的脉络宁注射液由金银花、石斛、玄参、牛膝四种成分混合而成，其中含有生物碱类、苷类、多糖类、黄酮类、有机酸等成分。
经高效液相色谱分析，本发明所述的脉络宁注射液的色谱中，以绿原酸对照品的色谱峰作为参照峰，包含四种组分的13个主要共有峰，其中各共有指纹峰的相对保留时间为：1(0.170)，2(0.372)，3(0.503)，4(0.553)，5(0.586)，6(0.829)，S(1.000)，7(1.2541)，8(1.130)，9(1.428)，10(1.532)，11(1.624)，12(1.173)，13(3.035)。
共有峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3％。
峰面积比值为：2∶3∶S∶7∶10＝(1.05-1.58)∶(1.07-1.60)∶1.00∶(0.69-1.15)∶(0.32-0.59)。
本发明所述的脉络宁注射液的较佳剂型为静滴液，即大输液，这样不需要用葡萄糖注射液或氯化钠注射液稀释后使用，可减少使用过程中的污染途径，稳定产品质量。
为了实现发明另一目的，本发明还提供了一种由金银花、牛膝、玄参和石斛四味药组成的脉络宁注射液的工艺方法，其特征在于，包含下述步骤：
a.)将金银花、牛膝、玄参和石斛按等量配伍并混合，加水至沸，并煎煮，取煎煮液，过滤得第一次煎液，再加水煎煮，取煎煮液，过滤得第二次煎液，合并两次煎液，浓缩成浓缩液；
b.)在浓缩液中加入乙醇搅拌并静置，倾取上清液，将上清液浓缩成浓缩液；
c.)加入乙酸乙酯搅拌，萃取5～7次，每次均倾取上清液，合并浓缩成浓缩液；
d.)在c步骤中得到的浓缩液中加入注射用水，搅拌，冷藏，过滤，加入泊洛沙姆或丙二醇，搅拌溶解，加入氯化钠，搅拌溶解；
e.)用NaOH溶液调PH值至8.0～9.0之间，过滤，精滤，灭菌，制得脉络宁注射液。
其中所述的步骤a为水提法，两次的加水量均为四味药总量的6～10倍，优选的加水量为总量的8～10倍，最优选的为总量的9倍，第一次煎煮时间为2～3小时，优选的为2小时，第二次煎煮时间为1～2小时，优选的为1.5小时，所述的浓缩液的相对密度为1.10～1.20，优选为1.10。
步骤b为醇沉法，采用一次醇沉，醇沉溶液为乙醇，药液中乙醇浓度为70％～85％，优选的为80％～85％，加入量为步骤a中所得浓缩液的5～8倍，优选为浓缩液的6倍，所述的搅拌速度为50转/分～100转/分，优选为60转/分，搅拌时间为5分钟～20分钟，优选为10分钟，静置8小时～20小时，优选为12小时，醇沉后得到浓缩液地相对密度为1.10～1.25，优选的相对密度为1.15。
步骤c优选的萃取次数为7次，每次乙酸乙酯的加入量为被萃取液的1～3倍量，所述的搅拌速度为50转/分～100转/分，优选为60转/分，搅拌时间为5分钟～20分钟，优选为15分钟，萃取后所得浓缩液的相对密度为1.05～1.25，优选的相对密度为1.10。
步骤d中所述的注射用水的用量为步骤c中所得浓缩液量的6～10倍，优选为8倍，所述的搅拌速度为50转/分～100转/分，优选为60转/分，搅拌时间为5分钟～20分钟，优选为10分钟，冷藏的温度为0℃～4℃，时间为10～20小时，优选为12小时，所述的泊洛沙姆的加入量为总配液量的0.4％～0.6％，优选为0.5％，所述的丙二醇的加入量为总配液量的1-50％；溶解时所用的搅拌速度为50转/分～100转/分，优选为60转/分，搅拌时间为5分钟～20分钟，优选为10分钟，所述的氯化钠的加入量为总配液量的0.5％～0.9％，优选的加入量为0.8％～0.9％，溶解氯化钠所用的搅拌速度为50转/分～100转/分，优选为60转/分，搅拌时间为5分钟～20分钟，优选为10分钟。
步骤e中所述的NaOH溶液的浓度为10％～30％，所述的精滤采用的是0.45至1微米微孔滤膜，优选为0.45微米微孔滤膜，灭菌方式为蒸汽灭菌法或紫外线灭菌，灭菌时间为30-45分钟，优选为40分钟。
本发明所述的过滤为常用的过滤法，可采用滤布过滤、石棉过滤等方式，在进行步骤b和c时，为了减少乙醇和乙酸乙酯的消耗，提高浸出效率，可采用一个回流装置，使乙醇和乙酸乙酯能循环使用。
本发明主要采用的提取工艺为：水提——醇沉——乙酸乙酯萃取的工艺路线。制剂工艺选用泊洛沙姆或丙二醇为滨蒿内酯等酯溶性成分的增溶剂，用氯化钠来调等渗。
本发明采用醇沉的目的主要是去除淀粉、多糖、蛋白质、鞣质、树脂等。四味药中除含有生物碱、有机酸等外，还含有滨蒿内酯，因此，本工艺方法选用较高浓度的乙醇，浓度控制在70％-85％。选择一步醇沉优点为：既可以除去部分杂质，又可避免多步醇沉内酯、黄酮等的损失。
现有技术中脉络宁注射液采用吐温-80作为增溶剂，但因为增溶剂吐温-80会引起高血压、心动过速、组胺水平升高，同时还有溶血现象，所以为了减小药物的副作用，本发明经大量的研究试验及优选，发现泊洛沙姆及丙二醇的副作用均小、又无溶血现象，可选择用作为增溶剂。
因为本发明注射液作为输液剂，直接注入静脉，且一次用量较大，所以在配制时应达到一般注射剂的要求外，还有其他质量要求：1)应调节适宜的PH值，在保证疗效和制品稳定性的基础上，接近人体血液的PH值；2)应具有适宜的渗透压，不能低于血液的渗透压，应调节成等渗或偏高渗，以免引起溶血现象；3)应澄明、无菌、无热原反应，应无毒性输液输入人体后不应引起血象的异常变化。
对于中药产品来说，制备工艺的控制非常重要，因为每味药的成分非常复杂，只有严格控制提取分离过程的工艺，才能达到最终产品中有效成分含量的稳定，因此本发明通过正交试验的确定了优选工艺。
1)对水提工艺研究：
预试验：加水量依次选择为四味药总量的10倍、9倍、8倍，一煎至三煎加水量一致，观察时间对煎煮效果的影响。
                     表1 考核指标绿原酸和滨蒿内酯的薄层鉴别

  批号    加水量               煎煮时间薄层鉴别  1    10倍    一煎2h    二煎1h二煎滨蒿内酯有淡黄色斑点  2    9倍    一煎2h    二煎1.5h二煎几乎无斑点  3    8倍    一煎2h    二煎2h二煎几乎无斑点
通过薄层鉴别可以看出，批号2、3无显著差异。
根据预试验情况，称取四味药材各200克，分成四份进行试验，采取批号2、3的煎煮条件，设计水平正交表，以总黄酮含量和浸膏量为考察指标，测定方法参照《中国药典》2000年版一部578页。
                      表2 考察因素和水平
                               因素
水平
        加水量(倍)A         煎煮时间B           煎煮次数C
1       9                   ①2h   ②1.5h       2
2       8                   ①2h   ②2h         2
             表3 脉络宁注射液水煎工艺L₄(2³)正交设计试验
试验号        A       B         C        浸膏量得率  黄酮量(mg)  黄酮转移率(％)
1             1       1         1        7.7276      747         16.881
2             1       2         2        5.869       121.5       2.746
3             2       1         2        4.241       110         2.486
4             2       2         1        3.8355      98.3        2.221
黄酮          K₁     19.627    19.367   19.102
转移          K₂     4.707     4.967    5.232
率            R       7.46      7.2      6.935
浸膏          K’₁   13.5966   11.9686  11.5631
得率          K’₂   8.0765    9.7045   10.11
              R’             2.7600    1.1320   0.72655
                         表4 浸膏得率方差分析表
误差来源     离差平方和     自由度     方差       F值       P值
A            47.5825        1          47.5852    26.25     ＜0.05
B            1.2875         1          1.2875     2.84      ＞0.05
C            0.525          1          0.525      1.16      ＞0.05
误差E        1.1825         2          0.9075
F_0.05(1，2)＝18.50
                        表5 黄酮转移率方差分析表
误差来源     离差平方和     自由度     方差       F值       P值
A            55.7725        1          55.7725    1.12      ＜0.10
B            51.84          1          51.84      1.04      ＜0.10
C            48.095         1          48.095     0.96      ＜0.10
误差E        99.935         2          49.9675
F_0.10(1，2)＝8.53
四份试验中所用金银花黄酮含量为88.5mg/g，收率也以金银花中黄酮含量计。结果分析，从表3可以看出对黄酮提取率影响因素主次顺序为A＞B＞C，直观分析结果试验号1为最佳工艺；从表4、5中可以看出浸膏得率中的A因子显著，黄酮转移率中A因子也有一定的显著性。可得出加水量为9倍，水提一煎2h，二煎1.5h是较优选的方案。
2)醇沉工艺研究：
醇沉的目的主要是去除淀粉、多糖、蛋白质、鞣质、树脂等。四味药中除含有生物碱、有机酸等外，还含有滨蒿内酯，因此，本发明选择一步醇沉，选择一步醇沉既可以除去部分杂质，又可避免多步醇沉造成滨蒿内酯、黄酮等的损失，本发明选用较高浓度的乙醇，浓度为70％-85％。本试验采用等量的金银花、牛膝、玄参和石斛，加水量为9倍的总药量，一煎水提时间为2小时，二煎水提时间为1.5小时，水提后浓缩液的相对浓度为1.10，每次加入不同浓度的等体积醇沉溶液，搅拌速度50转/分，搅拌时间为10分钟，醇沉静置时间为12小时，浓缩后测得如下结果：
                             表6 醇沉工艺研究试验
编号      药液含醇量      浓缩液相对密度      乙醇液中滨蒿内酯含量(μg/ml)
1         70％            1.20                3.529
2         75％            1.15                4.434
3         80％            1.10                6.335
4         85％            1.25                9.336
通过绿原酸的鉴别反应，和滨蒿内酯含量测定可以得出，浓缩液相对密度较好的为1.10-1.25，乙醇浓度为80-85％。
3)乙酸乙酯萃取工艺研究：
对于萃取工艺来说，影响萃取有效成分的主要因素有三个，即浓缩液的相对密度、萃取次数、乙酸乙酯的用量。
本发明按四个设计方案进行预试验，水提和醇沉的工艺条件相同，浓缩后的浓缩液相对密度不同，萃取次数不同，以最后一次萃取液几乎无色为准，测定含量以含滨蒿内酯不大于0.1μg/ml为提取完全。测得结果如下：
                        表7 乙酸乙酯萃取工艺研究试验
      浓缩液相对密度        乙酸乙酯用量/次    萃取次数    最后一次萃取液滨蒿内酯含量
编号
                            ml                             μg/ml
1     1.10                  20                 5           0.047
2     1.15                  20                 6           0.040
3     1.10                  20                 7           0.082
4     1.25                  20                 8           0.087
从节约乙酸乙酯和提取效率角度综合考虑，浓缩液相对密度影响不大，但相对密度太大提取不完全，太小溶剂用量较大，优选得提取次数为5-7次。
根据预试验发现浓缩液相对密度对提取影响不大，浓缩液相对密度控制为1.10-1.20，因此在正交试验中主要考虑搅拌的时间和萃取次数，搅拌速度设定在60转/分。考察指标黄酮转移率和滨蒿内酯的转移率。
                          表8 考察因素与水平
                                   因素
水平
             乙酸乙酯用量(倍)A     萃取次数B          搅拌时间C
1            1                     5                  5
2            1                     6                  10
3            1                     7                  15
称取处方量每味药材各450克，各加纯水4050毫升，煎煮2小时，过滤煎液，备用；二煎加水至一煎水位，加热至沸，煎煮1.5小时，过滤煎液，合并两次煎液浓缩至相对密度1.10，加入酒精边加边搅拌，搅拌速度为60转/分，搅拌时间为15分钟，使含醇量达81％。放置12小时，倾取上清液，回收乙醇，浓缩至相对密度1.10，测黄酮含量137.03mg/g，滨蒿内酯0.5435mg/g，分成9等份，按表8实验，挥干乙酸乙酯，加水溶解，测定黄酮和滨蒿内酯含量。结果如下：
      表9 脉络宁注射液乙酸乙酯提取工艺L₉(3³)正交设计试验
试验号         A         B         C                黄酮转移率(％)      滨蒿内酯转移率(％)
     1         1         1         1         1      54.04               64.2
     2         1         2         2         2      78.85               74.7
     3         1         3         3         3      33.23               71.3
     4         2         1         2         3      32.31               45.63
     5         2         2         3         1      30.24               32.46
     6         2         3         1         2      95.03               100.74
     7         3         1         3         2      85.32               58.27
     8         3         2         1         3      92.65               85.89
     9         3         3         2         1      76.59               40.79
黄   I         166.12    171.67    241.72    160.87
酮   II        157.58    201.74    187.75    259.2
含   III       254.56    204.85    148.79    158.19
量I        55.37     57.22     80.57     53.62
II       52.53     67.25     62.58     86.40
III      84.85     68.28     49.60     52.73
     R         32.32     11.06     30.97     33.67
滨   I         210.21    168.11    250.84    137.46
蒿   II        178.83    193.05    161.12    233.71
内   III       184.95    212.83    162.03    202.82
酯I        70.07     50.04     83.61     45.82
转II       59.61     64.35     53.71     77.90
移III      61.65     70.94     50.01     67.60
率   R         10.46     20.9      29.6      32.08
                表10 黄酮转移率方差分析表
误差来源      离差平方和      自由度      方差     F值      P值
A             1922.19         2           961.1    77.26    ＜0.01
B             223.88          2           111.94   9.0      ＜0.10
C             1451.85         2           725.93   58.35    ＜0.05
误差E         24.88           2           12.44
F_0.01(2，2)＝99.00    F_0.05(2，2)＝19.00    F_0.10(2，2)＝9.00
                 表11 滨蒿内酯转移率方差分析表
误差来源        离差平方和       自由度     方差      F值       P值
A               184.46           2          96.23     2.84      ＜0.05
B               334.79           2          167.39    5.16      ＞0.05
C               1770.85          2          885.43    28.05     ＜0.05
误差E           64.91            2          32.45
F_0.05(2，2)＝19.00
通过方差分析可以看出黄酮转移率水平1，即乙酸乙酯用量为浓缩液的1倍，萃取次数为5次，搅拌时间为5分钟，比较显著。而滨蒿内酯转移率水平3显著，即乙酸乙酯用量为浸膏的1倍，萃取次数为7次，搅拌时间为15分钟，比较理想。综合分析可得优选方案为：乙酸乙酯用量为浸膏的1倍，萃取次数为7次，搅拌时间为15分钟。
4)脉络宁注射液中滨蒿内酯的增溶试验：
现有技术一般采用吐温-80作为增溶剂，但吐温-80在临床上会引起高血压、心动过速、组胺水平升高，且吐温-80有溶血现象。因此通过大量的试验选用副作用小、无溶血现象的泊洛沙姆或丙二醇作为增溶剂。
本发明设计六个方案，药液量由2.32～3.54g/100ml，三批浸膏的含量依次为0.1415mg/g，0.0882mg/g，0.2064mg/g。泊洛沙姆用量为总量的0.1-0.6％。
                        表12 滨蒿内酯的增溶试验  批号 提取物含量    理论用量              泊洛沙姆增溶后滨蒿内酯的含量(mg/ml) mg/g    g/100ml PX0.1％ PX0.2％ PX0.3％ PX0.4％ PX0.5％ PX0.6％  1 0.1415    3.54 0.0032 0.0037 0.004 0.0045 0.0051 0.0050  2 0.2064    2.56 0.0027 0.0034 0.0046 0.0050 0.0054 0.0054  3 0.0882    2.32 0.0014 0.0015 0.0015 0.0016 0.0019 0.0017
通过试验结果可以看出泊洛沙姆用量在0.4％～0.6％增溶效果比较明显。
                  表13 在泊洛沙姆增溶下滨蒿内酯转溶率  编号  提取物用量  提取物中滨  蒿内酯总量      泊洛沙姆每100ml用量、滨蒿内酯转      溶率(％)  g/100ml  mg    0.4g    0.5g    0.6g  1  3.54  0.501    89.82    96.80    99.80  2  2.56  0.528    94.70    98.27    92.7  3  2.32  0.205    78.05    92.68    82.93
通过滨蒿内酯转溶率数据统计结果，可看出泊洛沙姆用量为0.5％为最佳用量。
5)氯化钠调等渗试验：
根据《中药注射剂研究的技术要求》中有关安全性试验项目及要求，以是否溶血，是否有红细胞凝聚的现象，来判断氯化钠的用量是否适当。一般用溶血测定法来确定药物的渗透压，此法是用人的红细胞放在各种不同低浓度的氯化钠溶液中出现不同程度的溶血；同样将人的红细胞放在某种药物的不同浓度溶液中，也将出现不同程度的溶血，凡溶血情况相同的则认为渗透压相同。本发明调等渗所用氯化钠的量选用总量的0.5-0.9％，连续做三个批次，0.7-0.9％效果明显，与对照管一致；为进一步选择氯化钠最佳用量，选用同一批提取物做溶血试验(所采血液为兔血)。
                 表14 氯化钠不同用量溶血试验观察时间                            药液0.3ml对照管氯化钠用量0.8％0.85％0.9％15分钟分层，上层约0.1ml分层，上层约0.1ml分层，上层约0.1ml分层，上层约0.15ml30分钟分层，上层约0.25ml分层，上层约0.2ml分层，上层约0.2ml分层，上层约0.25ml45分钟分层，上层约0.5ml分层，上层约0.5ml分层，上层约0.5ml分层，上层约0.5ml1小时分层，上层几乎无色分层，上层几乎无色分层，上层几乎无色分层，上层几乎无色2小时上层为药液色，下层为红色上层为药液色，下层为红色上层为药液色，下层为红色上层无色，下层红色3小时上层为药液色，下层为红色上层为药液色，下层为红色上层为药液色，下层为红色上层无色，下层红色4小时上层为药液色，下层为红色上层为药液色，下层为红色上层为药液色，下层为红色上层无色，下层红色
通过以上试验，可以看出氯化钠用量为总量的0.80％-0.85％效果最佳。
               表15 脉络宁注射液渗透压测试试验   批号  未加氯化钠冰点下降值  加氯化钠(0.85％)后冰点下降值   1  0.0519  0.54   2  未测  0.57   3  0.0482  0.55   0.9％氯化钠  0.52
通过对0.85％氯化钠渗透压测试试验可以看出脉络宁注射液的冰点下降值与0.9％氯化钠的冰点下降值基本接近，说明氯化钠最佳用量为总量的0.85％。
6)PH值对脉络宁注射液澄明度等的影响
根据《中药注射剂研究的技术要求》，及部标中药成分制剂第十八分册，在研究PH值对脉络宁注射液澄明度的影响时，选择灭菌前PH值的范围在4.0-9.0之间，设计十个PH值范围进行试验。观察同一批提取物配制的脉络宁注射液灭菌前后澄明度的变化和PH值变化范围，及对可测成分的影响，结果如下。
                                           表16 灭菌前后测试结果对比 编 号      PH值                   澄明度        色泽    黄酮含量    (mg/ml)    滨蒿内酯    (μg/ml)灭菌前灭菌后灭菌前灭菌后灭菌前灭菌后灭菌前灭菌后 灭菌前 灭菌后 14.194.00不太澄清同灭菌前浅黄色浅黄色0.33180.3582 4.0 4.0 24.464.24同上同上浅黄色浅黄色0.31770.3565 4.0 4.2 35.144.80澄清，无异物澄清，异物2个浅黄色浅黄色0.35100.3688 3.9 4.0 45.545.08澄清，无异物澄清，无异物浅黄色黄色0.33780.3565 4.0 4.2 55.925.14澄清，无异物澄清，异物1个黄色黄色0.34820.3460 4.4 4.0 66.465.30澄清，无异物澄清，无异物黄色橙黄色0.33340.3454 4.2 4.1 78.145.65澄清，无异物澄清，无异物橙黄色橙黄色0.31930.3539 4.2 4.1 89.116.03澄清，无异物澄清，无异物橙红色橙红色0.25950.3384 4.2 4.1 98.025.65澄清，纤维1个澄清，纤维1个橙黄色橙黄色0.32550.3627 4.2 3.8 108.435.77澄清，无异物澄清，无异物橙黄色橙红色0.34250.3100 4.0 3.8
结果发现灭菌前6.46～9.11较理想，并且在该范围内测定黄酮、滨蒿内酯含量在灭菌前后几乎无变化，灭菌后澄明度也较理想。为更接近体液PH值，灭菌前PH值优选的范围为8.5～9.0。
7)脉络宁注射液初步稳定性试验：
取脉络宁注射液分别在0～5℃和37～40℃下，放置0、1、2、3个月观察，测定结果如下：
                            表17 0-5℃测试结果PH澄明度色泽总黄酮(mg/ml) 滨蒿内酯(μg/ml) 0月6.7澄清，无异物橙红色1.5430 2.5 1个月6.6澄清，无异物橙红色1.5496 2.6 2个月6.8澄清，无异物橙红色1.5480 2.5 3个月6.5澄清，无异物橙红色1.5524 2.42
                               表18 37-40℃测试结果PH澄明度色泽总黄酮(mg/ml) 滨蒿内酯(μg/ml) 0月6.7澄清，无异物橙红色1.5600 2.6 1个月6.3澄清，无异物橙红色1.5619 2.62 2个月6.4澄清，无异物橙红色1.5691 2.4 3个月6.3澄清，无异物橙红色1.5738 2.5
通过试验可以看出0～5℃，37-40℃贮藏0-3个月对脉络宁注射液的澄明度、色泽、PH以及总黄酮和滨蒿内酯几乎无影响。
本发明通过大量的试验研究，及其理化性质研究和指纹谱图分析，确定本发明的脉络宁注射液的技术指标如下：
        检测项目                                 检测指标        性状黄棕色至红棕色的澄清溶液鉴别滨蒿内酯呈正反应肉桂酸呈正反应绿原酸呈正反应检查PH值6.0-7.0(中国药典2000年版一部附录VII G)蛋白质未见浑浊(中国药典2000年版一部附录IX S)糅质无浑浊和沉淀(中国药典2000年版一部附录IX S)树脂无絮状物析出(中国药典2000年版一部附录IX S)草酸盐符合规定(中国药典2000年版一部附录IX S)重金属＜10ppm(中国药典2000年版一部附录IX E)砷盐＜1ppm(中国药典2000年版一部附录IX F)钾离子无浑浊(中国药典2000年版一部附录IX S)炽灼残渣≤1.5％(中国药典2000年版一部附录IX J)总固体≥2.8mg热原符合规定(中国药典2000年版二部附录XIII A)溶血与凝集符合规定(中国药典2000年版二部附录I B)澄明度未检出杂质(中国药典2000年版二部附录B)含量测定滨蒿内酯≥1.0μg/ml(中国药典2000年版一部附录VI D)总黄酮≥0.7mg/ml(中国药典2000年版一部附录V B)
本发明所述的脉络宁注射液的使用方法：静脉滴注，一次50～100ml，一日1次，10～14天为一个疗程，重症患者可连续使用2～3个疗程。
本发明所述的脉络宁注射液四种原料的有效成份含量稳定，减少了产品的毒副作用，而且不需稀释即可静脉滴注，减少了污染途径。通过本发明的工艺方法制备的脉络宁注射液为经化学提取后制成的一种复方中药输液剂，具有清热养阴、活血化瘀等功能，临床可用于治疗血栓塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症、脑血栓形成及后遗症、静脉血栓形成等闭塞性疾病。本发明的工艺方法制备的脉络宁注射液产品质量稳定，产率及产品疗效均得到提高，同时在使用过程中减少了途径污染，而且由于工艺过程的改进，避免了因加入溶剂引起高血压、心动过速、组胺水平升高和溶血的副反应。
附图说明
图1是绿原酸对照品的色谱图
图2是绿原酸对照品纯度的色谱图
图3是缺金银花的阴性样品的色谱图
图4是脉络宁注射液样品(绿原酸含量测定)的色谱图
图5是金银花药材的色谱图
图6是肉桂酸对照品的色谱图
图7是肉桂酸对照品纯度的色谱图
图8是缺肉桂酸的阴性样品的色谱图
图9是脉络宁注射液样品(肉桂酸含量测定)的色谱图
图10是玄参的色谱图
图11是蜕皮甾酮对照品的色谱图
图12是蜕皮甾酮对照品纯度的色谱图
图13是缺牛膝的阴性样品的色谱图
图14是脉络宁注射液样品(蜕皮甾酮含量测定)的色谱图
图15是滨蒿内酯对照品的色谱图
图16是滨蒿内酯对照品纯度的色谱图
图17是缺石斛的阴性样品的色谱图
图18是脉络宁注射液样品(滨蒿内酯含量测定)的色谱图
图19绿原酸对照品高效液相色谱图
图20本发明所述的脉络宁注射液高效液相色谱图
具体实施方式
以下是本发明的实施例，本发明给出的实施例是为了进一步说明本发明的具体实施例方案，而不是用来限制本发明的保护范围。
                            实验例1
本实验例是对测定脉络宁注射液中有效成份含量的研究。
一.脉络宁注射液中金银花的含量测定
(一)方法确定
金银花主含绿原酸、异绿原酸，二者为主要有效成分。据文献报道，绿原酸用于定量的分析方法有：三波长紫外分光光度法、HPLC法、差示导数光谱法、薄层色谱扫描法等，HPLC法因其准确、精密、重视性好而被应用最多，中国药品生物制品检定所能提供绿原酸对照品(供含量测定用)，故以绿原酸的含量为指标采用HPLC法测定样品中金银花的含量。
(二)HPLC法测定脉络宁注射液中绿原酸含量的考察
1.仪器及试剂
1.1仪器
Waters244高效液相色谱仪；6000A泵；U6K进样阀；SPD-10A紫外检测器；U-3210紫外分光光度仪；
数据处理机：N2000色谱工作站
1.2试剂
甲醇(色谱纯)：中国医学科学院天津协和公司出口，批号：000102
乙腈(色谱纯)：浙江省临海市有机化工二厂，批号：000106
水：重蒸馏水；冰醋酸(AR级)，苏州市第二化工研究所，批号：000201
绿原酸对照品：中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：0753-9910
2.方法与试验
2.1样品制备
脉络宁注射液供试品溶液：精密量取样品溶液5ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
金银花药材供试品溶液：取金银花药材过60目筛的粉末，精密称取0.05g(同时用烘干法测定水分)，置100ml量瓶中，加50％甲醇40ml，超声处理30分钟，放冷，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为药材供试品溶液。
缺金银花的脉络宁注射液阴性样品：称取牛膝、石斛、玄参各10g，照工艺制成缺金银花的脉络宁注射液，照前述脉络宁注射液供试品溶液的制备方法制成缺金银花的阴性对照溶液。
2.2检测波长的选择
据文献报道，绿原酸的检测波长有324nm，326nm，330nm，现经UV扫描(甲醇为溶剂)，λmax在329.1nm，故选用330nm为检测波长。
2.3流动相的选择
流动相选择甲醇-水-冰醋酸系统。
2.3.1流动相甲醇-水-冰醋酸系统的比例的选择
参考复方双花颗粒质量标准，配制流动相的比例为：
(1)20∶80∶1；(2)18∶82∶1；(3)17∶83∶1；(4)16∶84∶1
色谱柱：HYPERSIL ODS2，5μm，Φ4.6×250mm
灵敏度：0.5AUFS；检测波长：330nm；室温：27℃
对照品溶液的制备：取绿原酸对照品于110℃干燥至恒重：11.1199g、11.1198g，精密称取4.85mg，置100ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。
进样量：10μl。
在上述流动相比例下测定，绿原酸色谱峰保留时间分别为：①6.38min，②8.853min，③10.372min，④15.033min。
结论：流动相比例为④时样品的HPLC图表明绿原酸已基本能与其他成分分离。
所得色谱图中，绿原酸峰分离尚可，但其后有一小峰尚未分开，故考虑换色谱柱。
2.3.2色谱柱的选择及流动相比例的确定
配制流动相：甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)，换用色谱柱：Kromasil 5μm，Φ4.6×200mm，灵敏度：0.2AUFS，检测波长：330nm，进样10μl，其余同前。
所得色谱图中，虽然绿原酸峰后的两个峰已叠加至一起，但绿原酸峰已得到较好的分离，且中间分离出两个小峰，可知对绿原酸来说，Kromasil较之HYPERSIL分离效果更好，故选用Kromasil柱，流动相由此确定为：甲醇-水-冰醋酸(15∶85∶1)。
2.4样品测定与结果(图1-5)
在前述色谱条件下，测定绿原酸含量平均值为0.05-0.12mg/ml。
二、脉络宁注射液中玄参的含量测定
(一)方法确定
玄参中含有肉桂酸，而中国药品生物制品检定所能提供肉桂酸对照品(供含量测定用)，据文献报道，肉桂酸用于定量的分析方法有紫外分光光度法、HPLC法、电化学法、HPLC法因其准确、精密、重视性好而被应用最多，故采用HPLC法测定肉桂酸的含量作为测定样品中玄参的含量的指标。
(二)HPLC法测定脉络宁注射液中肉桂酸含量的方法学考察
1.仪器及试剂
1.1仪器
Waters244高效液相色谱仪；U6K进样阀；6000A泵；SPD-10A紫外检测器；U-3210紫外分光光度仪；
数据处理机：N2000色谱工作站
1.2试剂
甲醇(色谱纯)：上海生生化工助剂厂，批号：9906151
水：重蒸馏水；冰乙酸(AR级)，上海生生化工助剂厂出品，批号：20010205
肉桂酸对照品：中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号：786-9001
2.方法与试验
2.1样品制备
脉络宁注射液供试品溶液：精密量取样品溶液5ml，置25ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
玄参药材供试品溶液：取玄参药材于50℃以下烘2小时，粉碎，过60目筛，取样0.05g(同时用烘干法测定水分)，置锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，置水浴中加热回流3小时，放冷，加50％甲醇补足重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为药材供试品溶液。
缺玄参的脉络宁注射液阴性样品：称取牛膝、石斛、金银花各10g，照工艺制成缺玄参的脉络宁注射液，照前述脉络宁注射液供试品溶液的制备方法制成缺玄参的脉络宁注射液，照前述脉络宁注射液供试品溶液的制备方法制成缺玄参的阴性对照溶液。
2.2检测波长的选择
据文献报道，肉桂酸的检测波长有268nm，280nm，254nm，272nm现经UV扫描(甲醇为溶剂)，λmax为273.4nm，故选用273nm为检测波长。
2.3流动相的选择
HPLC法分析测定肉桂酸的流动相选择：甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶0.2)
2.4样品测定与结果(图6-10)
按前述方法进行测定，测定结果为：肉桂酸平均含量为0.02-0.04mg/ml。
三、脉络宁注射液中牛膝的含量测定
(一)方法确定
牛膝中含有三萜皂甙，水解后生成齐墩果酸，并含蜕皮甾酮和牛膝甾酮。此外，尚含有寡糖、多糖等。脉络宁注射液工艺中有水煮醇沉过程，样品中不含齐墩果酸。样品溶液经水解后采用TLC法证实确实未检出齐墩果酸。而蜕皮甾酮有降低血糖和胆固醇的作用，为脉络宁注射液中的有效成分之一。故决定以蜕皮甾酮为指标来控制脉络宁注射液中牛膝的含量。
据文献报道，蜕皮甾酮的含量测定分析方法有GC法、HPLC法、TLCS法、HPLC法操作简单、结果准确、精密、重现性好，故采用HPLC法测定蜕皮甾酮的含量。
(二)HPLC法测定脉络宁注射液中蜕皮甾酮含量的方法学考察
1.仪器与试剂
1.1仪器
Waters244高效液相色谱仪；U6K进样阀；6000A泵；SPD-10A紫外检测器；U-3210紫外分光光度仪；数据处理机；N2000色谱工作站。
1.2试剂
甲醇(色谱纯)：上海生生化工助剂厂，批号：9906151
水：重蒸馏水；冰醋酸(AR级)，上海生生化工助剂厂出品，批号：20010205
蜕皮甾酮对照品：北京大学药学院天然药物学系提供。
2.方法与试验
2.1样品制备
脉络宁注射液样品：取本品25ml，置分液漏斗中，加氯化钠2.5g，振摇使溶解，用水饱和的正丁醇提取6次，每次25ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水20ml洗涤，洗涤液用水饱和的正丁醇20ml萃取，合并正丁醇液，置水浴上蒸干，残渣加60％的甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
牛膝药材样品：取牛膝药材于60℃烘4小时，粉碎，过60目筛，取样2g(同时用烘干法测定水分)，置索氏提取器中，加无水乙醇100ml，回流提取20小时，提取液回收乙醇至干，残渣用正丁醇饮和的水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇提取6次，每次25ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水10ml洗涤，洗涤液用水饱和的正丁醇20ml萃取，合并正丁醇液，置水浴上蒸干，残渣加60％的甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
缺牛膝的脉格宁注射液阴性样品：称取玄参、石斛、金银花各10g，照工艺制成缺牛膝的脉络宁注射液，照前述脉络宁注射液供试品溶液的制备方法制成缺牛膝的阴性对照溶液。
2.2检测波长的选择
选用243nm为检测波长。
2.3流动相的选择
HPLC法分析测定肉桂酸的流动相为乙腈-水(1.0∶5.4)系统，灵敏度为0.1AUFS。
2.4样品测定与结果(图11-14)
按前述拟定的方法进行了蜕皮甾酮的含量测定，测定结果为：蜕皮甾酮含量平均值为0.005-0.03mg/ml。
四、脉络宁注射液中石斛的含量测定
(一)方法确定
石斛中含有滨蒿内酯，《卫生部药品标准》中药成方制剂第十八册收载的脉络宁注射液(小针剂)质量标准采用TLCS法测定滨蒿内酯的含量，因此决定以滨蒿内酯为指标测定石斛的含量。因HPLC法与TLCS法相比，其精密度、准确性、重现性更高，故考虑采用HPLC法测定其含量。
(二)HPLC法测定脉络宁注射液中滨蒿内酯含量的考察
1.仪器及试剂
1.1仪器
Waters244高效液相色谱仪；6000A高压液相泵；U6K进样阀；SPD-10A紫外检测器；灵敏度：0.1AUFS；U-3210紫外分光光度仪
色谱柱：Kromasil C₁₈，5μm，φ4.6×200mm(天津市凯达利色谱科学仪器销售中心填装)；数据处理机：N2000色谱工作站
1.2试剂
甲醇、乙腈(色谱纯)：中国医学科学院天津协和公司
水：重蒸馏水(实验室自制)  三氯甲烷(AR级)
滨蒿内酯对照品：中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。
2.方法与试验
2.1样品制备
脉络宁注射液样品：取本品50ml，加氯化钠5g，用三氯甲烷提取3次，每次30ml，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加60％甲醇使溶解，并转移至25ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
石斛药材样品：取石斛药材粉碎，过60目筛，取样0.5g，加水50ml煎煮2次，每次1小时，合并煎液，浓缩至约20ml，加三氯甲烷提取6次，每次20ml，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，残渣加60％甲醇使溶解，并转移至50ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。
缺石斛的脉络宁注射液阴性样品：称取玄参、牛膝、金银花各10g，照工艺制得缺石斛的脉络宁注射液，照上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。
2.2检测波长的选择
选择用343nm为检测波长。
2.3流动相的选择
流动相选择乙腈-水系统(100∶400)。
2.4样品测定与结果(图15-18)
按前述方法样品进行了测定，测定结果为滨蒿内酯的平均含量为2.0-4.5μg/ml。
五、脉络宁注射液中总黄酮的含量测定
(一)方法的确定
金银花中含木犀草素等黄酮类成分，玄参也含有黄酮类成分。且根据工艺黄酮类成分能被很好地提取出来。据文献报道，木犀草素等黄酮类成分有使动脉压增加而降低静脉压的作用，可增加冠状动脉血流量，与成品的功能主治相符，是成品中的有效成分，因此以总黄酮为含量测定的指标。
关于总黄酮为含量测定，文献报道有：TLCS、紫外分光光度法、比色法等，？以比色法居多，且多为以芦丁为对照品。现参照《中国药典》2000年版一部排石颗粒的质量标准制订本品中总黄酮的含量测定方法如下：
1.方法
1.1样品制备
对照品溶液的制备：精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置100ml量瓶中，加50％甲醇适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.10mg)。
供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
缺金银花的脉络宁注射液阴性对照样品的制备：称取牛膝、石斛各10g，照工艺制成缺金银花、玄参的脉络宁注射液，照前述脉络宁注射液供试品溶液的制备方法制成缺金银花、玄参的双阴性对照溶液。
1.2测定
标准曲线的制备  精密量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置10ml量瓶中，精密加入5％的亚硝酸钠溶液0.6ml，摇匀，放置6分钟。加10％硝酸铝溶液0.6ml，摇匀，放置6分钟，加8.6％氢氧化钠溶液3ml，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白。照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V B)，在510nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品的测定  精密量取供试品溶液3ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，作为空白对照；另精密量取供试品溶液3ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加50％甲醇至5ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供度品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
(二)总黄酮的含量测定方法学考察
1.试剂与仪器
试剂：硝酸铝：分析纯，上海科昌精细化学品公司，
      亚硝酸钠：分析纯，广州化学试剂厂，
      氢氧化钠：分析纯，湖南师大化学试剂厂
      芦丁对照品：中国药品制品检定所提供，080-9303
仪器：日本日立U-3210紫外-可见分光光度仪
2.显色条件的选择
本法在显色时加入了三种试剂：(1)5％的亚硝酸钠溶液0.3ml；(2)10％的硝酸铝溶液0.6ml；(3)氢氧化钠试液6ml。
3.波长的选择
选择在510nm测定吸收度。
4.样品中总黄酮的含量测定
根据以上拟定的成品中总黄酮的含量测定方法，进行总黄酮的含量测定，平均含量为1.0-2.5mg/ml。
                            实验例2
本实验例的目的是对本发明所述的脉络宁注射液进行HPLC法分析。
1.供试品溶液的制备：精密量取脉络宁注射液5ml于50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.参照物溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加流动相制成每1ml中含10μg的溶液，即得。
3.测定方法：采用HPLC法进行测定
3.1仪器
泵：Waters 515，流速：1.0ml/min，紫外检测器：Waters 2487，进样阀：7725，定量环20μl，色谱工作站：N2000，恒温柱箱：AT-132，色谱柱：Kromasil-100A-Spherical Silica C18，5μm，250mm×4.6mm，系列号：B297J040476(天津特纳科学仪器有限公司)
3.2试剂
甲醇：色谱纯(中国医学科学院天津协和公司出品)
冰醋酸：分析纯(苏州市第二化工研究所)
水：重蒸馏水
绿原酸对照品：供含量测定用(中国药品生物制品检定所提供)
3.3检测条件
流动相：甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶0.5)，流速：1.0ml/min，
检测波长：305nm，柱温：25℃，检测灵敏度：0.1AUF，积分参数：斜率：100；最小面积：600
3.4测定
在上述色谱条件下，吸取供试品溶液和参照物溶液各20μl注入液相色谱仪，测定，记录色谱图(图19、20)。
根据十批样品的高效液相色谱图分析，本发明所述的脉络宁注射液的色谱中，以绿原酸对照品的色谱峰作为参照峰，包含四种组分的13个主要共有峰，其中各共有指纹峰的相对保留时间为：
1(0.170)，2(0.372)，3(0.503)，4(0.553)，5(0.586)，6(0.829)，S(1.000)，7(1.2541)，8(1.130)，9(1.428)，10(1.532)，11(1.624)，12(1.173)，13(3.035)
峰6在分离较好时在其左侧或右侧有一小峰，分离不好时在其左、右侧呈现肩峰：峰4和峰5在分离不好时未达到基线分离；峰10为与周围峰未分离很好的小峰。
共有峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3％。
峰面积比值为：2∶3∶S∶7∶10＝(1.05-1.58)∶(1.07-1.60)∶1.00∶(0.69-1.15)∶(0.32-0.59)。
                            实验例3
本实验例在于通过比格犬、大鼠长期毒性试验来分析研究本发明所述的脉络宁注射液的毒性。
1.比格犬长期毒性研究试验结论
比格狗连续静脉给予脉络宁60天，100g/kg(相当于拟临床剂量的30倍，以60kg/人、200g/人计)剂量组动物给药过程中出现明显的流涎、伸舌、恶心、呕吐等反应；药后不能立即进食，活动减少。血液生化检查发现肌酐、总胆红素升高。病理组织学检查表明未发现与药物明显相关的病理变化。
比格狗连续静脉给予脉络宁60天，30g/kg(相当于拟临床剂量的10倍，以60kg/人、200g/人计)剂量组部分动物给药过程中出现流涎、伸舌、恶心、呕吐等反应，药后动物活动略少。血液生化检查发现肌酐升高。
比格狗连续静脉给予脉络宁60天，10g/kg(相当于拟临床剂量的3倍，以60kg/人、200g/人计)剂量对动物精神、行为、饮食、粪便、体重、尿液生化等均未见明显影响。血液学检查、血液生化检查、眼科检查、心电图检查、骨髓像检查与对照组相比未见明显的变化。病理组织学检查亦未发现由药物引起的明显病理改变。该剂量为未观测到毒性反应的剂量。
2.大鼠长期毒性研究试验结论
大鼠腹腔给予脉络宁三个剂量(20g生药/kg、60g生药/kg、120g生药/kg)每天一次，连续给药两个月，进行一般药物反应观察，血液学检查、血液生化测定以及病理组织学检查，发现高剂量组多数大鼠(10/12)和中剂量组个别大鼠(1/12)心外膜下血管和肌间小血管扩张、充盈呈明显充血改变，高剂量(120g生药/kg)组雌性大鼠脾、肾、肾上腺、睾丸脏器系数及总胆红素(T.Bil)含量略高于正常对照组(但属正常值范围波动)，停药两周，高剂量(120g生药/kg)组雌性大鼠以及中剂量脾脏器系数略高于正常对照组。根据病理及其它观测指标未见因药物引起的明显改变和损伤判断，上述症状均为药物引起的功能性改变，未见实质性毒性变化。60g/kg剂量组连续给药两个月及停药恢复两周无明显毒性，为安全剂量，此剂量约为人临床静脉滴注拟用剂量的18倍。提示该药毒性较低。本实验为脉络宁的临床应用安全性提供了依据。
                          实验例4
本实验例为脉络宁注射液一般药理研究试验。
1、静注脉络宁5、10、20mg/kg对小鼠一般行为及自主活动无明显影响，三个剂量与阈下剂量戊巴比妥钠催眠均无协同作用，表明脉络宁对中枢神经系统无明显的镇静或抑制作用。
2、给正常犬输注脉络宁1、2、4g生药/kg，血压、心率、心电均无明显变化，说明脉络宁对心血管系统无明显作用。
3、输注脉络宁1、2、4g生药/kg，对正常犬呼吸频率均无明显影响，表明本品对呼吸系统无明显影响。
                          实验例5
本实验例为脉络宁注射液与功能主治有关的主要药效学试验。
1、大鼠静脉给予脉络宁2.5、5.0、10g生药/kg能明显抑制ADP、Tb、CG诱导的血小板聚集。
2、大鼠静脉给予脉络宁2.5、5.0、10g生药/kg能明显延长大鼠实验性动脉血栓形成时间，其作用强度与等剂量市售脉络宁小水针(即原注射液)相似。
3、大鼠静脉给予脉络宁2.5、5.0、10g生药/kg能明显抑制大鼠下腔静脉血栓形成，其作用强度与等剂量市售脉络宁小水针相似。
4、脉络宁2.5、5.0、10g生药/kg静脉给药后，使高分子右旋糖苷引起的微循环障碍大鼠软脑膜血流量增加，且随剂量增加作用持续时间延长；其作用强于等剂量的市售脉络宁小水针。
5、高分子右旋糖苷引起的高粘血症大鼠静脉给予脉络宁5、10g生药/kg，可使高切速(200l/S)、中切速(30l/S)下的全血粘度降低；2.5g生药/kg，在中切速(30l/S)下全血粘度表现为降低。市售脉络宁小水针对全血粘度无明显影响。
6、脉络宁10g生药/kg可明显改善阻断大脑中动脉引起的大鼠局灶性脑缺血神经缺陷症状、缩小脑梗塞面积，其作用强于等剂量的市售脉络宁小水针。
                          实施例1
称取金银花、石斛(段)、玄参(片)、牛膝(段)各5000克，加纯水45000克，加热至沸，煎煮2小时，放出煎煮液，纱布过滤，续加水至原来水位，加热至沸，煎煮1.5小时，放出煎液，过滤。合并两次煎液，浓缩至相对密度位1.10，重6360克，放至室温。加入38000毫升乙醇，边加边搅拌，搅拌速度为50转/分，搅拌时间为10分钟，测乙醇含量为81％，静置12小时，回收乙醇28690毫升，回收率75.5％，浓缩至相对密度1.15，重3200克。用乙酸乙酯萃取，每次3200毫升，搅拌速度为60转/分，搅拌15分钟，共萃取6次，合并提取液，回收乙酸乙酯15168毫升，回收率79％。浓缩，边浓缩边加注射用水，除尽乙酸乙酯，提取物浓缩至1000毫升，重1050克，收率为5.25％(占原药材)，测乙酸乙酯残留量0.337％，乙醇0.0503％，测总黄酮含量为11.7mg/g。
称取提取物500克，加注射用水约4000ml，搅拌速度为80转/分，搅拌时间为10分钟，溶解后冷藏12小时，过滤，加入泊洛沙姆25克，加热溶解，加入氯化钠42.5克，搅拌速度为50转/分，搅拌时间为15分钟，溶解，用20％NaOH溶液15ml，调至PH8.20，补水至5000ml，精滤(0.45μm微孔滤膜)，灌封，100℃流通蒸汽灭菌45分钟。制得49瓶，收率为98％，灯检合格率为100％。
通过高效液相色谱图分析，其有效成份的含量为：绿原酸含量平均值为0.1022mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.0392mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.02192mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为3.9754μg/ml；总黄酮含量平均值为2.445mg/ml。
经高效液相色谱分析，本发明所述的脉络宁注射液的色谱中，以绿原酸对照品的色谱峰作为参照峰，包含四种组分的13个主要共有峰，其中各共有指纹峰的相对保留时间为：1(0.170)，2(0.372)，3(0.503)，4(0.553)，5(0.586)，6(0.829)，S(1.000)，7(1.2541)，8(1.130)，9(1.428)，10(1.532)，11(1.624)，12(1.173)，13(3.035)。
共有峰相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3％。
峰面积比值为：2∶3∶S∶7∶10＝(1.05-1.58)∶(1.07-1.60)∶1.00∶(0.69-1.15)∶(0.32-0.59)。
                          实施例2
称取金银花、石斛(段)、玄参(片)、牛膝(段)各5000克，加纯水45000克，加热至沸，煎煮2小时，放出煎煮液，纱布过滤，续加水至原来水位，加热至沸，煎煮1.5小时，放出煎液，过滤。合并两次煎液，浓缩至相对密度位1.15，重6100克，放至室温。加入36600毫升乙醇，边加边搅拌，搅拌速度为100转/分，搅拌时间为5分钟，测乙醇含量为82％，静置12小时，回收乙醇27816毫升，回收率76％，浓缩至相对密度1.20，重3150克。用乙酸乙酯萃取，每次3200毫升，搅拌速度为80转/分，搅拌20分钟，共萃取6次，合并提取液，回收乙酸乙酯14784毫升，回收率77％。浓缩，边浓缩边加注射用水，除尽乙酸乙酯，提取物浓缩至1000毫升，重1085克，收率为5.43％(占原药材)，测乙酸乙酯残留量0.288％，乙醇0.0391％，测总黄酮含量为20.9mg/g。
称取提取物500克，加注射用水约4000ml，搅拌，搅拌速度为50转/分，搅拌时间为15分钟，溶解后4℃冷藏12小时，过滤，加入泊洛沙姆25克，加热溶解，加入氯化钠42.5克，搅拌速度为80转/分，搅拌时间为10分钟，溶解，用20％NaOH溶液21ml，调至PH8.72，补水至5000ml，精滤(0.65μm微孔滤膜)，灌封，100℃流通蒸汽灭菌45分钟。制得50瓶，收率为100％，检出纤维1瓶，灯检合格率为98％。
通过高效液相色谱图分析，其有效成份的含量为：绿原酸含量平均值为0.05mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.04mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.03mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为2.5μg/ml；总黄酮含量平均值为1.032mg/ml。
                          实施例3
称取金银花、石斛(段)、玄参(片)、牛膝(段)各5000克，加纯水45000克，加热至沸，煎煮2小时，放出煎煮液，纱布过滤，续加水至原来水位，加热至沸，煎煮1.5小时，放出煎液，过滤。合并两次煎液，浓缩至相对密度位1.10，重6360克，放至室温。加入38000毫升乙醇，边加边搅拌，搅拌速度为70转/分，搅拌时间为10分钟，测乙醇含量为81％，静置12小时，回收乙醇28120毫升，回收率74％，浓缩至相对密度1.10，重3180克。用乙酸乙酯萃取，每次3200毫升，搅拌速度为100转/分，搅拌8分钟，共萃取6次，合并提取液，回收乙酸乙酯15360毫升，回收率80％。浓缩，边浓缩边加注射用水，除尽乙酸乙酯，提取物浓缩至1000毫升，重1064克，收率为5.32％(占原药材)，测乙酸乙酯残留量0.445％，乙醇0.0701％，测总黄酮含量为16.6mg/g。
称取提取物500克，加注射用水约4000ml，搅拌速度为100转/分，搅拌时间为5分钟，溶解后0℃冷藏12小时，过滤，加入泊洛沙姆25克，加热溶解，加入氯化钠42.5克，搅拌速度为100转/分，搅拌时间为5分钟，溶解，用20％NaOH溶液23ml，调至PH8.80，补水至5000ml，精滤(0.75μm微孔滤膜)，灌封，100℃流通蒸汽灭菌45分钟。制得49瓶，收率为98％，纤维1瓶，灯检合格率为98％。
通过高效液相色谱图分析，其有效成份的含量为：绿原酸含量平均值为0.08mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.02mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.005mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为4.0μg/ml；总黄酮含量平均值为2.226mg/ml。
                   实施例中脉络宁注射液产品检测对比结果：检测项目实施例1实施例2实施例3鉴别滨蒿内酯呈正反应呈正反应呈正反应肉桂酸呈正反应呈正反应呈正反应绿原酸呈正反应呈正反应呈正反应检查PH值6.76.06.4蛋白质未见浑浊未见浑浊未见浑浊糅质无浑浊和沉淀无浑浊和沉淀无浑浊和沉淀树脂无絮状物析出无絮状物析出无絮状物析出草酸盐符合规定符合规定符合规定重金属＜10ppm＜10ppm＜10ppm砷盐＜1ppm＜1ppm＜1ppm钾离子符合规定符合规定符合规定炽灼残渣0.9％0.8％0.9％总固体3.366.2776.104热原符合规定符合规定符合规定溶血与凝集符合规定符合规定符合规定澄明度未检出杂质纤维1瓶纤维1瓶含量测定滨蒿内酯3.9754μg/ml2.5μg/ml4.0μg/ml总黄酮2.445mg/ml1.032mg/ml2.226mg/ml
                          实施例4
水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取过程同实施例1，不同的是，称取提取物500克，加注射用水约4000ml，搅拌速度为100转/分，搅拌时间为10分钟，溶解后冷藏12小时，过滤，加入丙二醇800ml，加热溶解，加入氯化钠45克，搅拌速度为50转/分，搅拌时间为15分钟，溶解，用20％NaOH溶液15ml，调至PH9.0，补水至5000ml，精滤(0.45μm微孔滤膜)，灌封，100℃流通蒸汽灭菌45分钟。制得49瓶，收率为98％，灯检合格率为100％。
通过高效液相色谱图分析，其有效成份的含量为：绿原酸含量平均值为0.12mg/ml；肉桂酸含量平均值为0.035mg/ml；蜕皮甾酮含量平均值为0.01mg/ml；滨蒿内酯含量平均值为4.5μg/ml；总黄酮含量平均值为1.8mg/ml。
                          实施例5
同实施例4，不同的是加入丙二醇50ml，用20％NaOH溶液10ml，调至PH8.6。
                          实施例6
水煮、醇沉、乙酸乙酯萃取过程同实施例1，不同的是，称取提取物500克，加注射用水约2500ml，搅拌速度为100转/分，搅拌时间为10分钟，溶解后冷藏16小时，过滤，加入丙二醇1500ml，加热溶解，加入氯化钠45克，搅拌速度为50转/分，搅拌时间为15分钟，溶解，用20％NaOH溶液15ml，调至PH8.8，补水至5000ml，精滤(0.45μm微孔滤膜)，灌封，100℃流通蒸汽灭菌45分钟。制得49瓶，收率为99％，灯检合格率为100％。
从以上各项主要技术指标看，脉络宁注射液工艺稳定，各项指标符合标准规定。
尽管对本发明已作了详细的说明并引证了一些具体实例，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。