可增强表皮细胞中层粘蛋白5的产生的物质及其用途 【技术领域】
本发明涉及化妆品或皮肤科学技术领域，尤其涉及含有可提高表皮细胞中层粘蛋白5的产生能力、并能清洁人的皮肤基底膜、防止皮肤老化的物质的皮肤外用组合物。本发明还涉及使用上述组合物来防止或改善皮肤老化的方法。
背景技术
作为可增强表皮细胞中层粘蛋白5的产生能力的药剂，一直以来为人们所知的都是源自大豆的调制物、或溶血卵磷脂、溶血磷脂酸等(特开平11-343226号、特开平2000-226308号公报)。但是，考虑到有多种机制参与皮肤的正常特性及功能的维持，因此，如果可能的话，希望提供一种可能与上述药剂或调制物属于不同范围、或源于不同起源的、能够提高表皮细胞中层粘蛋白5的产生能力的物质。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种可能含有与上述溶血卵磷脂等属于不同范围的化合物、且能增强上述层粘蛋白5的产生能力的物质，以及含有该物质的抗皮肤老化组合物，及将该组合物施用个体皮肤时可防止或改善局部施用处皮肤老化地方法。
本发明的发明人针对可解决这些技术课题的各种各样的物质进行了促进上述层粘蛋白5的产生能力的调查。结果发现，在已知具有毛发抑制作用、炎症治愈作用以及抗变异原性作用等的(分别参照特开平11-322548号、特开平2-282332号、及特开平2000-226332号)含有异黄酮糖苷、三类萜或单宁等的芒柄花提取物、含有香豆素、香豆酸等的木樨提取物、以及含有皂角苷等的小豆提取物等中，根据情况被施加特有的提取操作后的物质能够增强延长上述层粘蛋白5的产生能力，而且能够防止并改善导致皮肤老化原因之一，即能够防止并改善皮肤“滋润度”和“张力”的下降。
并且，本发明的发明人发现，分别以具有抗氧化作用等(特开平6-24937号)、细胞激活作用等(特开昭60-23325号)、细胞激活作用等(特开平7-138179号)、胶原产生促进作用或酪氨酸酶抑制作用(特开平9-87164号)、透明质酸产生促进作用或酪氨酸酶抑制作用(特开平10-29923号、特开平9-30950号)以及同样具有透明质酸产生促进作用或酪氨酸酶抑制作用(特开平10-29924号、特开平9-30950号)而广为人知的葛根提取物、甘草提取物、射干提取物、糖胶树(ジタノキ)提取物、青牛胆(イボツヅラフジ)提取物、以及胡芦巴提取物中选出的植物提取物中，根据情况被施加特有的提取操作后的物质，具有增强层粘蛋白5的产生能力，且与上述芒柄花提取物一样，能够防止或改善皮肤的老化。此外，可以确认在非源于植物的乳清提取物中也存在同样的活性。
并且，由于葛根提取物(通过使用50％乙醇由葛根得到的提取物)具有促进真皮成纤维细胞的胶原合成的作用，因此有报告指出其“有望成为具有改善皮肤皱纹作用的原材料”(参照H.Mori等，日本化妆品技术者会、2000年、大阪、预稿集、p.25-27)。在这个预稿集中记载的促进上述胶原合成的活性成分为4＇，7-DHIF(4＇，7-二羟基异黄酮)。
并且，由于葛根提取物中含有的异黄酮糖苷(例如，8-β-D-吡喃葡萄糖-7-羟基-3(3＇，4＇-二羟基苯)-4H-1-苯并吡喃-4-酮)在使用酶的评价体系中具有消去活性酶的作用，因此也有报告指出其有助于抗皮肤老化(如特开平4-282305号公报)。
另一方面，本发明的发明人发现，就发明人所知从未作为皮肤外用剂的有效成分使用的植物提取物，即选自罂粟科伯克尼亚属植物、四棱豆属(Psophocarpus)植物、决明(Cssia)属植物、百金花(Erythaea)属龙胆百金花(Canchalagua、学名：智利百金花(Erythraeachilensis)或龙胆百金花(Gentiana canchalagua))的植物的提取物也能够增强延长上述表皮细胞中层粘蛋白5的产生能力、进而防止或改善皮肤老化。
因此，通过本发明，可以提供一种防止或改善皮肤老化的组合物，该组合物含有有效量的可增强表皮细胞中层粘蛋白5的产生能力的物质、以及通常配合于化妆品或药品的皮肤外用剂的该物质以外的成分。
该组合物中的该物质是选自植物提取物或乳清提取物的一种或一种以上，但大豆的种子的提取物除外。
此外，本发明还提供了用于调制防止或改善皮肤老化的配合物的该物质的使用。
并且，提供了一种防止或改善皮肤老化的方法，该方法含有在希望防止或改善皮肤老化(如抑制皱纹的形成或改善皱纹)的个体(如人)的皮肤上局部施用有效量的该物质。
【附图说明】
图1是通过TEWL值比较，来显示后述的(IV)四棱豆提取物对由UVB造成的皮肤皱纹形成的抑制效果的图表。
图2是通过皮肤厚度的比较，来显示该抑制效果的图表。
图3是通过以依据皱纹的视觉判断标准表的皱纹得分，来表示该抑制效果的图表。
实施发明的最佳形态
层粘蛋白5是位于表皮和真皮的边界部分、被称为表皮基底膜的由各种糖蛋白质以及蛋白聚糖构成的结构体的主要成分(Rousselle等、J.Cell Biol.114、567、1991)。众所周知，层粘蛋白5由于基因异常时，会导致产生缺损和表皮水泡症，层粘蛋白5是表皮与真皮结合时必须的蛋白质(Aberdam等、Nat.Genet.，6、299、1994)。并且，众所周知，层粘蛋白5能够促进表皮基底膜的形成(Tsunenaga等、Matrix Biology 17、603、1998)。层粘蛋白5的作用不仅限于理论。具体的说，层粘蛋白5有助于正常的基底膜结构或其机能的维持或修复，通过修复由于日常生活中紫外线、干燥等外在应力(stress)、以及精神压力等内在应力而导致的基底膜的结构变化，能够延缓皮肤老化的进程。换言之，增强上述层粘蛋白5的产生能力，有助于维持人皮肤基底膜的正常结构，而且有助于防止或改善皮肤老化。本发明的发明人确认本发明的抗老化剂有助于增强表皮细胞中的层粘蛋白5的产生，并有助于防止或改善皮肤老化。而“抗老化”意味着防止、改善与老化或光老化引起的基底膜的结构变化的蓄积相伴随的皮肤机能的降低，具体而言就是防止、改善皮肤的皱纹、松弛、硬化等。
本发明中所述“芒柄花根”是由芒柄花(刺柄芒柄花(Ononis spinosaL.))(豆科：Leguminosae)或其同源(相同)植物的根茎及根构成的、被称为芒柄花根的植物体。因此，所谓芒柄花根提取物是指利用以1，3-丁二醇、乙醇为首的低级烷醇等，从这样的植物体(一般可以得到生药)中提取出来的提取物。但是，上述芒柄花根提取物，即使是利用其他提取法，从芒柄花根的根茎及根以外的植物体提取得到的提取物，只要遵循本发明的目的，也可以包含在本发明中所述的“芒柄花根提取物”的范围内。
并且，所谓“木樨”意味着草木樨(西洋エビラハギ)(例如黄香草木樨(Melilotus officinalis L.)等)(豆科：Leguminosae)或其相同的植物的全草生药名草木樨。因此，所谓木樨提取物是指利用以乙醇为首的低级烷醇、丙二醇、1，3-丁二醇等低级烷二醇，从草木樨的全草中提取得到的提取物。而且，即使是从并非草木樨的全草的任一植物体部分中提取得到的提取物，只要该提取物遵循本发明的目的，那么就包含在本发明所述的“木樨提取物”范围内。
并且，所谓“豆芽”是指将大豆(Glycine max Merill)或绿豆(Phaseolus radiatus L.)或小豆(红小豆(Phaseolus angularis Wight))等的(豆科：Leguminosae)植物、或毛蔓小豆(ブラツクマツペ)、萝卜、紫花苜蓿、荞麦等的种子发芽培育出的植物体。因此，豆芽提取物是指利用在各种溶剂从这些物质提取出的东西。
小豆(アズキ)提取物是指在水或其他溶剂中从小豆(红小豆(Phaseolus angularis Wight))或其同源植物的种子中提取出的物质。作为这样的提取物中优选的物质，可以举出化妆品类别配合成分规格的小豆末。
此外，本发明的植物提取物中，优选使用丙酮、丁酮等的C1-C6烷基-C1-C6烷基酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等的C2-C6烷酸C1-C6烷基酯作为提取溶剂得到的植物提取物。
并且，在本发明说明书中使用的“同源植物”是指例示的种或株的自然变种或近源的植物，且该植物与例示的种或株具有同样的有效成分。
此外，本发明中所述源于葛(毛葛(Pueraria hirsuta Matsumura)或中国葛(P.lobata.Ohwi)或野葛(P.thunbergiana Benth))的提取物中，优选源于葛根[被称为(Kakkon)或Puerariae Radix](这是将葛的储藏根切细后干燥得到的。可以使用市场上出售的以药典记载的药品(局方品)为首的生药)。这样的提取物一般优选基本上利用包含无水甲醇或乙醇的C1-C6低级烷醇提取得到的提取物。
并且，在上述Mori等的预稿集或特开平4-282305号公报中记载的、利用含水乙醇等水性溶剂从葛根得到的异黄酮类及异黄酮糖苷[例如，4＇，7-DHIF(或大豆黄酮(daidzein))、以及大豆黄酮苷(daidzin)(大豆黄酮-7-葡萄糖苷)及葛根素(Puerarin)(大豆黄酮-8-葡萄糖苷)等的糖苷]中，几乎没有或者说完全没有认识到本说明书中所述的增强层粘蛋白5产生能力的作用。但是，上述按照本发明利用基本上不含水的甲醇或乙醇等提取出的级分，不管是不是含有上述异黄酮类或异黄酮糖苷，都具有增强层粘蛋白5的产生能力的作用。这里，“基本上不含水”是指即使含水，最多只能含有10％的水，优选为最多含有5％，更为优选为最多含有3％。这意味着按照本发明得到的提取物，尤其是葛根本身及源于葛根的提取物中，作为显示层粘蛋白5产生能力的增强活性的有效成分，与上述糖苷等相比其有意义之处在于：含有亲油性更高的、分别具有如下结构式的羽扇豆醇(lupeol)及异降香醇(isobauerenol)。
羽扇豆醇
异降香醇
因此，依照本发明源于葛(毛葛(Pueraria hirsuta Matsumura))及其同源植物(例如中国葛、野葛)的根的提取物、尤其是由葛根(Kakkon或Pueraria Radix)本身或由葛根得到的级分，例如在室温下利用甲醇或乙醇对葛根进行提取操作得到的提取物，并将这样得到的提取物分配到水和基本上与水未混合的有机溶剂(如乙酸乙酯)的混合溶剂中，由有机溶剂相得到的级分，或者利用基本上与水未混合的有机溶剂(例如正丁醇)从上述分配后的水相中提取得到的级分，其中一般上述羽扇豆醇和/或异降香醇丰富的物质，是实现本发明的目的时比较优选的。当然也可以将羽扇豆醇和/或异降香醇的精制品作为源于葛的提取物使用。
甘草提取物，也优选化妆品类别配合成分规格的甘草提取沫、甘草提取液或甘草类黄酮(油溶性甘草提取物)。当然，由甘草(光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)或乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensisFisher))或其同源植物的根提取得到的物质，只要符合本发明目的，就包含在本发明所述的甘草提取物范围内。除上述化妆品类别配合成分规格品之外，局方品甘草粗提取物、局方品甘草提取物等也都可以使用。
射干提取物是利用各种溶剂将射干(Belamcanda chinensis DC.)及其同源植物的根茎的干燥物(生药名射干)提取得到的物质。
糖胶树提取物、青牛胆提取物、胡芦巴提取物都是在日本等自生的植物，分别将糖胶树(Alstonia scholaris、别名トバンノキ)、青牛胆(结瘤青牛胆(Tinospora tuberculata Beumee))、胡芦巴(香胡芦巴(Trigonella foenum-graecum))或它们的同源植物的叶、茎、枝、花、树皮、种子、果实、根茎或植物全草等与提取溶剂一起浸渍或加热回流后，过滤浓缩获得。在本发明中使用的植物的提取溶剂，只要是通常用于提取的溶剂就可以，可以使用上述烷醇(或乙醇)类、酯类、乙二醇类等的有机溶剂、或根据需要使用上述有机溶剂与水的混合液。典型的是糖胶树提取物用乙醇提取其树皮得到的，青牛胆提取物是用1，3-丁二醇提取其全草得到的，胡芦巴提取物是用乙醇提取其种子得到的。
另一方面，乳清提取物是通过利用酸和乙醇对哺乳动物的乳清进行处理，除去不溶物后得到的源于乳清的成分构成的。哺乳动物的乳清优选是将乳汁脱脂后，用氟镁石过滤后得到的物质。乳清优选由人、牛、山羊、绵羊以及猪的乳清中选出的一种或二种以上。
以上提取物一般是在乙醇等中再稀释后作为本发明中的有效成分、或将干燥物直接作为本发明的有效成分，或者将干燥物再溶解于乙醇等中作为本发明的有效成分。
而且，在本发明中可以使用、且从未用作皮肤外用剂的植物提取物的原料植物如下。
罂粟科伯克尼亚(Bocconia)属植物的典型例可以举出原生于密歇根的黄皮木树(Palo amarillo)(学名：亚伯利伯克尼亚(Bocconiaarborea))；四棱豆属植物的典型例可以举出原生于日本的四棱豆(学名：四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus))；决明属(Cassia)植物的典型例可以举出原生于尼泊尔的雷塔马(Retama，学名：刺决明(Cassia spinecens H.))；豆科百金花属龙胆百金花(Canchalagua)(学名：智利百金花或龙胆百金花)则可以举出原生于秘鲁的植物。其中，四棱豆又被称为翼マメ(ウイングドビ一ン)、牛角花(ミヤコグサ)。
上述植物的提取物是将上述植物的叶、茎、枝、花、树皮、种子、果实、根茎或植物全草等和提取溶液一起浸渍或加热回流后，过滤浓缩得到的。在本发明中使用的提取溶剂只要是通常用于提取的溶剂就可以，其中尤其优选甲醇、乙醇等醇类、根据情况也可以单独使用含水醇类、以及丙酮、和乙酸乙酯等有机溶剂或上述物质的组合。这样得到的提取液直接、或用乙醇等稀释后就可以配合于本发明中使用的组合物，或者将提取液的干燥物直接、或再溶解于乙醇等中，就可以配合于本发明中使用的组合物。
关于本发明中的有效成分提取物，可作为其起源的植物在前面已经举例说明了，但即使是源于这些植物的近源的种或株(同源植物)的提取物，如果是具有等于或大于后述特定提取物的表皮细胞中层粘蛋白5的产生能力的物质，那么就被本发明的有效成分包含。
以上的植物提取物或乳清提取物依照本发明形成组合物或皮肤外用剂的配合量，根据其剂型不同，其最适合量有所变动，因此无法限定，但是可以将其限定在由于该配合本发明所期望达到的效果没有受到影响这一比较宽的范围内。关于该配合量。如有必要，最好根据后述的层粘蛋白5的产生能力的评价方法，对各提取物的活性预先进行评价。所谓“如有必要”是指这些提取物由于原料的采摘场所、时期等原因，其有效成分的含量有时会不固定。但是，以包含上述局方品、化妆品类别配合成分规格品的生药的形式在市场上出售的植物提取物，一般来说，其中与本发明有关的有效成分的含量基本上比较固定。
本发明中的组合物或皮肤外用剂如果是适合皮肤外用或皮肤局部施用的剂型的话，那么不管是什么样的剂型都可以，一般来说软膏、雪花膏、乳液、化妆水、面膜(パツク)、沐浴剂等都可以。
本发明中的组合物或皮肤外用剂，与上述剂型相适应，此外根据需要，除上述一种或一种以上的必须成分之外，还可以根据需要适当配合用于化妆品或药品等的皮肤外用剂的成分，如其他的层粘蛋白5产生促进剂、抗老化药剂、保湿剂、防氧化剂、油性成分、紫外线吸收剂、表面活性剂、增稠剂、防腐剂、乙醇类、pH调整剂、洗涤剂、干燥剂、乳化剂、粉末成分、着色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂、香料等。这些东西的配合方法可以按照它们自身已知的方法进行。
此外，还可以适当配合依地酸二钠(エデト酸ニナトリウム)、依地酸三钠(エデト酸酸ナトリウム)、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属封闭剂、咖啡因、单宁、戊脉安、凝血酸及其衍生物、各种生药、乙酸维生素E、甘草酸(グリチルリチン酸)及其衍生物或其盐、甘草次酸(グリチルレチン酸)衍生物、水杨酸衍生物、溶血卵磷脂或溶血磷脂酸、大豆调制物等的层粘蛋白5产生促进药剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类、熊果苷、曲酸等美白剂、ノニル酸ワレニルアミド、烟酸苄酯、烟酸β-丁氧基乙酯、辣椒素、姜辣素、斑蝥属酊、鱼石脂、咖啡碱、单宁酸、α-茨醇、烟酸维生素E、烟酸肌醇酯、环扁桃酯、肉桂苯哌嗪、妥拉苏林、乙酰胆碱、戊脉安、顶花防己碱、γ-谷维素等血液促进剂、硫磺、2，7-二甲基噻蒽等的抗脂漏剂，出于多种目的，还可以适量配合目柏醇、氧化锌、尿囊素、郁金香提取物、柴胡提取物、百里香提取物、射干提取物、棕儿茶提取物、山毛榉芽提取物、酪蛋白水解物、米提取物水解物、米糠提取物、桃仁提取物、クララ提取物、硫基牛磺酸、亚牛磺酸、甘牛至草提取物、二氧化硅处理的锌、鹿蹄草提取物、木糖醇、藻蛋白宁及其盐酸盐、羟基木栓酮、黄柏提取成分、黄连提取成分、紫草根提取成分、芍药提取成分、当药提取成分、桦木提取成分、鼠尾草提取成分、枇杷提取成分、胡萝卜提取成分、芦荟提取成分、锦葵提取成分、鸢尾提取成分、葡萄提取成分、薏苡仁提取成分、丝瓜提取成分、黄瓜提取成分、藏红花提取成分、川芎提取成分、生姜提取成分、小连翘提取成分、迷迭香提取成分、大蒜提取成分、辣椒提取成分、地榆提取物、陈皮、当归等、维生素A、乙酸维生素A等的维生素A类、维生素B2、丁酸维生素B2、黄素腺嘌呤核苷酸的等的维生素B2类、维生素B6盐酸盐、ピリドキシンジオクタノエ一ト等的维生素B2类、L-抗坏血酸、L-抗坏血酸二棕榈酸甘油酯酸酯、L-抗坏血酸-2-硫酸钠、L-抗坏血酸磷酸酯、DL-α-维生素E-L-抗坏血酸磷酸二酯钾等的维生素C类、泛酸钙、D-泛酸泛酰醇、泛醇、泛乙醚(パントテニルエチルエ一テル)等的泛酸类、维生素D2、维生素D3等维生素D类、烟酸、烟酰胺、苯甲基烟酸等的烟酸类、α-维生素E、乙酸维生素E、烟酸DL-α-维生素E、琥珀酸DL-α-维生素E等的维生素E类、维生素P、维生素H等的维生素类。
这样调制出的本发明的组合物或皮肤外用剂，其中含有的上述有效成分对人体皮肤基本上不会产生坏的影响，因此可以每日1次或1次以上施用于皮肤，并可以接连几天施用。并且，可以通过志愿者等的协助进行简单的实际使用试验后，再决定适当的施用时间表。
以下边举具体的实施例，边对本发明进行说明，单本发明不仅限于以下的例子。
(I)植物提取物的调制例
作为植物提取物，一般非市场上出售的代表性调制例如下所示。
(I-1)黄皮木树提取物
在室温下将黄皮木树的木质部分50g浸渍到乙醇中1周，浓缩提取液，得到乙醇提取物7.2g。
(I-2)四棱豆提取物
在室温下将シカクマメ的种子部分50g浸渍到乙醇中1周，浓缩提取液，得到乙醇提取物4.6g。
(I-3)莴苣提取物
在室温下将莴苣的花及枝部分50g浸渍到乙醇中1周，浓缩提取液，得到乙醇提取物3.0g。
(I-4)カンチヤラグア提取物
在室温下将カンチヤラグア的全草50g浸渍到乙醇中1周，浓缩提取液，得到乙醇提取物5.2g。
(I-5)源于葛根的提取或精制级分的调制
室温下用甲醇提取葛根(Puerariae Radix局方品、1000g)，得到提取物(80g)(以下也称葛根提取物)。将得到的提取物用水-乙酸乙酯分配，水相中再加入正丁醇，再次进行溶剂分配。分别将得到的乙酸乙酯相、及正丁醇相减压除去溶剂，得到乙酸乙酯级分(18g)、正丁醇级分(38.5g)。再通过正相和反相硅胶柱将乙酸乙酯级分1g分离精制，得到羽扇豆醇(24mg)、异降香醇(8mg)。
(II)关于层粘蛋白5的产生能力的评价试验及其结果
(1)表皮角质细胞的培养
表皮角质细胞是从人的包皮分离出、在钙浓度较低的表皮细胞生长培养基(KGM)中培养的。在上述培养基中添加了牛脑下垂体提取液和EGF。细胞在KGM中被培养到第4代后，通过胰蛋白酶EDTA处理使得贴壁细胞悬浮，通过过滤除掉细胞的聚合体，得到均匀的细胞悬浮液。通过离心分离收集细胞，使其在DMEM-F12(2∶1)-0.1％BSA中再次悬浮，使浓度达8×104/ml。将上述细胞悬浮液加入到含有0.5ml、2倍浓度的被检试剂的同一培养基0.5ml中。培养时使用24孔板，在37℃下进行24小时。培养结束时，将培养上清移到EP管中，10000rpm离心5分钟，将上清移到新管中，在-20℃下将其保存到测定层粘蛋白5的时候。此外，为了让细胞内和培养塑料上结合的层粘蛋白5可溶，要往各个孔里添加包含各种表面活性剂的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(PH7.4)，在-20℃下保存1晚。次日，进行超声破碎，然后再次冻结。次日，再次溶解后，在10000rpm下进行5分钟离心分离，将上清移入管中，在-20℃下将其保存到测定层粘蛋白5的时候。
(2)利用夹心ELISA法测定层粘蛋白5
利用夹心ELISA法测定存在于培养上清、细胞层中的层粘蛋白5。在96孔ELISA板的固层上结合相对于层粘蛋白5的层粘蛋白α3链的单克隆抗体、BM165。以层粘蛋白5为夹心进行测定，使用预先生物素化(b-6F12)的、相对于层粘蛋白β3链的单克隆抗体作为另一种抗体。在本方法中，只对可发挥作用的异质三聚体(α3β3γ2)进行测定，不检测异二聚体(β3γ2)。往预先加入了含有b-6F12的3％明胶(ゼチランリン)·磷酸缓冲溶液的各孔中添加被检试剂。该试剂的孔内的最终稀释率为，培养液1/4，细胞层1/10。抗原抗体反应在37℃下进行2小时，洗涤板后添加抗生物素蛋白HRP(辣根过氧化物酶)溶液，然后再反应30分钟至1小时。洗涤后，加入HRP的底物ABTS溶液，利用ELISA酶标仪(プレ一トリ一ダ一)测定405nm的吸光率。在0～40ng/ml范围内作成校正曲线。
层粘蛋白5的产生量通过计算培养基中游离的量和细胞层中残存的量的总和，以相对于未添加植物提取物的试剂(对照)的相对值的形式显示出来。
(3)结果
结果如下表1所示。此外，源于葛根提取物的级分的试验结果，如下表2(本发明)及表3(比较例)所示。
表1被检试剂 浓度 ％相对于无添加对照的层粘蛋白5的相对的 产生量(％)(比较)积雪草提取物 0.01 56.5(本发明)芒柄花根提取物 0.01 151木樨提取物 0.01 122豆芽提取物 0.01 120小豆提取物 0.01 174葛根提取物 0.01 245甘草提取物(类黄酮级分) 0.01 141甘草提取物(类黄酮级分) 0.01 118甘草提取物 0.001 105射干提取物 0.001 103糖胶树提取物 0.01 239青牛胆提取物 0.01 216胡芦巴提取物 0.01 143乳清提取物 0.0001 108黄皮木树提取物 0.01 310四棱豆提取物 0.01 272莴苣提取物 0.01 173カンチヤラグア提取物 0.01 152
表2上述I的(I-5)中葛根提取物的进一步处理或精制级分的活性(本发明)被验试剂浓度(μ M)相对于无添加对照的层粘蛋白5的相对的产生量(％)丁醇级分 10 118 100 182乙酸乙酯级分 1 126 10 209羽扇豆醇 0.1 122 1 154异降香醇 1 132 10 137
表3葛根中含有的异黄酮类的活性(比较例)被验试剂浓度(μM)相对于无添加对照的层粘蛋白5的相对的产生量(％)大豆黄酮*1)(daidzein) 1 93 10 99 100 74糖苷*2) 1 93 10 95 100 99
*1)：由BIOMOL Research Labs.公司得到。
*2)特开平4-282305号公报记载的8-β-D-吡喃葡萄糖-7-羟基-3-(3’，4’-二羟苯乙基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮
(III)使用芒柄花根提取物的皮肤老化症状改善效果确认试验及其结果
这次的试验中，我们选择了22名年龄在40-68岁之间(平均年龄51岁)的健康女性志愿者作为试验对象，她们的皱纹、细小皱纹的形成或皮肤的弹力下降比较明显。我们对这22名女性志愿者进行了后述实施例1的雪花膏的连用试验(早晚2次，持续4周)。试验结束时在恒温、恒湿度下对以下皮肤特征进行测定，与连用前(使用无芒柄花根提取物配合的化妆品时)进行比较。
测定项目
用硅复制物(シリコ-ンレプリカ)(Silflo，FLEXICODEVELOPMENTS公司制)提取外眼角的复制物，测定皱纹的数目、长度。
使用コルネオメ一タ(Courage & Khazaka公司制)测定角蛋白水分量。
使用キュ一トメ一タ(Courage & Khazaka公司制)测定皮肤的粘弹性。按照常用方法，反复进行3次2秒钟的吸引及1秒钟的开放，就第1次和第3次的皮肤的伸长(Uf值)及粘性/弹性比率(Uv/Ue值)与连用前进行比较。
此外，对使用胶粘带提取到的角层的脱落情况、皮肤纹理的整齐程度、角层的均匀脱落情况在专门化验盘上进行视觉判断。然后针对连用前后的皮肤状态，作一个问卷调查。
结果(与连用前的比较值)
·复制物的解析结果(检测；Paired Student t-test)
皱纹数-8％(p＝0.003)
皱纹长度-9％(p＝0.010)
实施例1的雪花膏的抗皱纹效果在统计学上被认为是显著的。
·角蛋白水分量(检测；Paired Student t-test)
+22％(p＝0.0001)
实施例1的雪花膏的保湿效果在统计学上被认为是显著的。
·皮肤粘弹性(检测；Paired Student t-test)
Uf(maximal amplitude，第1次)-21％(p＝0.0063)
Uf(maximal amplitude，第3次)-29％(p＝0.0007)
Uv/Ue-28％(p＝0.002)
可以确认，通过使用实施例1的雪花膏，皮肤的弹性显著增加了。
·纹理(检测；Paired Wilcoxon test)
纹理的整齐程度(Skin Network Sharpness)+23％
(p＝0.0022)
角蛋白的均匀脱落情况(Skin Surface Aspect)+33％
(p＝0.0001)
实施例1的雪花膏的皮肤纹理改善效果被认为是显著的。
·针对志愿者进行的问卷调查的结果
在以下的项目中，感觉到有效果的人的比例
皮肤的柔软度 91％
皱纹的减少 45％
细小皱纹的减少 77％
纹理改善效果 77％
柔和感提高 82％
弹性提高 73％
皮肤的光滑度 82％
皮肤的改善效果 95％
与以往使用的产品(无芒柄花根提取物
配合的化妆品)相比哪个更有效果 90％
由以上可知，实施例1所示的含有芒柄花根的雪花膏由于具有抗皱纹、保湿·柔软性、弹性增加、纹理改善的效果，因此是非常优良的抗老化雪花膏。此外，由于其安全性也得到了确认，因此几乎所有的志愿者都感觉它比以往使用的无芒柄花根配合的化妆品更有效果。
(IV)四棱豆提取物的UVB对皮肤的皱纹形成的抑制效果的评价
试验及其结果
关于四棱豆的甲醇提取物(参照上述(I)的(I-2))，我们对UVB对皮肤的皱纹形成的抑制效果进行了评价。我们将无毛老鼠分作以下3组，每组5只，分组时尽量使其在体重、皮肤状态方面无偏颇。
未处理组(未照射UV、未涂覆药剂组)
UV照射+溶剂(80％乙醇)涂覆组
UV照射+1％(w/v)四棱豆乙醇提取物涂覆组(调制成80％乙醇溶液)
老鼠的皱纹形成，通过部分改变往老鼠背部反复照射UVB这一施瓦兹等的方法(*1)来进行。按照常用方法，往UV照射组的老鼠(4周大)背部照射UVB(光源：东芝电子制东芝FL-20SE荧光灯)，每周照射3次，共照射10周(*2、*3)，每周涂覆100μl的药剂5次。在UVB照射日时，为了避免被验物质被UV吸收的影响，在UV照射后再涂覆药剂。此外，用乙醇清拭背部，保证皮肤表面上没有残留药剂后再进行UV照射。开始时的照射量为36mJ/cm2/次，第2周以后逐渐增加，第10周时增加到216mJ/cm2/次。总照射量为4.6J/cm2。
UV连续照射开始10周后，测定照射部位的经皮水分蒸腾量(TEWL)、皮肤厚度，通过t检测进行上述各组的比较(图1、图2)。TEWL使用Tewameter(Courage & Khazaka公司制)，UV引起的皮肤肥厚度的测定使用Peacock，Dail Thickness Gauge(尾崎制作所制)。
接着，给老鼠背部拍照，接着使用对ビセツト等人的方法(*4)的一部分进行了改变的方法，即在将动物的组名隐藏的状态下，依据如下表4中显示的皱纹生成程度的判断标准打分(图3)。这一工作由3名测定者个别进行，对于组间的得分，进行了Mann-Whitney的U检测。
表4
皱纹的视觉判断标准表
分数：判断标准
0：看不到皱纹。
1：比2的皱纹浅、短、或数目少。
2：能看到浅皱纹。
3：比2的皱纹深或长。比4的皱纹浅、短或数目少。
4：在整个皮肤表面上都能看到浅的皱纹。
5：比4的皱纹深或长。比6的皱纹浅或短。
6：能看到深而长的皱纹。
7：增加了比6深且长的皱纹。比8的皱纹浅或短。
8：在整个皮肤表面上都能看到深且长的皱纹。
由图1可知，相对于溶剂(80％乙醇)涂覆组(对照)的TEWL值显著上升，四棱豆提取物的涂覆组一直在显著抑制该上升，因此对于光引起的皮肤阻挡的错乱，具有恢复促进的效果。
此外，由图2可知，与UV对照组形成的皮肤肥层相反，在四棱豆提取物的涂覆组中，一直在进行显著的抑制。
并且，由图3可知，溶剂(80％乙醇)涂覆组形成了较深的皱纹。与此相反，本发明中的四棱豆涂覆组中，皱纹的形成则得到了明显的抑制，在统计学上被认为是显著的。
由以上叙述可知，四棱豆提取物具有防止甚至抑制紫外线引起的皮肤异常的效果。
参考文献
1.Haratake A，Uchida Y，Schmuth M，Tanno O，Yasuda R，Epstein JH，Elias PM和Holleran WM：UVB诱导的渗透性屏障功能的改变：表皮超增殖和胸腺细胞介导的应答的作用，J.invest.Dermatol.108：769-775，1997。
2.Naganuma M，Yagi E和Fukuda M：在UVB照射的无毛小鼠上延缓了色素点的产生，J.Dermatol.Sci.25：29-35，2001。
3.Schwartz E：紫外线照射的无毛小鼠的皮肤中连续的组织转变，J.Invest.Dermatol.91：158-161，1988。
4.Bissett DL，Hannon DP和Orr TV：阳光老化皮肤的动物模型：紫外线照射的无毛小鼠皮肤的组织学、物理和可见的改变，Photochemistry and Photobiology 46：367-378，1987。
本发明的组合物或皮肤外用剂的实施例
实施例1雪花膏
(处方)
A.环美卡因 10.0重量％
辛酸十六(烷)基 5.0
三十碳烷 10.0
甜杏仁油(メドウフオ一ム) 3.0
四氢四甲基环四硅氧烷 5.0
聚二甲硅油 3.0
quatenarium-18 hectorite 2.0
香料 适量
依地酸盐 0.1
聚乙二醇6000 1.0
甘油 5.0
一缩二丙二醇 5.0
凝血酸 0.5
抗坏血酸磷酸镁 0.1
透明质酸钠 0.01
L-藻蛋白宁盐酸盐 0.01
芒柄花根提取物 0.1
柴胡(ミシマサイコ)根提取物 0.1
对羟基苯甲酸甲酯 0.2
离子交换水 余量
往均匀地分散A成分的油相部分中徐徐添加室温下溶解的B成分，利用高速搅拌机使其分散。
实施例2防皱雪花膏
(处方)
硬脂酸 2.0重量％
硬脂醇 7.0
含水羊毛脂 2.0
三十碳烷 5.0
2-辛烷基十二醇 6.0
聚氧乙烯(25摩)十六醇醚 3.0
甘油单硬脂酸酯 2.0
丙二醇 5.0
木樨乙醇提取物 0.05
郁金香乙醇提取物 0.05
亚硫酸氢钠 0.03
羟苯二酯 0.3
香料 适量
离子交换水 余量
(制法)
往离子交换水中加入丙二醇，加热保持在70℃(水相)。混合其他成分加热溶解保持在70℃(油相)。往水相中加入油相，进行预乳化，利用高速搅拌机将其均匀乳化后，边仔细搅拌冷边冷却至30℃。
实施例3雪花膏
(处方)
固体石蜡 5.0重量％
蜂蜡 10.0
凡士林 15.0
液体石蜡 41.0
甘油单硬脂酸酯 2.0
聚氧乙烯(25摩)山梨聚糖 2.0
肥皂粉 0.1
硼砂 0.2
豆芽丙酮提取物 0.05
柴胡乙醇提取物 0.05
亚硫酸氢钠 0.03
羟苯二酯 0.3
香料 适量
离子交换水 余量
(制法)
往离子交换水中加入肥皂粉和硼砂，加热溶解，保持在70℃(水相)。混合其他成分加热溶解保持在70℃(油相)。边往水相中混合，混合时要逐渐添加进行反应。反应结束后，利用高速搅拌机使其均匀乳化，乳化后边仔细搅拌边冷却至30℃。
实施例4雪花膏
(处方)
(A相)
硬脂酸 10.0重量％
硬脂醇 4.0
硬脂酸丁酯 8.0
硬脂酸单甘油酯 2.0
维生素E乙酸 0.5
维生素A十六碳烷酸酯 0.1
澳洲坚果油(マカデミアナッツ油) 1.0
防腐剂 适量
香料 适量
(B相)
甘油 4.0
1，2-戊二醇 3.0
氢氧化钾 0.4
抗坏血酸磷酸镁 0.1
L-藻蛋白宁盐酸盐 0.01
EDTA三钠 0.05
小豆乙醇提取物 0.1
葛根1，3-丁二醇提取物 0.5
离子交换水 余量
(制法)
将A的油相部和B的水相部分别加热到70℃完全溶解。将A相加入到B相中，利用乳化机乳化。使用热交换器冷却乳化物。
实施例5乳液
(处方)
硬脂酸 2.5重量％
凡士林 5.0
液体石蜡 10.0
聚氧乙烯(10摩)单油酸酯 2.0
聚乙二醇1500 3.0
三乙醇胺 1.0
羟基乙烯聚合物 0.05
(商品名称：卡波普(カ一ボポ一ル)941，B.F.Goodrich Chemicalcompany)
甘草乙酸乙酯提取物 0.01
亚硫酸氢钠 0.01
对羟基苯甲酸乙酯 0.3
香料 适量
离子交换水 余量
(制法)
在少量的离子交换水中溶解羟基乙烯聚合物(A相)。往剩余的离子交换水中加入聚乙二醇1500和三乙醇胺，加热溶解保持在70℃(水相)。混合其他成分加热溶解保持在70℃(油相)。将油相加入到水相中，进行预乳化，加入A相，利用高速搅拌机搅拌，使其均匀乳化，乳化后一边仔细搅拌混合，一边冷却到30℃。
实施例6乳液
(处方)
(A相)
三十碳烷 5.0重量％
油酸油酯(オレイルオレ一ト) 3.0
凡士林 2.0
倍半油酸山梨聚糖酯(ソルビタンセスキオレイン酸エステル)
0.8
聚氧乙烯油酯(20EO) 1.2
月见草油 0.5
防腐剂 适量
香料 适量
(B相)
1，3-丁二醇 4.5
メリツサ乙醇抽出液 1.5
乙醇 3.0
羟基乙烯聚合物 0.2
氢氧化钾 0.1
L-藻蛋白宁L-天冬酰胺酸盐 0.01
射干乙醇提取液 1.5
ジタノキ1，3-丁二醇提取液 0.01
赤藓醇 0.5
六偏磷酸钠 0.05
离子交换水 余量
(制法)
将A的油相部和B的水相部分别加热到70℃完全融解。往B相中加入A相，用乳化机乳化。利用热交换器使乳化物冷却。
实施例7凝胶
(处方)
95％乙醇 10.0重量％
一缩二丙二醇 15.0
聚氧乙烯(50摩)油醇醚 2.0
羟基乙烯聚合物(商品名：卡波普940，B.F.Goodrich Chemicalcompany) 1.0
氢氧化钠 0.15
L-藻蛋白宁 0.1
青牛胆50％乙醇水溶液提取物 7.0
胡芦巴90％乙醇水溶液提取物 0.5
2-羟基-4-甲氧基二苯酮磺酸钠 0.05
乙二胺四乙酸·3钠·2水合物 0.05
对羟基苯甲酸甲酯 0.2
香料 适量
离子交换水 余量
(制法)
在离子交换水中均匀地溶解卡波普940，另一方面在95％乙醇中溶解青牛胆50％乙醇水溶液提取物、胡芦巴90％乙醇水溶液提取物、溶解聚氧乙烯(50摩)油醇醚，添加到水相中。然后，加上其他成分后用氢氧化钠、L-藻蛋白宁中和增稠。
实施例8美容液
(处方)
(A相)
乙醇(95％) 10.0重量％
聚氧乙烯(20摩)辛基十二醇 1.0
泛乙醚 0.1
黄皮木树甲醇抽出物 1.5
对羟基苯甲酸甲酯 0.15
(B相)
氢氧化钾 0.1
(C相)
甘油 5.0
一缩二丙二醇 10.0
亚硫酸氢钠 0.03
羧乙烯基聚合物(カルボキシビニルポリマ) 0.2
净化水 余量
(制法)
分别将A相、C相均匀溶解，往C相中加入A相，使其可溶。然后加入B相后，进行填充。
实施例9化妆水
(处方)
(A相)
乙醇 5.0重量％
POE油醇醚 2.0
油醇 0.1
2-乙基己基-P-二甲基氨基苯甲酸酯 0.18
香料 适量
(B相)
1，3-丁二醇 9.5
甘油 2.0
吡咯烷酮羧酸钠 0.5
烟碱酸 0.3
四棱豆1，3-丁二醇提取物 0.1
β-环糊精 1.0
赤藓醇 0.05
离子交换水 余量
(制法)
往B的水相中添加A的醇相，使其可溶得到化妆水。
实施例10面膜
(处方)
(A相)
一缩二丙二醇 5.0重量％
聚环氧乙烷(60摩尔)硬化蓖麻籽油 5.0
(B相)
レタマ100％乙醇提取物 0.01
カンチヤラグア乙酸乙酯抽出物 0.1
橄榄油 5.0
维生素E 0.2
对羟基苯甲酸甲酯 0.2
香料 0.2
(C相)
亚硫酸氢钠 0.03
聚乙烯醇
(皂化度90，聚合度2,000) 13.0
乙醇 7.0
净化水 余量
(制法)
分别将A相、B相、C相分别均匀溶解，往A相中加入B相，使其可溶。然后再加入到C相后，进行填充。
实施例11固体粉底
(处方)
滑石 43.1重量％
陶土 15.0
绢云母 10.0
氧化锌 7.0
二氧化钛 3.8
PMMA球状粉末 5.0
黄色氧化铁 2.9
红色氧化铁 1.40
黑色氧化铁 0.2
三十碳烷 8.0
异硬脂酸 4.0
单油酸POE山梨聚糖 3.0
辛烷酸异十六烷 2.0
芒柄花根乙醇提取物 0.5
防腐剂 适量
香料 适量
(制法)
用混合机将滑石～黑色氧化铁底粉末成分充分混合，将三十碳烷～辛烷酸异十六烷的油性成分、芒柄花根乙醇提取物、防腐剂、香料加入到其中，进行充分混炼，填充到容器中成型。
实施例12乳化型粉底(雪花膏型)
(处方)
(粉状部)
二氧化钛 10.3重量％
绢云母 5.4
陶土 3.0
黄色氧化铁 0.8
氧化铁红 0.3
黑色氧化铁 0.2
(油相)
十甲基环戊硅氧烷 11.5
液体石蜡 4.5
聚氧乙烯改性二甲基聚硅氧烷 4.0
(水相)
净化水 50.0
1，3-丁二醇 4.5
葛根100％乙醇提取物 1.5
倍半油酸山梨聚糖酯 3.0
防腐剂 适量
香料 适量
(制法)
将水相加热搅拌后，添加充分混合粉碎了的粉状部，进行均质混合处理。然后加入加热混合后的油相，进行均质混合处理后，边搅拌边添加香料，冷却至室温。
工业上的利用
如上所述，本发明的组合物或皮肤外用剂具有优良的层粘蛋白5产生增强作用，对伴随老化或光老化等引起的基底膜结构变化而产生的皮肤的皱纹、松弛、硬化等皮肤功能下降具有良好的效果，并且能够使肌肤维持有弹性或健康的状态。因此，本发明在提供了这些组合物的化妆品或医药制造业方面具有可利用性。