耐盐碱短芒大麦品种的育种方法 【技术领域】
本发明所属生物技术
背景技术
我国自50年代以来，由于人口激增，对资源的需求越来越大，在盲目经营管理下，农牧业独立经营，农田单一种植，广种薄收，非宜耕地的草原大量开垦，草原过度放牧利用，致使生态平衡失调，生态系统严重受损，生态环境恶化。受损农田生态系统表现为土壤盐碱化、沙化、贫瘠化，地力严重衰退，产量下降高达20％，有些土地甚至不能耕种，河流两岸出现滩涂地；受损草原生态系统表现为草地严重超载过牧，出现大面积退化、沙化和盐碱化，“三化”面积达70％以上(牧草产量由50年代每公顷2000公斤下降到目前的每公顷200-400公斤)，特别是碱斑面积日趋扩大，由50年代的10％，增加到现在的30-70％，每年还以2.8％的速率递增。积于地表的盐碱在春天常形成“白风暴”，污染环境，侵袭农田，导致生态的恶性循环，严重危害着农牧业生产的持续发展，威胁着人民的生活。每年冬春都因饲草短缺造成家畜大量死亡。草原地区约有50％以上的贫困户是由于土地盐碱荒漠化造成的。因此，急需大量适宜当地耐盐碱的优良牧草，对盐碱化草地进行治理，使生态环境得到改善、经济得到持续发展，增加农牧民的收入，使农牧民尽快脱贫致富。
在二十世纪五十年代，人工诱变育种技术的研究首先在欧美等国家开展起来，主要采用的方法有60Co辐射、γ射线及中子处理等，从而有效地获得了许多有价值地突变体。目前采用的离体诱导育种技术主要包括物理辐射和化学诱变，现已培育出有价值的突变体300多个，前苏联已推广近30个，包括大麦、小麦和向日葵等。印度用60Co照射小麦培育成BHP28、BHP31、BHP15等耐盐突变体材料，很适应于盐碱地种植和作为耐盐碱试验的亲本材料。最近二十年来，人们将组织和细胞培养技术与诱变技术相结合，在筛选耐盐突变体的研究方面取得了可喜的进展。Nabors等以烟草品种Sam Sun的悬浮细胞为材料，用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)处理后，获得最高耐0.8％NaCl的细胞系，并从耐0.64％NaCl的细胞系中得到再生植株。Hosegawa用烟草品种Wiscebsin38茎段愈伤组织的悬浮培养细胞，直接接种于含不同浓度NaCl的液体培养基中，获得能在1.2％NaCl中生长的细胞系。另外，人们还用同样的技术获得了水稻、苜蓿、小麦、大麦、烟草、甘蔗、番茄、燕麦和大豆等植物的耐盐碱突变体。近十几年来，植物基因工程育种技术得到很大发展，打破了物种间生殖隔离的障碍，把外源目的基因转入植物细胞，既丰富和扩大了基因资源，又达到了定向育种的目的。自1983年第一个转基因植物问世以来，许多有益的目的基因被用于农作物的育种和新品种改良，获得了大批如抗虫棉、抗虫玉米和抗病毒马铃薯的新品种。这些成果的取得，标志着生物工程育种技术已经成熟，开始进入了一个新时代。
目前，国内外应用现代生物技术手段，已经培育出了近百种植物数千个新品系或新品种。但是，有关短芒大麦育种方面的研究尚未见报道。多年来，我们一直致力于牧草和作物育种、栽培及草地综合治理的研究，现已建立了一整套短芒大麦组织培养再生体系；建立了细胞悬浮培养再生植株体系；建立了一整套短芒大麦突变体诱变体系；获得了一批有价值的短芒大麦突变体材料。在前郭县草原站进行田间试验，得到27份耐盐碱材料，在大连、河北昌黎、海南岛、中国农业科学院抗逆室等地种植，进行抗逆性试验，统计分析各材料的生物学性状，结合脯氨酸含量测定、电导率测试、同工酶分析、耐盐稳定性检测等，综合鉴定结果表明，短芒大麦在pH11.0、含盐量1.2％的盐碱地上均能良好生长，并正在进行大面积种植和推广应用中。短芒大麦新品种已被中国科学院植物研究所正式纳入联合申请国家高新技术研究发展计划，并被中国农业科学院品种资源所长期保存。应用现代生物技术选育耐盐碱短芒大麦新品种的研究，属国内外研究的先进水平。
我国在耐盐碱牧草品种的选育方面已取得一些成绩，如羊草和碱茅等，但羊草抗旱性强，耐盐碱能力差，碱茅耐旱性差，耐盐碱能力强，生产能力低，每个品种都存在一定的不足。
【发明内容】
耐盐碱短芒大麦品种的选育主要解决了现有牧草品种的耐盐碱性能和抗旱能力的问题，使两方面抗逆性能同时在一个牧草品种中体现出来，即抗旱、耐盐碱，同时具有耐寒、耐瘠等优点。
1.根据植物细胞全能性的理论，以现代生物工程技术手段(包括植物组织培养、物理和化学诱变)对离体培养的短芒大麦幼穗、幼胚、成熟胚等的愈伤组织和悬浮细胞系进行突变体诱导和分化。
2.在盐碱的环境条件下，依据短芒大麦的育种目标，对离体培养所获得的再生植株的愈伤组织，进行农艺性状筛选和分子生物学鉴定，选育可用于短芒大麦育种或牧草生产的新材料或新品系。
3.常规育种，结合常规育种方法，选育出耐盐碱性更强的短芒大麦新品种。
短芒大麦为多年生疏丛型禾草，具短根茎，须根稠密，疏丛状，直立或基部膝曲状，株高70～90cm。叶片线形绿色或常绿色，长7～18cm，宽3～7mm，上面粗糙，背面光滑，叶鞘短于节间。穗状花序，四棱形，绿色或成熟时带紫色，穗长7.0～8.6cm，每节生有小穗3枚，有柄，颖呈针形，外稃无芒，中间小穗无柄，外稃顶端渐尖成短芒，内稃与外稃等长，颖果长约3mm，顶端有毛。播种当年发育慢，大部处于营养状态，仅个别抽穗开花，但不能结籽成熟，第二年抽穗开花，种子成熟。生育期110～130d，结实率46.67％。种子成熟一致，结实性好，但易落粒，应注意收获期。
分蘖力和生殖力均较强，达40～70个，稳产、高产，品质较好，粗蛋白含量达10.68％，干草产量10564.3kg/hm2，产籽量600～800kg/hm2，在生活第1年比对照增产43.3％，第2年增产77.0％，第3年增产102.2％，第3年短芒大麦的增产幅度显著高于第1年，主要原因是短芒大麦新品种耐盐碱能力强和越冬率高，越冬后对照区断垄缺苗严重，而短芒大麦新品种很少有断垄缺苗现象。适应性较强，抗旱、耐寒、耐瘠和耐盐碱，适宜在湿润的平原生长，在下湿地、滩地生长良好，在湖畔碱湿地和盐碱地当含盐量不超过1.2％、pH值11.0时也能生长，在北方可安全过冬，耐践踏，适宜放牧。在吉林，辽宁，黑龙江，内蒙，河北，山东，陕西，宁夏，甘肃，新疆，四川等地均可种植。
短芒大麦营养价值高，开花期含水分13.24％，粗蛋白质15.30％，粗脂肪3.43％，粗纤维26.20％，无氮浸出物37.44％，粗灰分6.42％。叶柔软，适口性好，消化率高，各种家畜喜食，是适于放牧的优良牧草，亦可调制干草，调制干草以在抽穗期刈割为宜。
秋季深翻土地，播种前再耕耙一次。春、夏、秋皆可播种，如有灌溉条件或春墒较好，可行春播，否则可在夏季或秋季雨后播种。播种量每亩1.5～2.0公斤，播种深度3～4cm。一般条播，行距15～30cm，播后镇压。当小苗长出3～4片真叶时，进行中耕除草2～3次。刈割宜在抽穗期进行，留茬宜稍高，一般7～9厘米，以利再生和越冬。有灌溉条件的地区，分别在分蘖期、拔节期和刈割后各灌溉1次，增产效果明显。穗易折断，落粒性强，采种田宜在60～70％种子成熟时采收。在生长的第二年，每亩追施氮肥10～15公斤。
短芒大麦(Hordeum brevisublatum)是解放军军需大学植物基因工程研究中心运用生物工程育种技术，对离体培养的野大麦幼穗、幼胚和成熟胚等的愈伤组织和悬浮细胞系进行突变体诱导和分化，并结合常规育种方法培育而成的多年生耐盐碱优良牧草品种，在含盐量0.8-1.2％、pH值9.5-11.0的盐碱土上均生长良好，其耐盐碱能力超过羊草，抗旱性强，比碱茅耐旱，同时具有耐寒、耐瘠等优点。分蘖力和生殖力均较强，稳产、高产、品质较好，粗蛋白含量达15.30％，干草产量10564.3kg/hm2，产籽量600-800kg/hm2，是治理盐碱化草地最理想的草种。
【附图说明】
图1为本发明的选育技术路线图
【具体实施方式】
实施例
(一)植物组织培养、诱导及分化
1、愈伤组织的诱导和培养
(1)幼穗愈伤组织的诱导
选取未出旗叶的幼穗，用70％的酒精棉球擦3次，然后在无菌条件下，用镊子取出幼穗。选择长3.0～6.0cm左右的幼穗，将其剪成5mm左右的小块，接种于诱导培养基上，一瓶中放入8～10块，置于25±1℃，黑暗条件下培养，诱导愈伤组织。
幼穗的诱导培养基：MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
(2)幼胚愈伤组织的诱导
取受粉后12～15天左右的麦穗，用镊子取出幼胚放于70％的酒精中漂洗40秒钟，然后移入0.1％的氯化汞溶液中浸洗15分钟，再用无菌水冲洗5次。用镊子或解剖刀损伤幼胚后，接种于诱导培养基中，置于25±1℃，黑暗条件下培养，诱导愈伤组织。
幼胚的诱导培养基：MS+2.4-D1.5mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
(3)成熟胚愈伤组织的诱导
取当年成熟的种子，用解剖刀切下胚，室温下浸泡三到五小时，在70％的酒精中灭菌1分钟，再在0.1％的氯化汞溶液中漂洗20分钟，然后用无菌水冲洗5次，用解剖刀将胚损伤后，置于25±1℃，黑暗条件下诱导愈伤组织。
待愈伤组织形成后，每个月继代培养1次。继代时，选取色泽新鲜，白色或淡黄色的、质地紧密的且表面具有颗粒状结构的胚性愈伤组织进行培养，培养温度25±1℃，光照强度100Lux，每天人工光照10小时。
成熟胚的诱导培养基：MS+2.4-D4.0mg/L+CH300mg/L+Sucrose30mg/L+Agar0.7％。
2、悬浮细胞系的建立
选取淡黄色、颗粒状、易碎的胚性愈伤组织来建立悬浮细胞系。取3～5g新鲜的胚性愈伤组织、放入装有20ml培养液的、容量为100ml的三角瓶中，置入旋转式摇床上，在转速为120转/分钟，温度为25±1℃的散射光条件下，振荡培养。
根据悬浮培养物的生长状态，来调整继代周期和稀释比例。最初，每隔5天换1次新鲜培养液。换液时，先将三角瓶静置1分钟，小心吸出上层培养液，然后加入等量的新鲜培养液。换液时，还应注意去掉褐化死亡的愈伤组织块。
待悬浮培养液变得比较浑浊，较大的愈伤组织块分散成2mm以下的细胞团块后，以1份悬浮培养物：1份新鲜培养液的比例稀释，进行继代培养1次。随着细胞生长速度的加快，适当增加稀释比例。
为了提高悬浮培养物的分散度和均质性，用孔径500μm的尼龙网过滤悬浮培养物，去掉较大的细胞团块，同时缩短继代周期，每3天继代培养1次，进行强化培养。
当建立均质、分散的胚性悬浮系后，以1∶4稀释比例继代培养，每7天继代1次，保持悬浮系。
悬浮细胞系的诱导、继代培养基：MS无机盐+CH1000mg/L+L-pro500mg/L+肌醇250mg/L+有机附加液+2.4-D2.0mg/L+Sucrose30mg/L
有机附加液：VB15mg/L+VB65mg/L+Gly2mh/L+烟酸5mg/L配成100x的贮备液。
3、悬浮细胞系的诱变处理及耐盐愈伤组织的筛选
选取三瓶生长状态较好的悬浮细胞系，分别加入1.5％的甲基磺酸乙酯溶液，使其最终浓度为0.3％，然后放在旋转摇床上分别培养(E1)0.5小时，(E2)1.5小时，(E3)2.5小时，处理完毕后，静止2分钟。倒掉上清液，然后用无菌水冲洗2次，再用悬浮培养液换洗2次最后将诱变处理后的悬浮细胞系置于原来的培养条件下培养3天。然后吸取该悬浮培养细胞，培养于筛选培养基上，进行耐盐愈伤组织的筛选。
4、悬浮细胞系和耐盐愈伤组织的分化
(1)悬浮培养细胞的植株再生
先将细胞团培养于MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％的固体培养基上，培养5周后，将其形成的白色愈伤组织转入分化培养基，在25℃光照条件下培养，诱导分化。
悬浮细胞系的分化培养基：MS+ZT0.5mg/L+KT1.0mg/L+Sucrose20mg/L+Agar0.7％。
(2)耐盐愈伤组织的分化
筛选出耐盐愈伤组织，经继代培养3次后，其中部分耐1.2％NaCl的愈伤组织转入不同的分化培养基中，在25℃光照条件下诱导分化。将获得再生植株渐次移入砂中、花盆中，然后再移栽于盐碱地中，直接进行耐性检测，当年成熟的种子，部分继续播种，部分进行苗期的耐盐性鉴定。
耐盐愈伤组织的筛选、继代培养基：MS+2.4-D2.0mg/L+CH500mg/L+Sucrose30g/L+Agar0.7％再加入不同浓度的NaCl(0.4％、0.8％、1.2％)，分别用P1，P2，P3表示3个继代培养基。
耐盐愈伤组织的分化培养基：
a：MS+NAA1.0mg/L+BA0.5mg/L+GA33.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％。
b：MS+IAA0.5mg/L+GA3 2.0mg/L+KT1.0mg/L+NaCl1.2％+Sucrose15mg/L+Agar0.7％。
以上所有培养基PH5.8-6.0，在121℃，15磅压力下，灭菌18-20分钟。
营养液是MS的液体形式。
注：缩略语
MS：Murashige和Skoog培养基(1962)
CH：水解酪蛋白
Sucrose：蔗糖
Agar：琼脂
L-pro：L-脯氨酸
Gly：甘氨酸
2.4-D：2.4-二氯苯氧乙酸
ZT：玉米素
KT：激动素
NAA：α-萘乙酸
BA：6-苄基嘌呤
GA3：赤霉素
IAA：吲哚乙酸
5、种子的Co-60γ射线辐射处理
取当年成熟的种子，分成4等分，分别用4个不同的诱变剂量对照(CK)，1万勒克斯(第1组)、3万勒克斯(第2组)、5万勒克斯(第3组)的Co-60γ射线诱变处理，处理后的种子清洗后，分别播种于总含量为0.796％pH8.9的盐碱地，进行耐盐变异体的筛选。播种时，垅长3m，宽20cm，每条垅的播种量75g，于六月中旬播种，八月上旬对其出苗率进行统计。
(二)常规育种及筛选
1、选择优良单株，混合脱粒，下年混合种植
通过观测再生植株在盐碱地上的生长发育状况、产草量和耐盐碱能力，从中选择生长良好、产草量高和适应性强的优良单株，混合脱粒，下年进行混合种植。
2、第二次选择优良单株，混合脱粒，下年混合种植
将上一年混合脱粒的种子，进行混合种植，从中选择生长良好、产草量高和适应性强的优良单株，混合脱粒，下年进行混合种植。
3、继续选择优良单株，混合脱粒，下年混合种植
将上一年混合脱粒的种子，进行混合种植，从中选择生长良好、产草量高和适应性强的优良单株，混合脱粒，下年进行混合种植。
4、如此连选5代，直到混合群体符合标准将上一年混合脱粒的种子，进行混合种植，如此连选5代生长良好、产草量高和适应性强的优良单株，混合脱粒，直到混合群体符合标准。