槐属物种的提取物，它们的生产方法和用途 本发明涉及槐属(Sophora)物种的提取物，它们的生产方法和它们用于预防和治疗由雌激素缺乏或与性激素有关的代谢、特别是雌激素代谢调节障碍所导致的病症的用途。
妇女在40岁左右出现不规律的月经周期，这标志着绝经期的开始。这种内分泌系统变化的时期称为更年期，它可能持续十年或更长。它是卵泡生长衰竭和对促性腺激素反应降低的结果。卵泡缺乏的结果是雌激素的生产降低并最终完全停止。伴随它可能会产生多种症状，如潮热、抑郁、焦虑、精神错乱、失眠等。除此之外，雌激素生产的降低还可能引起严重的健康问题，如骨质疏松、心功能不全、脑梗塞(中风)和癌症。
虽然采用雌激素的激素替代疗法对于缓解与更年期有关的不适是非常有效的，但许多研究表明乳腺癌和子宫癌、心血管疾病和肝代谢改变的风险增加可能与这种治疗有关。通过施用孕激素可以降低癌症的风险。但是，孕激素的保护作用似乎随着长期使用而削弱，并且认为激素替代疗法(HRT)与35-40％的乳腺癌风险增加有关。由于存在这些副作用以及对这种类型治疗可靠性地明显怀疑，已趋于拒绝在40岁以上的绝经后妇女中使用HRT药物。据估计仅大约20％的绝经后美国妇女接受HRT，其中仅有40％持续治疗1年以上。
已在许多植物中发现了在人或动物中具有雌激素-激动作用或可与雌激素相互作用的物质。已发现了至少20类不同的具有雌激素/抗雌激素性能的物质，它们来自16个科的植物中的300种以上的植物。大部分已知的植物雌激素属于异黄酮、木脂素或Cumestane家族。仅在最近，又发现了一种高效的植物雌激素——8-异戊烯基柚配基(S.R.Milligan等人；Journal of Clin.Endocrinol.Metab.(临床内分泌代谢杂志)84，2249-2252[1999])。通过刺激Ishikawa-Var-I细胞内的碱性磷酸酯酶测试了8-异戊烯基柚配基的体内雌激素效力。结果发现8-异戊烯基柚配基比长期以来为人们所熟悉的植物激素如cumesterol、genistone或黄豆苷明显具有更大活性，且产生的作用仅微弱于17β雌二醇。
对美国、欧洲、中国和日本人群的流行病控制研究已表明在随食物一起摄入植物雌激素与多种肿瘤，特别是乳腺癌和前列腺癌的出现之间存在密切的负相关关系。还在动物实验中证明了植物雌激素对乳腺和前列腺肿瘤细胞生长的抑制作用。植物雌激素的保护性能显然是基于大量不同的生物学特征，而这些生物学特征在这些合成和天然雌激素的组合之间是有区别的。依赖于剂量和内源激素的状况，植物雌激素还具有雌激素作用或者甚至抗雌激素作用。其它的生物学作用包括，例如抑制酪氨酸激酶、DNA拓扑异构酶、核糖体s6激酶、鸟氨酸脱羧酶、芳香酶或5α还原酶。此外植物雌激素通常还具有抗氧化性能，而且显然所有这些不同作用的总和在抑制肿瘤的出现和生长中起作用(Tham等人，Journal of Clin.Endocrin.Metab.(临床内分泌代谢杂志)83，2223-2235[1998])。
本发明的目的是提供适于预防和治疗由雌激素缺乏或与性激素有关的代谢、特别是雌激素代谢调节障碍导致的病症的植物提取物。
本发明的另一目的是提供一种这些提取物的生产方法。
根据本发明，这些目的通过使用根据权利要求1-9的槐属(Sophora)物种提取物，根据权利要求10-20的该提取物的生产方法，根据权利要求21的药物制剂，以及根据权利要求22-24的提取物的用途得以实现。
传统中医药中已知许多槐属物种(豆科)的根可以药用。这些物种是苦参(Sophora flavescens)、山豆根(S.subprostrata)、苦豆子(S.alopeouloides)、槐树(S.japonica)、广豆根(S.tonkinensis)、绒毛槐(S.tomentosa)、砂生槐和S.leachiana。其中，苦参是特别重要的一种。因此，它可见于中国药典(“苦参”，中国药典9/1997)并传统用于治疗腹泻、胃肠出血和湿疹(W.Tang，G.Eisenbrand，Chinese Drugs of PlantOrigin(中国植物药)，Springer verlag，Berlin 1992)。
苦参根，以及其它槐属物种的根，包含喹诺里西啶(chinolizidine)生物碱作为它们的一个主要成分。中国药典规定生物碱的总滴定含量不可以低于2％。主要生物碱为苦参碱和氧化苦参碱。
除生物碱以外，在苦参和相当一些其它槐属物种的根中还发现了大量的黄酮类化合物和相关化合物以及三萜皂甙。
关于苦参以及单个成分或成组的成分的多种药理学性能已有记载。具体地讲，认为生物碱与抗心律失常、抗组胺和止咳作用以及抗溃疡作用有关(Tang和Eisenbrand，见上述)。还观察到了抗肿瘤作用和免疫抑制性能。
M.Kuroyanagi等人，Journal of Natural Products(天然产物杂志)1999，62(12)1595-1599，报道了来自苦参的抗菌和抗雄激素的类黄酮化合物。已发现实际上所有从苦参中分离出的异戊烯基黄酮衍生物均表现出抗雄激素作用。
W.M.Mazur等人，Nutritional Biochemistry(营养生物化学)1998，9，193-200，报道了对槐树种子中异黄酮化合物芒柄花黄素、鸡豆黄素、大豆黄素、genistone和cumestrol及木脂素类化合物闭联异松脂醇和罗汉松脂素的定量测定，除此之外还研究了其它的豆科种子。
在毒理学方面，苦参和槐树归类为毒物。具体而言，认为苦参碱类型的生物碱是有毒的(T.Blaszczyk，Deutsche Apotheke Zeitung 2001，141[14]，1687-1696)。在临床试样中，在槐属生物碱的情况下观察到毒性作用如严重的心悸、呼吸困难和痉挛。在动物研究中，氧化苦参碱表现出毒性作用(K.-C.Huang，The Pharmacology of Chinese Herbs(中草药药理学)，CRC出版，Boca Raton，1993)。
EP 0 998 924 A1描述了一种抗肿瘤治疗剂，它包含可从植物中获得的具有拓扑异构酶II-抑制作用的化合物。因此，在实施例8中包括关于从槐属中获得leachinol A的的描述。在此实施例中，用丙酮和甲醇连续回流提取槐属的干粉。减压浓缩丙酮提取物并与水混合。使用粗苯、乙酸乙酯和正丁醇对所得的混合物进行增量分配提取。减压浓缩乙酸乙酯提取液，以这种方式获得残余物。采用硅胶色谱法，使用粗苯-丙酮溶剂混合物纯化如此得到的残余物；在此操作中获得leachianol A。实施例8中描述的乙酸乙酯提取物不同于本发明提取物之处是根据本发明获得的提取物包含macchian，并大量地富集macchian苷(大约5倍)。在这些化合物中，我们对与本发明提取物的效力有关的成分进行处理，本发明者借助实施例5的雌激素受体结合试验第一次能够表明这一点。EP0 998 924 A1没有建议使用槐属物种的提取物来预防和治疗由雌激素缺乏或与性激素有关的代谢、特别是雌激素代谢调节障碍所导致的病症。
本发明特别优选的槐属物种是苦参和山豆根，因为在本发明的上下文中已发现它们的水-醇根提取物具有令人惊奇的强大的雌激素作用。可以通过进一步分离和纯化而富集这些水-醇提取物。结果是所观察到的药理学作用是由于提取物中存在的以下异黄酮化合物的相互作用而导致的：genistone和大豆黄素、黄酮类化合物如8-异戊烯基柚配基、苦参醇X、8-异戊烯基樟脑醇、leachianon G和苦参醇E、查耳酮类化合物和紫檀烷类化合物(pterocarpanes)如macchian和macchian葡糖苷，以及其它未鉴定的类黄酮化合物。在这一点上，还应该提及由本发明者最新发现的查耳酮：下式的2，4，4′，6′-四羟基-3′-熏衣草基-2′-甲氧基查耳酮。
图1显示苦参和山豆根的70％[v/v](62％[w/w])乙醇提取物(根据实施例1a)和2a))在酵母试验中与17β雌二醇相比的雌激素作用。
图2显示来自苦参和山豆根的本发明提取物(用乙酸乙酯分配之后的70％[v/v]或62％[w/w]乙醇提取物；根据实施例1b)和2b))在酵母试验中与17β雌二醇相比的雌激素作用。
图3显示来自苦参的本发明提取物(根据实施例3用乙酸乙酯分配之后的60％[w/w]乙醇提取物)在酵母试验中与17β雌二醇相比的雌激素作用。
一般可以通过以下方法获得类似的提取物：用中等极性的溶剂提取，这些中等极性的溶剂选自醇的水溶液、酮的水溶液和酯，包括含水或水饱和的酯，除去溶剂然后在有机溶剂和水之间进行液-液分配。
根据本发明，提供了一种槐属物种的提取物，它可以通过以下步骤获得：
a)用选自下列的溶剂对槐属物种进行一次或多次提取；
i)醇的水溶液和酮的水溶液；和
ii)酯，包括含水或水饱和的酯；
b)除去在步骤a)i)中得到的醇或酮溶液中的溶剂；
c)i)将步骤b)中得到的残余物在选自乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、正丁醇和丁酮的有机溶剂和水之间进行一次或多次分配，然后合并如此得到的溶剂相；或者
c)ii)用水直接对在步骤a)ii)中得到的乙酸乙酯提取液进行一次或多次分配；和
d)将步骤c)中得到的合并的有机溶剂相浓缩至干。
每次提取时药物与溶剂的比例范围为大约1∶7至1∶10。
在一个优选的实施方案中，步骤a)的提取进行两次。
步骤a)中所用的溶剂应该优选选自乙醇水溶液、丙酮水溶液和含水或水饱和的乙酸乙酯。具体而言，步骤a)所用的溶剂为70％[v/v](62％[w/w])乙醇、60％[w/w]乙醇或水饱和的乙酸乙酯。
步骤a)i)中所用的醇或酮优选以10-96％[v/v]或[w/w]，或者10-99％[v/v]或[w/w]，特别是50-92％[v/v]或[w/w]的含水混合物的形式应用。
在步骤c)i)中，乙酸乙酯为优选的溶剂。
在该方法的步骤c)中，所发生的情况是基本上使总生物碱含量稀少。可通过本发明获得的提取物的特征是它的总生物碱含量低于0.2％，优选低于0.1％。具体而言，通过本发明获得的提取物不含生物碱。在本文中，术语“不含生物碱的”意指使用标准分析方法如HPLC法无法检测到生物碱。而且本发明的提取物的特征还在于包含黄酮、异黄酮、查耳酮和紫檀烷类化合物。黄酮化合物可以是异戊烯基化的，如柚配基的异戊烯基衍生物。如果需要的话，异黄酮化合物可以是一、二或三羟基取代的或O-甲基化的。此外，该提取物可以包含苷化的黄酮和异黄酮化合物。具体而言，本发明的提取物包含macchian、macchian葡糖苷、8-异戊烯基柚配基、苦参醇X、8-异戊烯基樟脑醇、leachianon G、苦参醇E和2，4，4′，6′-四羟基-3′-熏衣草基-2′-甲氧基查耳酮。
可以从如下槐属物种之一生产该提取物：苦参、山豆根、苦豆子、槐树、广豆根、绒毛槐、砂生槐和Sophora leachiana；优选苦参或山豆根。
可以根据本发明获得的提取物可以与常规的药学上可接受的添加剂一起加工成药物制剂如胶囊、薄膜片剂(film tablets)或包衣片，其中，作为常规的药学上可接受的添加剂，可以使用填充剂、粘合剂、分散剂和用于薄膜片剂和包衣片的包衣以及作为胶囊赋形剂的油或脂肪。
可根据本发明获得的提取物可以用于预防和治疗由雌激素缺乏或与性激素有关的代谢、特别是雌激素代谢调节障碍所导致的病症。
这些病症可以选自属于以下种类的病症：更年期不适、性激素依赖性癌症、良性前列腺增生、骨质疏松、阿耳茨海默氏病和心血管疾病，这里的癌症包括乳腺癌、前列腺癌和子宫癌。
根据本发明的提取物可以每天1-1000mg，优选每天100-1000mg的剂量应用于人。
根据本发明，可以通过使用包括黄酮、异黄酮、查耳酮、紫檀烷和其它特别适于治疗由雌激素缺乏或与性激素有关的代谢、特别是雌激素代谢调节障碍所导致的病症的类似化合物的组合而进行治疗。
以下实施例描述了本发明，不应将其看作是对本发明的限定。除非另外特别指出，所有百分比详细数据均是指重量。
实施例1：苦参提取物的生产
a)提取
将2kg磨碎的苦参根与14kg 70％[v/v](62％[w/w])的乙醇混合，旋转(Ultraturrax)提取5分钟，然后在50℃下剧烈搅拌1小时。接着用Supra Seitz 1500过滤器将其抽滤，然后以相同的方式再次提取药渣。合并两份提取溶液并使用等分试样测定干燥提取物含量。结果得到475.6g干燥残余物，其对应的产率为23.8％。
b)分配
50℃下在旋转蒸发器中除去提取溶液中的乙醇。将含水残余物(5升)与乙酸乙酯一起搅拌三次，每次2升乙酸乙酯，合并乙酸乙酯相并用旋转蒸发器浓缩至干。
乙酸乙酯提取物＝67.84g(以药材计为3.4％；以总提取物计为14.3％)
根据HPLC分析，乙酸乙酯提取物包含黄酮、异黄酮、查耳酮、紫檀烷类化合物(如8-异戊烯基柚配基、大豆黄素、苦参醇X、norkurarinon、macchian、genistone、8-异戊烯基樟脑醇)。没有生物碱的迹象。
这种物质的组合优选适于预防和治疗由雌激素缺乏或与性激素有关的代谢、特别是雌激素代谢调节障碍所导致的病症(比较实施例5)。
实施例2：山豆根提取物的生产
a)提取
将1kg磨碎的山豆根的根与7kg 70％[v/v](62％[w/w])的乙醇混合，旋转(Ultraturrax)提取5分钟，然后在50℃下剧烈搅拌1小时。接着用Supra Seitz 1500过滤器将其抽滤，然后以相同的方式再次提取药渣。合并两份提取溶液并使用等分试样测定干燥提取物含量。结果得到111.8g干燥残余物，其对应的产率为11.2％。
b)分配
50℃下在旋转蒸发器中除去提取溶液中的乙醇。将含水残余物(2.5升)与乙酸乙酯一起搅拌三次，每次1升乙酸乙酯，合并乙酸乙酯相并用旋转蒸发器浓缩至干。
乙酸乙酯提取物＝10.4g(以药材计为1.0％；以总提取物计为9.3％)
实施例3
将36kg磨碎的苦参药材与其重量的7.7倍的60％(w/w)的乙醇混合。剧烈搅拌并在循环中使用Dispax(Ultraturrax)，在50℃下将提取溶液提取1小时。将提取溶液过滤澄清，药渣再次用其重量的7倍的60％(w/w)的乙醇在相同的条件下提取，最后过滤。
然后用离心蒸发器将提取溶液浓缩至乙醇含量为3.5％，而干提取物含量为10.52％。然后将该浓缩的溶液以1∶0.4的体积比对水饱和的乙酸乙酯分配三次。用旋转蒸发器浓缩乙酸乙酯相，并在60℃下在干燥柜中干燥。
结果得到：
乙酸乙酯提取物：研磨后1.188kg(以药材计为3.3％)。
药理学相关物质的HPLC含量
macchian葡糖苷 2.8％
8-异戊烯基柚配基 0.4％
Macchian 0.6％
苦参醇X 1.3％
8-异戊烯基樟脑醇 0.7％
leachianon G 6.6％
苦参醇E 0.3％
2，4，4′，6′-四羟基-3′-熏衣草基-2′-甲氧基查耳酮 0.7％
也有存在大豆黄素和genistone的迹象。没有任何生物碱的迹象。
可以在实施例5的酵母试验中证实所提到的每一种物质的雌激素作用。通过Reportergen试验，使用实施例5的酵母细胞证实提取物的雌激素作用：比较图3。
HPLC法柱LiChrosphere 100 5μm，250×4mm洗脱剂A：1000ml双蒸水/3ml磷酸(85％)/2ml三乙胺B：100ml乙腈/3ml磷酸(85％)/2ml三乙胺/60ml双蒸水梯度％A ％B0分钟70 3030分钟30 7035分钟0 100流速1.2ml/分钟检测220nm
实施例4
用水饱和的乙酸乙酯将150g磨碎的苦参药材提取两次，比率1∶7(m/m)。因此，事先用Ultra-Turrax将药材粉碎5分钟(运动提取)。然后在60℃下将药材回流提取1小时。随后将合并的提取溶液过滤，将如此得到的乙酸乙酯提取液与乙酸乙酯饱和的水以1∶1[v/v]的比率一起振荡两次。将合并的乙酸乙酯相浓缩至干。
产率：以药材计为3.99％。
实施例5：使用表达人α雌激素受体的转染的酵母细胞测试所得到的乙酸乙酯提取物的雌激素作用。
采用Reportergen试验，使用酵母细胞(酵母属)测定提取物的雌激素性能。这些细胞稳定表达人α雌激素受体和一种表达质粒，所述表达质粒含有雌激素响应单元和β半乳糖苷酶的基因。将所有试样以20mg/ml的浓度溶于DMSO，并且将其不经稀释或者在用DMSO以1/10、1/100的比例稀释后以1μl的体积加到96孔平底微滴定平皿中的100μl培养基中。接着，加入100μl酵母悬浮液和显色底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷。在每个平皿上均提供对照孔，所述对照孔仅用培养基或溶剂填充，或者包含标准浓度的17β雌二醇。将酵母细胞在32℃下培养72小时，然后在540nM下在微滴定板光度计中测定培养基的吸收值。有时检测试样两次。
结果：
试样浓度： 稀释度 浓度 未稀释的 100μg/ml 1∶10 10μg/ml 1∶100 1μg/ml
试样命名： 试样号试样 试验编号 槐属物种 A实施例1a)的70％[v/v](62％[w/w])乙醇提取物 1 苦参 B实施例2a)的70％[v/v](62％[w/w])乙醇提取物 1 山豆根 C实施例1a)的70％[v/v](62％[w/w])乙醇提取物 2 苦参 D实施例1b)的乙酸乙酯提取物 1 苦参 E实施例2b)的乙酸乙酯提取物 1 山豆根 F实施例3的乙酸乙酯提取物 1 苦参
在图1、2和3中描述了试验结果。其中，将提取物的雌激素作用与17β雌二醇的作用进行了比较。为此目的，可以称为“有活性的”提取物的是这样的提取物：当与17β雌二醇相比时，其活性与在17β雌二醇活性曲线的明显上升区段范围内(浓度为大约0.1-0.2nM 17β雌二醇)的17β雌二醇的活性相当。
具体而言，图1显示来自苦参和山豆根的70％[v/v](62％[w/w])乙醇提取物(根据实施例1a)和2a))在酵母试验中与17β雌二醇相比的雌激素作用。
图2显示来自苦参和山豆根的本发明提取物(用乙酸乙酯分配之后的70％[v/v]或62％[w/w]乙醇提取物；根据实施例1b)和2b))在酵母试验中与17β雌二醇相比的雌激素作用。
图3显示来自苦参的本发明提取物(用乙酸乙酯分配之后的60％[w/w]乙醇提取物；根据实施例3)在酵母试验中与17β雌二醇相比的雌激素作用。