蛇葡萄素在制备广谱抗病毒药物中的用途 本发明属于天然药物领域。
文献Walter Karrerr，Birkhauser Verlag，Bassel undstuttgart(1958)，P.652，NO：1640公开了蛇葡萄素的结构式，
但是没有对蛇葡萄素的活性进行充分的研究。
本申请人令人惊奇地发现蛇葡萄素在制药领域具有广泛的用途。
本申请人发现蛇葡萄素具有广谱抗病毒作用，特别是抗乙肝病毒、流感病毒和/或冠状病毒。本发明人还发现蛇葡萄素具有降血糖和降血脂作用，可以制备成降血糖药和降血脂药。蛇葡萄素可以直接用作药物，还可以与药学可接受载体或赋形剂混合制成药物组合物。其中优选含有2％至98％重量比的蛇葡萄素，加入药学可接受载体或赋形剂至100％重量比。还可以与现有技术中与蛇葡萄素相配伍的药物活性成分一起配制成药物组合物，其中所述相配伍的药物活性成分优选是黄酮类药物，所述黄酮类药物优选是杨梅素。组合物中黄酮类药物含量与蛇葡萄素含量重量比可以是2-80∶20-98。本发明组合物可以制备成片剂，颗粒剂，胶囊，外用药。优选活性成分对人施用的剂量是0.01-5克/千克体重/天，但是也可以根据具体情况而定，不局限于此范围。
片剂的普通配方可以是：蛇葡萄素10％-90％重量比，乳糖90％-10％重量比，任选地加适量羧甲基纤维素钠，硬脂酸镁，50％乙醇适量。冲剂的普通配方可以是：蛇葡萄素5-100％重量比，(蔗糖+糊精)95-0％重量比，蔗糖∶糊精＝2∶1，任选地加适量其它助剂，总量为100％。胶囊的普通配方可以是：蛇葡萄素10-100％重量比，淀粉90-0％重量比，任选地加适量其它助剂，总量为100％。但是本领域技术人员也可以根据需要用本领域公知的技术和载体配制成其它剂型。
蛇葡萄素可以从蛇葡萄属植物中提取，也可以用上述文献公开的方法制备。所述蛇葡萄属植物包括粤蛇葡萄，栋叶玉葡萄，显齿蛇葡萄，大叶蛇葡萄，白蔹，东北蛇葡萄和山葡萄。所述提取方法可以是：通过各种溶剂(水和/或有机溶剂)煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，煎煮液经浓缩冷却，静置过夜，检测沉淀与上清的药效成分，取具有活性的沉淀，经色谱分离后得到本发明蛇葡萄素。煎煮所用的溶剂优选水，醇类，酯类，酮类，醚类和强极性有机溶剂，更优选低级链烷醇，低级脂肪酸酯，具有3-12个碳原子的酮和醚和/或水，最优选甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，仲丁醇，叔丁醇，乙酸乙酯，乙酸甲酯，甲酸乙酯，丙酮，甲基乙基酮，乙醚，甲基乙基醚，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺和/或水等等。色谱分离填料可以是聚酰胺，聚丙烯酰胺，大孔吸附树脂，阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，优选聚酰胺，聚丙烯酰胺，大孔吸附树脂，更优选聚酰胺。
本发明的原理是通过建立药理筛选模型追踪蛇葡萄素的药效活性，找到其药用用途。体外抑菌试验和抗病毒试验表明蛇葡萄素具有抗菌消炎和广谱抗病毒作用，特别是抗乙肝病毒、流感病毒和/或冠状病毒。试验还证明蛇葡萄素具有降血糖和降血脂作用，具有预防和/或恢复酒精性肝损伤的功能，具有保肝护肝，增强免疫系统免疫力的功能。
蛇葡萄素可以通过药物领域常规配制技术和载体，配制成药物组合物。本发明组合物可以制备成片剂，颗粒剂，胶囊，外用药。但是本领域技术人员也可以根据需要用本领域公知的技术和载体配制成其它剂型。
附图的简要说明
图1是在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服蛇葡萄素治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较。是蛇葡萄素对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA地抑制作用(第一批实验)。
图2是鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片1(第一批实验)。
图3是在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服蛇葡萄素治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较。是蛇葡萄素对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA的抑制作用(第二批实验)。
图4是鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片2(第二批实验)。
图5是在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服蛇葡萄素治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较。是蛇葡萄素对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA的抑制作用(第三批实验)。
图6是鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片3(第三批实验)。
通过下面的实施例详细说明本发明。但是应该理解这些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。
实施例1：片剂：
蛇葡萄素25g，
乳糖53g，
羧甲基纤维素钠1.5g，
硬脂酸镁0.5g，
50％乙醇5ml
上述组分在混合机中混合后压制成片。
实施例2：糖浆
蛇葡萄素100g，
蔗糖20g，
糊精10g，
乙醇50ml
混合上述成分得到糖浆。
实施例3：冲剂
蛇葡萄素55g，
糖粉345g，
糊精145g，
乙醇5ml
上述组分混合后干燥，得到冲剂。
实施例4：胶囊
蛇葡萄素200g，
淀粉20g，
上述组分混合均匀后，装入胶囊。
实施例5：片剂：
蛇葡萄素5g，
杨梅素30g
乳糖53g，
羧甲基纤维素钠1.5g，
硬脂酸镁0.5g，
50％乙醇5ml
上述组分在混合机中混合后压制成片。
实施例6：冲剂
蛇葡萄素520g，
糖粉350g，
糊精150g，
乙醇10ml
上述组分混合后干燥，得到冲剂。
实施例7：蛇葡萄素体外抗乙肝病毒的药效试验
选择乙型肝炎病毒(HBV)DNA转染的2215细胞株，以其培养上清液中HBsAg和HBeAg的滴度作为评价抗HBV效果的指标，研究蛇葡萄素的抗HBV作用。本试验还采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法检测药物对细胞的毒性，选用阿昔洛韦作为阳性对照物。
1.材料与方法
1.1.受试物：含有蛇葡萄素的原料药(其中蛇葡萄素的含量为50％)。
1.1.2阳性药物甘泰或注射用阿昔洛韦(Acyclovir for Injection)，批号：20000409 2，湖北潜江制药股份有限公司生产，鄂卫药准字(1991)第000354号。
1.2细胞与试剂
2215细胞出本实验室保存，培养液为DMEM(Gibco公司)，培养液中含10％胎牛血清，38ug/mlG418(Geneticin，Gibco公司)，0.03％L-谷胺酰胺(华美进口分装)，青、链霉素各式各1000iu/ml。
MTT(瑞士Fluka公司)、二甲基亚砜(DMSO)(Serva公司)
HBsAg、HBeAg试剂盒由上海实业华生科技有限公司提供。批号：08-2000-03，06-2000-02
1.3细胞培养与实验分组
2215细胞按常规方法以103-104个/孔的浓度接种96孔培养板，每孔0.1ml，5％CO2、37℃培养24h后移去培养液，按成含药物的培养液，其中蛇葡萄素设6个浓度：95ug/ml，195ug/ml，385ug/ml，750ug/ml，1500ug/ml，3100ug/ml，阿昔洛韦设6个浓度，即62.5ug/ml、125ug/ml、250ug/ml、500ug/ml、1mg/ml、2mg/ml，每个浓度设5个平行孔，同时设不加药物孔为对照组，培养5天后收获上清液。
1.4药物的细胞毒性测定
用药5天后，吸净各孔上清液，培养孔重新加入含MTT的培养液，使MTT最终浓度为0.5mg/ml、37℃培养4h，弃去培养液，每孔加入100ulDMSO，振荡10min，酶标仪上490nm测定OD值，与相应对照孔的吸光度值(存活细胞为100％)比较，计算存活细胞百分比，确定药物对细胞的最大无毒剂量浓度。
1.5检测
根据药物对细胞的最大无毒剂量浓度向前推出4-5个剂量级，收获各级上清液用于HBsAg和HBeAg的检测，检测按操作说明书进行。
1.6药物抗HBV的评价方法
用药物对HBsAg或HBeAg的抑制率进行评价
2.结果
2.1药物对细胞的毒性
结果发现随着用药浓度的提高，其对细胞的毒性增加，对细胞的最大无毒浓度(存活细胞在90％以上的药物浓度)为750ug/ml，阳性药阿昔洛韦为500ug/ml(表1)。
表1蛇葡萄素对细胞的毒性
药物名称 浓度(ug/ml) 存活细胞(％M±S)
3100 47.50±1.29
蛇 1500 82.70±2.22
葡 750 91.00±1.87
萄 385 91.20±5.72
素 195 93.20±4.92
95 98.60±1.34
2000 76.64±4.96
阿 1000 87.40±1.51
昔 500 92.54±1.76
洛 250 92.76±8.84
韦 125 92.06±4.87
62.5 96.48±4.04
表2药物体外抗HBV试验结果
药物名称 浓度(ug/ml) HbsAg抑制率 HBeAg抑制率
(％M±S) (％M±S)
蛇 95 14.00±3.703 23.61±1.804
葡 195 21.42±2.212 25.60±8.022
萄 385 31.61±8.605 29.47±4.924
素 750 50.23±9.916 41.79±8.905
阿 62.5 19.48±9.86 20.42±1.52
昔 125 25.88±11.09 20.94±10.55
洛 250 44.44±5.94 21.62±19.95
韦 500 51.86±7.14 28.44±5.15
2.2药物抗HBV效果
蛇葡萄素及阳性药对2215细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制结果见表2，从表中可以看出，在本试验所用的浓度下：蛇葡萄素对HBsAg、HBeAg的抑制率分别在14.00±3.703％-50.23±9.916％和23.61±1.804％-41.79±8.905％之间，随着药物浓度的增加其抑制率逐渐增大，当药物浓度达750ug/ml时，对HBsAg的抑制率大于50％。
阳性药物阿昔洛韦对HBsAg、HBeAg的分泌抑制率分别为19.48±9.86％-51.86±7.14％和20.42±1.52％-28.44±5.15％之间，当药物浓度为500ug/ml时，对HBsAg的抑制率大于50％。
以上结果表明蛇葡萄素在体外具有一定的抗乙肝病毒活性。
实施例8：蛇葡萄素在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果
在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内进行治疗试验，观察蛇葡萄素是否抑制鸭乙型肝炎病毒。
实验采用一日龄北京鸭静脉注射鸭乙型肝炎病毒，7天后开始给鸭口服蛇葡萄素3个剂量组1.25，2.5和5.0g/kg，1天2次，给药10天(Bid×10)，观察药物对鸭的毒性和鸭血清鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)的影响，并与拉米夫定比较。
实验表明，蛇葡萄素大剂量组5.0g/kg口服，1天2次10天，无毒性，第一批实验，按配对统计，5.0g/kg组，给药后第5，10天和停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降，(P＜0.01)。按成组统计与各自对照组比较，给药后第5天，第10天和停药后3天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降，(P＜0.01)。2.5g/kg组，给药后第5，10天和停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著和非常显著下降，(P＜0.05-0.01)。按成组统计与各自对照组比较，给药后第10天和停药后3天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降，(P＜0.05)。1.25g/kg组，给药后第5天，按配对统计，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降，(P＜0.01)。按成组统计，给药后第5天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著下降，(P＜0.05)。第二批实验5.0g/kg组，按配对统计，给药后第5天，第10天和停药后3天治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著和显著下降，(P＜0.01-0.05)。按成组统计与各自对照组比较，给药后第5天，第10天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著和显著下降，(P＜0.01-0.05)。2.5g/kg组，按成组统计与各自对照组比较，给药后第10天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著下降，(P＜0.05)。1.25g/kg组，无抑制作用。第三批实验5.0g/kg，配对统计，给药后第5、10天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著和显著效果。(P＜0.01-0.05)。按成组统计与各自对照组比较，给药后第5天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有非常显著下降，(P＜0.01)。2.5g/kg组，按配对统计，给药后第5、10天和停药后3天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著和非常显著下降，(P＜0.05，0.01，0.05)。成组统计，给药后第5天，第10天，治疗组鸭血清DHBV-DNA有显著和非常显著下降，(P＜0.05-0.01)。1.25g/kg组，无抑制作用。拉米夫定对照组，有非常显著效果，说明实验可信。提示：蛇葡萄素在3.4-10.0g/kg组对鸭乙型肝炎病毒感染有效。
材料和方法
(一)药物
含有蛇葡萄素的原料药(其中蛇葡萄素的含量为85％)，用生理盐水配制。
阳性药物拉米夫定由葛兰素威康制药公司产品，用生理盐水配制。
(二)病毒
鸭乙型肝炎病毒鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。
(三)动物
1.日龄北京鸭，购自北京前进种鸭场动物饲养场。
(四)试剂
α-32P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司。缺口翻译药盒购自普洛麦格公司(Promega Co.)；Sephadex G-50，Ficoll PVP购自瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中国科学院生物物理所产品；硝酸纤维素膜0.45um Amersham公司产品。
(五)实验方法
1.鸭乙型肝炎病毒感染：
1日龄北京鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分离血清，-70℃保存待检。
2.药物治疗试验：
DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行药物治疗试验，每组6只，给药组分3个剂量组，分别为1.25，2.5，5.0g/kg组，口服，1天2次，10天。设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物。阳性药用拉米夫定，口服给药50mg/kg，1天2次，10天。在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
3.检测方法：
取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
(六)药效计算
1.计算每组鸭不同时间血清DNA OD值的平均值(X±SD)，并将每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0)OD值比较，采用配对t检验，计算t1、P1值。分析差异的显著性，判断药物对病毒感染的抑制效果。
2.计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制％，并作图，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态。
3.将给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较，采用成组t检验，作统计学处理，计算t2、P2值，分析差异的显著性，判断药效。
结果
(一)1日龄北京鸭感染DHBV后，血清DHBV-DNA动态
DHBV-DNA感染鸭口服生理盐水后DHBV-DNA斑点杂交结果见表3。三批实验感染78只血清DHBV-DNA全部阳性。病毒对照组18只雏鸭感染后第7天血清DHBV-DNA全部阳性，三批实验全程21天内血清DHBV-DNA水平感染后基本平稳。
(二)阳性药拉米夫定对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA的影响
DHBV感染鸭口服阳性药拉米夫定50mg/kg，1天2次，10天。结果见表3、表4。配对分析，给药第10天(T10)与给药前(T0)的OD值比较，下降有非常显著性(P＜0.01)，给药后对血清DHBV-DNA抑制率与病毒对照组，成组分析给药第10天(T10)有非常显著性差异，(P＜0.01)。停药后3天(P3)无统计学意义。有反跳现象。
(三)蛇葡萄素在DHBV感染鸭体内对鸭血清DHBV-DNA的影响
三批实验结果表明：
1.第一批实验选用3个剂量组，见表3，图1。分别为1.25，2.5和5.0g/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNA OD值，作自身比较。结果表明：5.0g/kg组在给药第5天(T5)、第10天(T10)，和停药后第3天(P3)，鸭血清DHBV-DNAOD值与给药前(T0)比较，配对分析，有非常显著的抑制作用。(P＜0.01)。成组分析，给药第5天，10天(T10)，和停药后第3天(P3)，给药组与对照组比较，有非常显著的抑制作用。(P＜0.01)。2.5g/kg组，在给药第5天(T5)、第10天(T10)，和停药后第3天(P3)，鸭血清DHBV-DNA OD值与给药前(T0)比较，配对分析，有显著和非常显著的抑制作用。(P＜0.05-0.01)。成组分析，给药第10天(T10)，和停药后第3天(P3)，给药组与对照组比较，有显著的抑制作用。(P＜0.05)。1.25g/kg组，鸭血清DHBV DNA OD值与给药前(T0)比较，配对分析，在给药第5天(T5)，有显著的抑制作用。(P＜0.05)。成组分析，给药第5天(T5)，给药组与对照组比较，有显著的抑制作用。(P＜0.05)。
2.第二批实验结果表明：见表3，4，图2。5.0g/kg组在给药后不同时间，鸭血清DHBV-DNA，OD值与给药前(T0)比较，给药后第5天(T5)、10天(T10)，和停药后第3天(P3)，有非常显著和显著抑制作用，(P＜0.01-0.05)，成组分析，与对照组抑制％作对比分析，给药第5天(T5)、第10天(T10)，有非常显著和显著抑制作用，(P＜0.01-0.05)。2.5g/kg组，配对分析，给药后第10天(T10)，有非常显著抑制作用，(P＜0.01)，成组分析，与对照组抑制％作对比分析，给药第10天(T10)，有显著抑制作用，(P＜0.05)。1.25g/kg组，抑制作用不明显。
3.第三批重复实验结果表明：见表3，4，图3。5.0g/kg组给药后第5，10天，DHBV-DNA与给药前比较，配对分析，有非常显著和显著抑制作用，(P＜0.01-0.05)，成组分析，与对照组抑制％作对比分析，给药第5天(T5)，有非常显著抑制作用，(P＜0.01)。2.5g/kg组，配对分析，与给药前比较，给药第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3)，有非常显著和显著抑制作用，(P＜0.05，0.01，0.05)。成组分析，与对照组抑制％作对比分析，给药第5天(T5)、第10天(T10)，有显著和非常显著抑制作用，(P＜0.05-0.01)。1.25g/kg组，抑制作用不明显。
表3蛇葡萄素在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内治疗组与病毒感染对照组鸭血清
DHBV-DNA OD值比较实验批次组别剂量g/kg鸭数(只)bid×10 鸭血清DHBV-DNA OD490值(X±SD) P3 T0 T5 T10I生理盐水蛇葡萄素1.252.55.0 6 6 6 6 0.958±0.06 0.928±0.08 0.907±0.07 1.275±0.23 0.926±0.07 0.747±0.11** 0.781±0.08* 1.031±0.23** 0.930±0.07 0.851±0.11 0.686±0.09** 0.927±0.14** 0.910±0.07 0.793±0.23 0.701±0.05** 0.959±0.11**II生理盐水蛇葡萄素1.252.55.0 6 6 6 6 0.549±0.05 0.611±0.16 0.716±0.05 1.051±0.39 0.528±0.04 0.534±0.08 0.667±0.07 0.680±0.32** 0.514±0.03 0.556±0.10 0.593±0.05** 0.765±0.30** 0.515±0.03 0.555±0.10 0.672±0.07 0.826±0.27*III生理盐水蛇葡萄素3TC1.252.55.00.05 6 6 6 6 6 0.802±0.05 0.966±0.06 1.372±0.23 1.374±0.09 1.554±0.17 0.795±0.06 1.017±0.20 1.071±0.14* 0.682±0.38** 1.195±0.62 0.755±0.02 0.970±0.23 0.993±0.11** 0.923±0.43* 0.657±0.20** 0.776±0.08 0.906±0.12 1.006±0.11* 1.235±0.32 1.742±0.14
统计处理：t1，P1：给药组不同时间(T5、T10，P3)鸭血清DHBV-DNA OD值与感染前(T0)OD值比较(配对t检验)。*p1＜0.05，**p1＜0.01。
总结：蛇葡萄素在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内治疗实验，三批实验结果表明：鸭乙型肝炎病毒感染鸭在感染后第7天口服蛇葡萄素治疗，5.0g/kg一天2次10天对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果有非常显著性作用，(P＜0.01)，无毒复性反应；2.5g/kg组在实验中给药第5，10天，具有一定的抑制作用。有显著和非常显著性作用，(P＜0.05，0.01)。实验中1.25g/kg组，无明显抑制作用。阳性药拉米夫定口服对DHBV-DNA的抑制作用，有非常显著的抑制作用。与以往多次实验结果一致。以上实验结果表明：蛇葡萄素治疗鸭乙型肝炎病毒感染鸭有效，有效剂量为2.5-5.0g/kg，一天2次10天。
表4.在鸭乙型肝炎病毒感染鸭体内口服蛇葡萄素治疗组与病毒感染对照组
鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较
实验 药物 剂量 鸭数 T5 抑制率(％) P3
T10
I 病毒对照 6 3.32 2.91 4.90
1.25 6 19.57* 8.31 14.80
蛇葡萄素 2.5 6 13.52 23.68 22.03*
5.0 6 19.39** 26.76** 23.96**
II 病毒对照 6 3.51 5.86 5.62
1.25 6 10.50 6.68 7.06
蛇葡萄素 2.5 6 6.86 17.02* 6.16
5.0 6 36.35** 26.80* 20.01
III 病毒对照 6 0.88 5.65 2.99
1.25 6 -5.34 0.23 5.94
蛇葡萄素 2.5 6 19.93* 26.39** 23.56
5.0 6 50.82** 32.87 9.53
3TC 50mg/kg 6 23.88 56.67** -13.16
统计处理：t2，P2：给药组不同时间(T5、T10，P3)鸭血清DHBV-DNA水平与感染前(T0)比较的抑制％与病毒对照组抑制％比较(成组t检验)。
*p2＜0.05，**p2＜0.01，***p2＜0.001。
实施例9：蛇葡萄素增强免疫力的功能的试验
1.蛇葡萄素对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
1.1实验目的
观察蛇葡萄素对小鼠吞噬功能的影响。
1.2受试药物
名称：蛇葡萄素
溶剂：热双蒸水
用量：0.5ml/20g小鼠
1.3对照样品
联苯双酯；上海天平制药厂，沪卫药准字(1995)第3765号-011
1.4动物
小鼠，昆明种，雄性，19～21g。
鸡红细胞：5％浓度
1.5方法
昆明种小鼠，随机分为5组，即对照组、蛇葡萄素75、150、300mg/kg联苯双酯150mg/kg，对照组给予生理盐水，给药组均口服给药，每日1次，共6次，末次给药同时腹腔注射0.5％水解乳蛋白1.5ml/只，24小时后腹腔注射5％鸡红细胞0.1ml，30分钟后断头放血，用生理盐水冲洗腹腔，收集腹腔巨噬细胞37℃孵育半小时，离心，沉淀物涂片，染色，油镜下计数细胞，以下列公式计算，并与对照组比较。
1.6结果
结果见表5，蛇葡萄素低、中、高剂量均能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞及增加吞噬指数，联苯双酯150mg/kg剂量组也能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。
表5.蛇葡萄素对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(±SD) 组别剂量 途径 mg/kg动物数 (只) 吞噬百分率％ 吞噬指数蛇葡萄素75 po×6 8 31.2±3.4** 0.64±0.07**150 po×6 8 43.2±4.2 0.85±0.02**300 po×6 8 42.3±4.8** 0.81±0.06**联苯双酯150 po×6 8 40.1±4.5** 0.88±0.03**对照组相应溶剂 8 23.0±5.3 0.39±0.12
**P＜0.01与模型对照组比较
2.蛇葡萄素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
2.1实验目的
观察蛇葡萄素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。
2.2受试药物
名称：蛇葡萄素
溶剂：热双蒸水
用量：0.5ml/20g小鼠
2.3对照样品
联苯双酯；上海天平制药厂，沪卫药准字(1995)第3765号-011
2.4动物
小鼠，C57BL/6，♂，19～21g。
2.5其他材料
刀豆球蛋白(ConA)：Sigma产品，50μg/ml浓度
3H-TdR：上海原子核研究所，放射性浓度1mci/ml
培养基：RPMI-1640，内含15％小牛血清、巯基乙醇、Hepes等
2.6方法
C57BL/6小鼠，随机分为5组，即正常对照组、蛇葡萄素75、150、300mg/kg、联苯双酯150mg/kg，每天口服给药1次，连续7天，给药结束后，处死动物无菌条件下取脾，计数脾细胞，并调整细胞浓度为1×107/ml，在96孔细胞培养板上每孔加细胞悬液100μl，ConA 50μl，和培养液，各组均设三复管，37℃，5％CO2条件下培养48小时，加入3H-TdR 0.5μci/孔，继续培养18小时，用多头细胞收集器收集细胞，在液闪仪上测CPM值，并与对照组比较，结果见表6。
2.7结果
表6.蛇葡萄素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 组别 剂量 途径 mg/kg动物数 (只) CPM值(±SD)蛇葡萄素 75 po×7 4 11763±1985* 150 po×7 4 7547±1369* 300 po×7 4 7832±1298*联苯双酯 150 po×7 4 7188±1010**对照组 N.S. 4 5448±917
*P＜0.05 **P＜0.01与对照组比较
结果表明，蛇葡萄素有明显的促进小鼠脾淋巴细胞增殖的作用，并以低剂量作用较其它两组强。
实施例10：急性毒性试验
取小鼠预试后，另选取20只小鼠，雌雄各半，以蛇葡萄素的最大浓度和最大体积给小鼠灌胃给药，24h给药3次，连续观察7d，记录小鼠活动行为、大小便和饮食等情况。结果：观察7天，未见动物有行为异常、死亡等情况，体重正常增长。计算其最大灌胃量为26.0g·kg-1。
实施例11：蛇葡萄素抗流感病毒实验：
流感病毒的分离和鉴(滴)定
目前常用鸡胚进行分离进行流感病毒，接种途径为鸡胚的尿囊腔，3天后出现后鸡胚死亡的病变特征和出现血凝素，对此，我们采用此方法进行对蛇葡萄素的鉴定。我们采用一定浓度的提取液和4个血凝单位的流感病毒1∶1混合，让二者于室温作用20分钟后再注射鸡胚，注射量为每胚0.2ml。实验采用9至11日龄的鸡胚，进行尿囊腔接种，培养48小时后，于4℃放置过液，然后无菌取其尿液，经1000rpm离心10分钟后取上清，分装，-20℃存放，备检测之用，尿液的检测分血凝和血抑两种，使用的红细胞是来亨公鸡，方法为常规法。
抗病毒实验：用不同浓度的蛇葡萄素在鸡胚中进行抗病毒实验
表7流感病毒血凝抑制试验样品浓度 血清稀释度原液10×20×40×80×160×320×640×1280×原液1++++++++++++++++++++++++++原液2++++++++++++++++++++++++++原液3++++++++++++++++++++++++++++++原液4++++++++++++++++++++++++++++++10-5原液1++++++++++++++++++++++++++++++++++10-5原液2++++++++++++++++++++++++++++++++++10-5原液3++++++++++++++++++++++++++++++10-5原液4++++++++++++++++++++++++++++++10-6原液1++++++++++++++++++++++++++++++10-6原液2++++++++++++++++++++++++++++++10-6原液3++++++++++++++++++++++++++++++10-6原液4++++++++++++++++++++++++++++++
备注：1、原液指初始浓度的蛇葡萄素4mg/ml
2、10-5与10-6指从蛇葡萄素原液进行药的稀释度
3、判定结果时按血凝强度分别以++++、+++、++、-表示以50％红细胞出现凝集++的血凝稀释度为其血凝下降
红细胞呈细沙粒样无效主孔(管)底者为+++，即100％凝集；红细胞均匀铺于孔(管)底，但边缘不整而稍向孔(管)底集中者为+++，即75％凝集；红细胞于孔(管)底形成一个环状，四周有小凝集块者为++，即50％凝集；红细胞于孔(管)底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集块者为+，即25％凝集；红细胞于孔(管)底形成圆团，边缘光滑整齐者为一，即无凝集。
上述实验数据证明蛇葡萄素具有抗流感病毒作用。