唾液酸化的碳水化合物 本发明涉及碳水化合物在人和动物的免疫调节、免疫抑制和感染的治疗中的应用，和涉及包含这些碳水化合物的食品、饮食和药物组合物。
致病生物以及细胞破坏物质与哺乳动物细胞表面的粘附是细胞感染或破坏的第一步骤和必要的前提条件。病原体和细胞之间的相互作用通过配体-受体关系形成。在这些配体-受体关系或相互作用中，糖苷结构起重要作用。
影响这种配体-受体关系的可能性在于分别阻断细胞两表面之一的或者细胞两表面的各自的受体或配体。
使用特殊试验系统，可表明多种碳水化合物的混合物减少或者甚至彻底防止如微生物与细胞表面的粘附，参见Kunz，C、Rudloff，S，ActaPaediatr.，1993，82，903-912。其它物质如作为选择蛋白(内皮细胞和淋巴细胞上的粘着蛋白质)的碳水化合物配体的路易斯结构在例如炎性进行期间的滚动、归巢和侵入地范围内调节淋巴细胞与内皮的相互作用(Albelda S.M.，Smith C.W.，Ward P.A.，FASEB J.，1994，8，504-512)。唾液酸基团一方面在上述病原体-细胞相互作用中发挥重要作用，另一方面在细胞间相互作用中发挥重要的作用。这些单糖发挥它们的作用，特别是作为寡糖和糖缀合物如糖脂和糖蛋白的组分(Traving和Schauer，Structure，function and metabolism of sialic acids，Cell.Mol.Life Sci.，54卷，1998)。发现唾液酸有最多40种不同的衍生形式，至今已经在人、动物和一些病毒、细菌和真菌中被发现。
除了羧基负电荷的化学物理效应之外，唾液酸的主要功能是它们特异地参与分子和细胞识别过程(Kelm S.& Schauer R.(1997)，Sialicacids in molecular and cellular interactions，Int.Rev.Cytol.，175，137-240)。一部分唾液酸稳定酶和其它蛋白质、自动识别/非自动识别免疫系统、掩蔽细胞和蛋白质。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(P.R.Crocker等人(1998)Siglecs-a family of sialic acid-binding lectins，Glycobiol.，8，Glycoforum 2 v-vi.)构成特定类别的唾液酸特异性凝集素。这些分子具有免疫球蛋白样结构域，代表凝集素样受体，和以结合唾液酸作为必要特征。
在细胞间相互作用中，配体或受体的结构对于这些相互作用的作用机制通常是必不可少的。配体与受体的结合过程是可能产生导致其它信号级联触发的第一事件，同时在唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素的情况中，可以表明这些物质参与信号转导机制。因此，酪氨酸，其作为存在于Siglec-2(CD22)中的例子，可能经历磷酸化，其反过来，通过另外的中间步骤导致B细胞活化的减少。
特异性蛋白质与碳水化合物结构的结合机制对于细菌与上皮表面的粘附也是很重要的。因为粘附表示首次感染的第一步，抑制这些结合过程是避免感染的重要目标。
特异性识别α2-3的细菌凝集素(粘附素)经历唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素所经历的相同机制。
此外，所谓的受体和配体群簇在结合强度中起重要作用。在这种情况中的重要的标准是结合活性配体的多价。在分子中结合越多的配体结构，配体和受体或两个或更多细胞之间的相互作用越显著。这特别适用于这样的相互作用中，其中分子或细胞的交联调节生物过程的功能。因此必须强调的是，多价配体导致受体交联，由此可引发另一个信号效应。
本发明的目的是提供在碳水化合物的帮助下，在人和动物中实现免疫调节、免疫抑制和治疗感染的方法。
这些目的通过权利要求书的教导得以解决。
根据本发明，具有至少一个以下通式II的碳水化合物单元的以下通式I的唾液酸化的碳水化合物在人和动物的免疫调节、免疫抑制和感染的预防及治疗中的应用：
其中，
Sia表示以α2-3键结合的唾液酸或唾液酸衍生物，
Gal表示半乳糖单糖单元，
HexNac表示N-乙酰化的半乳糖胺单糖单元或N-乙酰化的葡糖胺单糖单元(GalNAc或GlcNAc)，
Hex表示半乳糖单糖单元或葡萄糖单糖单元(Gal或Glc)，
C表示HexNac或Hex，或不存在C，
N表示1到50，
V表示OH、碳水化合物残基或载体T上的连结点，前提是如果V表示OH，则n表示1，如果V表示碳水化合物残基或载体T，则n表示各自直接与这些碳水化合物残基或载体结合的式II碳水化合物单元数，
X表示唾液酸或唾液酸衍生物，磷酸酯基，硫酸酯基或羧基，或包括磷酸酯基、硫酸酯基或羧基的单糖，其中第二唾液酸或唾液酸衍生物或几个唾液酸或唾液酸衍生物可以以α2-8键与唾液酸或唾液酸衍生物结合，并且只存在一个残基X。
令人惊讶的是，已经发现本发明使用的碳水化合物优于最初提到的寡糖序列，是高效的抑制剂或受体类似物。这些碳水化合物在以下称为“本发明的碳水化合物”。
本发明的碳水化合物的特征是必须带有至少一个通式II的碳水化合物单元[Siaα2-3-Gal-HexNac(X)-Hex(X)-C-]-，在这种情况中，残基Sia、Gal HexNac、Hex、X和C具有与通式I中表示的相同含义。
因此，通式II的碳水化合物单元构成了通式I的本发明的碳水化合物的一部分。如果通式I中的残基V表示OH，则通式I的碳水化合物由通式II的碳水化合物单元和这种残基V组成。
在唾液酸化的碳水化合物中，优选的键合方式如下：α1-2、α1-3、α1-4、α1-6、α2-3、α2-6、α2-8、β1-2、β1-3、β1-4和α1-6。在碳水化合物或多糖中，可发生一个及数个提及的键合。在X也表示多糖的范围内，优选的是带有电荷的α-糖苷基团的β-结合基本结构(I，II)。
残基V还可表示碳水化合物残基或载体T上的连接点。在后一种情况中，严格来说，V不表示残基，而只不过是连接点。通过这个连接点，通式II的碳水化合物单元结合到载体上或固定于其上。载体的种类不是特别关键的，因此可使用许多载体中的任何一个。可将最多50个通式II的碳水化合物单元结合于这种载体上，每个碳水化合物单元通过连接点V与这种载体T结合或连接。因此，在本发明范围内使用的指数n表示通式II的碳水化合物单元数，而不是指例如一连串的n个这些碳水化合物单元组分。
其中认为n表示1-50，因此，这意味着n表示1到50的整数，因此可表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。
载体T特别是肽、蛋白质、聚合物或生物高分子，与肽或蛋白质连接的键具体是N-糖苷键或O-糖苷键。聚羟基丁酸可用作生物高分子。适当的聚合物是如聚丙烯酰胺。
残基V还可表示碳水化合物残基。其优选是单糖残基、寡糖残基或多糖残基。其例子可以是以下：乳寡糖、储备碳水化合物(特别是淀粉)和骨架碳水化合物如果胶、纤维素和半乳甘露聚糖。虽然这些碳水化合物也可称为生物高分子，但对于更好地术语区分来说，它们不属于上述的用于本发明目的的生物高分子。
代表残基V的碳水化合物残基也可是与通式II的碳水化合物单元同样组成的一种或多种(甚至是脂肪族的)碳水化合物残基，但这些碳水化合物残基的连接是不同的。
重要的是通式II的碳水化合物单元具有至少两个负电荷，存在于至少3个和特别是4个中性单糖(Gal、HexNac、Hex和C)的核上。这些负电荷中的一个作为半乳糖上的α2-3结合唾液酸位于核(其也可称为核心)的非还原性末端上。第二电荷也作为唾液酸存在于接近末端的位置，然而，其可被其它的带电基团即磷酸酯、硫酸酯或羧基取代。这些磷酸酯、硫酸酯和羧基可直接位于单糖HexNac和Hex上，或可与另一个单糖结合。因此，换句话说，该其它单糖表示这些带电基团与通式II的碳水化合物单元的单糖HexNac或Hex之间的桥。
如果残基V是相当于通式II的碳水化合物单元的碳水化合物残基，只要涉及了其组成，则优选这些残基V以每3或4个中性单糖存在两个负电荷而被使用。
在通式II的碳水化合物单元中，只存在一个残基X。换句话说，其为带有上述类型的残基X的单糖HexNac或单糖Hex。
如果在本发明中提及单糖用于说明通式I和II，那么，严格来说，不得不使用术语“单糖单元”，因为这些单糖不是以单独的形式存在，而是与其它的单糖或基团结合。然而，为了简明的目的，将只使用术语单糖或具体的单糖名称(如半乳糖、葡萄糖、己糖胺等)。
命名为Sia的单糖单元优选为乙酰神经氨酸(NeuAc)或N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)。例如，残基Sia和X的唾液酸的O-酰基衍生物为O-乙酰衍生物。
如果残基X表示唾液酸或O-酰基衍生物，那么其优选NeuAc、NeuGc及其衍生物，如以α2-3结合或α2-6结合的O-乙酰唾液酸。
如以上所说明的，可在残基X上存在以α2-8结合的第二唾液酸或几个唾液酸。
为了生成连接，尽管α2-3键结合的Neu5Ac(通式I和II中的Siaα2-3残基)绝对必须存在于本发明使用的碳水化合物中以作为必需的识别序列，但是第二和第三Neu5Ac作为带电荷基团只在为增加亲合力时才是必要的。结合的种类并不重要。这个第二Neu5Ac(残基X)也可被另一个带有负电荷的基团(磷酸酯、硫酸酯、羧基以及羧酸酯的形式)取代。
对于在本发明的碳水化合物的帮助下用于人和动物的免疫调节、免疫抑制和治疗感染，通式II的碳水化合物单元具有实质性的重要作用。因此，可结合这些通式II的碳水化合物单元的载体T的种类具有次要的重要性。因此，载体T可以是任何期望的种类。优选地，其为碳水化合物、肽、蛋白质、聚合物或生物高分子，与肽或蛋白质连接的键优选是N-糖苷键或O-糖苷键。更优选地，载体T由亲脂性化合物组成，包括一种或多种代表其头基的通式II的碳水化合物单元。优选的亲脂性化合物是糖脂类和神经节苷脂类。
作为通式I的碳水化合物，使用二唾液酸-乳-N-四糖(DS-LNT)、二唾液酸-乳-N-新-四糖(DS-LNnT)、多糖缩氨酸(GMP)和神经节苷脂GD1a、GT1b和GT1c。GMP优选来源于动物乳如绵羊、山羊、水牛、骆驼，和特别是牛乳。
本发明使用的碳水化合物可以是它们游离的碳水化合物(V表示H2O)或与碳水化合物残基或载体T结合的碳水化合物，其可以被加入到不同的食品、饮食和药物组合物中。所有这些组合物可以以液体或固体形式存在。本文使用的术语“食品”不仅包括实际的食品组合物，而且包括食品添加剂、食品补充剂、饮料，和包括婴儿和幼儿食品的食品组合物。术语“婴儿和幼儿食品”具体指所有人工制备的食品，但不包括人乳，具体用于人的婴儿。“人工地”是指那些婴儿食品由植物或动物原料生产而不是来自人。这些食品组合物可以以任何期望的方式施用给人或动物。其还包括作为探针食品施用到胃中。
本发明的碳水化合物可以例如为混合物或作为添加剂加入到以下产品中，虽然这些列举不是结论性的：乳和乳制品、婴儿和幼儿食品、巧克力棒、酸奶饮料、奶酪、香肠和肉制品、合成代谢食品、探针食品、和孕妇用产品。
本发明的碳水化合物还可以药物组合物的形式单独施用或与一种或几种另外的活性剂一起施用。这些组合物可以例如制成片剂/香袋(sachet)。对于这种药物制剂，可使用通常的佐剂、载体、助剂、稀释剂、润湿剂、增稠剂、调味剂、甜味剂等。
药物组合物可以以任何通常的方法给予患者(即，人和动物)。然而，为了方便，它们应为适合于口、舌、鼻、肠、支气管、阴道、局部(皮肤和粘膜)和经口给予的组合物，并制成适合给药的制剂类型。
包含至少一种本发明使用的碳水化合物的食品、饮食组合物和药物组合物可与其它物品一起使用，用于预防和治疗胃肠道感染如李斯特菌病、血液系统、呼吸道、泌尿生殖道、以及鼻咽的感染，和用于保护内皮、上皮和粘膜。因此，它们可局部施用于皮肤或可在粘膜上使用。这些粘膜包括鼻、肠、支气管和阴道的粘膜。因此，本发明使用的碳水化合物可例如加入到漱口药中。所有的年龄组，从新生婴儿到年长的人，可作为本发明使用的碳水化合物的目标人群。特殊的应用范围是保护和治疗孕妇、病人、虚弱和年长的人、用于那些对于预防例如李斯特菌病具有特别重要性的人群。
由于它们的防粘性质，因此，本发明的碳水化合物可用于减少或预防感染。另一方面，它们还可用于通过调节细胞间相互作用来达到影响免疫学应答的目的。这不仅适用于调节细胞间相互作用，优选在真核细胞(如淋巴细胞和内皮细胞等)之间，而且用于调节病原体(如细菌、孢子、病毒、类病毒、朊病毒、真菌、单细胞的和多细胞寄生虫、毒素和重金属阳离子)与真核细胞优选哺乳动物细胞的粘附。
本发明使用的碳水化合物为已知化合物，如DS-LNT、DS-LNnT和神经节苷脂GD1a、GT1b和GT1c。它们为已知的和/或根据适当的已知方法以化学的或酶促的方法或以这两种技术组合的方式进行制备。
本发明使用的二唾液酸-乳-N-四糖(DS-LNT)和二唾液酸-乳-N-新-四糖(DS-LNnT)为通式I的化合物，其中HexNac＝GlcNac、Hex＝半乳糖和C＝葡萄糖。另外，存在两种唾液酸(Siaα2-3NeuAc、X＝α2-6NeuAc)。还可使用其衍生物，优选那些其中非末端唾液酸已经被羟乙酰神经氨酸、硫酸酯基团、磷酸酯基团或羧基或羧酸酯基团代替。也可连接另外的唾液酸。1型的乳糖胺单元可被Gal(α1-3)GalNAc单元代替。
本发明另外使用的神经节苷脂GD1a、和GT1b，其单糖序列与DS-LNT很相似。然而，第二或第三唾液酸的结合发生在位于葡萄糖(连接到神经酰胺)上的半乳糖上。
本发明使用的通式I的碳水化合物以优选每天一次，每公斤体重至少1 mg的通式I的碳水化合物，特别是一个通式II的碳水化合物单元的量给予患者。
示例性的饮食和药物为以下所列的，其包含至少一个本发明的碳水化合物。这些为以下的本发明的碳水化合物：二唾液酸-乳-N-四糖(DS-LNT)及其衍生物(参见上面)、DS-LNTn及其衍生物、和GD1a、GT1b和GT1c。为了简化起见，这些碳水化合物在实施例中只称为“本发明的碳水化合物”。这个称谓表示每个上述的本发明的碳水化合物及其混合物。
实施例1：
为制备香袋，在所有情况下，将100mg或仅5mg干燥的本发明的碳水化合物与990mg的麦芽糖糊精混和，然后用香袋包装。这些香袋每天在进餐过程中给予三次。
实施例2：
将小球产品形式的已知药用食品(即MilupaHN 25，平衡膳食)(包含18.8g的蛋白质、8.6g的脂肪、62.8g的碳水化合物、3.3g的矿物质和维生素)与本发明的碳水化合物在本发明本身已知的组合物中混合，使得在100g的成品小球产品中含有50mg的本发明的碳水化合物。
对于液体药用食品组合物，将100ml的已知药用食品MilupaHN25液体(2.3g的蛋白质、1.6g的脂肪、8.5g的碳水化合物、37g的矿物质和维生素)与7mg的本发明的碳水化合物混合。
实施例3：
孕妇用产品
泡腾片(最终重4.15g)(Milupa的Neovin)通过本身已知的方法混合200到500mg的本发明的碳水化合物进行制备。每天一片，溶于150ml水中并服下。
实施例4：
用于老年人和虚弱的人的产品
包含22.5g的蛋白质、7.7g的脂肪、60.8g的碳水化合物、5.4g的矿物质和维生素的粉末状平衡药用食品(Milupa的Dilsana)通过本身已知的方法进行制备：向每100g粉末中混入100mg到1000mg的本发明的碳水化合物。每天将最多3×50g食品溶于150ml水中并服下。
实施例5：
茶
将以通常方法制备的100g速溶茶粉末与2g的本发明的碳水化合物混和。把3.8g的茶粉末溶于100ml热水中，每天服用三次。
实施例6：
包含11.8g的蛋白质、56.9g的碳水化合物、24.9g的脂肪、2.5g的矿物质和维生素的蛋白质适合型的婴儿乳制剂(Milupa的Aptamil)通过通常的方法制备成小球产品，每100g的婴儿乳制剂与100mg到1000mg的本发明的碳水化合物混和。