人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法.pdf

本发明公开了一种人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法，人胎儿胰腺上皮样干细胞来源于正常流产胎儿胰腺组织，体外培养能无限克隆，且具有多向分化潜能；经形态特征、生长特性、免疫组化特征、RT－PCR特征、定向诱导分化特征、染色体核型、DNA序列测定及分析，证明该胎儿胰腺干细胞是人源性胎儿胰腺干细胞；本发明可为研究哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病提供丰富的种子细胞，为建立人和哺乳动物胰腺干细胞系提供了一种有效可靠的方法。

1.  人胎儿胰腺干细胞系，其特征在于，人胎儿胰腺上皮样干细胞来源于正常流产胎儿胰腺组织，体外培养能无限克隆，且具有多向分化潜能；具体包括：
1)形态特征
H.E染色，人胎儿胰腺干细胞完全贴壁后呈多角形上皮样，核多为圆形；Giemsa染色，为单核仁、双核仁或多核仁细胞；电镜，细胞核质比大，胞质无分泌颗粒，线粒体、内质网等细胞器均不发达，属发育早期胰腺细胞；
2)生长特性
细胞数较少时，可见典型的单克隆生长方式；当细胞生长至75％融合时，呈铺路石样；在该培养条件下，细胞接种1～2d生长缓慢，3～5d为细胞数倍增期；从细胞生长曲线及1年以上细胞扩增生长情况看，该细胞系为永生化人胎儿胰腺干细胞系；
3)免疫组化特征
人胎儿胰腺干细胞表达核增殖抗原、胰肠同源域1、胰高血糖素、胰岛素、角蛋白19及巢蛋白，不表达分化抗原CD34、CD44及CD45，从蛋白表达水平证实人胎儿胰腺干细胞具有分化为胰岛、上皮及神经细胞多潜能性；
4)RT-PCR特征
人胎儿胰腺干细胞转录表达胰肠同源域1、胰高血糖素及巢蛋白，从分子转录水平证实该细胞确是胰腺干细胞；
5)定向诱导分化特征
定向诱导人胎儿胰腺干细胞可分化为双硫腙染色阳性，且分泌胰岛素和胰高血糖素的功能性胰岛细胞团；
6)染色体核型
传至47代的人胎儿胰腺干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对；染色体核型正常；
7)DNA序列测定及分析
提取人胎儿胰腺干细胞总DNA，进行线粒体DNA D-loop的PCR扩增、测序；采用Clustal W 1.82软件对所测的人胎儿胰腺干细胞与正常人细胞的线粒体DNA D-loop区序列进行同源序列比对分析，同源性为98％；证明该胎儿胰腺干细胞是人源性胎儿胰腺干细胞。

2.  如权利要求1所述的人胎儿胰腺干细胞系，其特征在于，所述定向诱导分化方法是将人胎儿胰腺干细胞扩增培养2d后，换用诱导液DMEM+10％NBS+10mM烟酰胺+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素，连续定向诱导培养25d；检测，形成双硫腙染色阳性，且分泌胰岛素和胰高血糖素的功能性胰岛细胞团。

3.  如权利要求1所述的人胎儿胰腺干细胞系，其特征在于，通过设计以下PCR引物片段及反应条件，RT-PCR检测到该胰腺干细胞转录表达胰肠同源域1、胰高血糖素及巢蛋白；
1)胰肠同源域1(PDX1，441bp)引物：
正链引物L 5’-TGGCGCACCTTCACCACCAC-3’
反链引物H 5’-CCTGCTCAGGCTCCGCGACC-3’
PCR反应条件：94℃变性2min，然后93℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1min，循环40次，最后，72℃再延伸10min；
2)胰高血糖素(glucagon，353bp)引物：
正链引物L 5’-AGCATTTACTTTGTGGCTGG-3’
反链引物H 5’-ATGAATTCCTTGGCAGCTTG-3’
PCR反应条件：94℃变性2min，然后93℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，循环40次，最后，72℃再延伸10min；
3)巢蛋白(nestin，334bp)引物：
正链引物L 5’-TTCTGTGAGTGTCAGTGTCC-3’
反链引物H 5’-CTCAGAGACTAGCGGCATTC-3’
PCR反应条件：94℃变性2min，然后93℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，循环40次，最后，72℃再延伸10min。

4.  一种如权利要求1所述的人胎儿胰腺干细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分离培养原代人胎儿胰腺干细胞
无菌采取4～6月龄正常流产胎儿胰腺组织，剪碎组织块，采用0.1％IV型胶原酶消化分离胰腺组织；DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素为基础培养液培养，获得原代呈单克隆性生长的上皮样人胎儿胰腺干细胞及成纤维细胞；
2)纯化人胎儿胰腺干细胞

0.  25％胰酶+0.04％EDTA消化传代，传代中逐渐消除成纤维细胞，获得纯化的呈克隆性生长的上皮样人胎儿胰腺干细胞；
3)快速克隆人胎儿胰腺干细胞
采用DMEM+10％NBS+10ng/mlEGF+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素培养液，快速扩增已纯化的人胎儿胰腺干细胞，获得呈铺路石样生长的大量人胎儿胰腺上皮样干细胞；通常，细胞接种1～2d后，即进入倍增期；
4)冷冻保存人胎儿胰腺干细胞
冷冻：以80％DMEM+10％DMSO+10％NBS为细胞基础冷冻液，稀释细胞至1×10⁵，并分装于冷冻管。4℃平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮冷冻保存；
解冻：取出冷冻细胞管，迅速投入36～38℃水浴中解冻，用培养液清洗解冻细胞2～3遍，脱去冷冻液，进行培养；取少量细胞，经胎盘蓝染色检测，细胞成活率达95％以上。

人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法
技术领域
本发明属于生物技术学科人类和哺乳动物细胞(组织)工程领域，涉及体外分离、纯化及快速扩增人类和哺乳动物胰腺干细胞，特别涉及一种人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是危害人类健康的重大疾病之一，而传统的药物及胰岛素替代疗法不能从根本上医治该病。近年来，随着胰岛移植技术的不断完善，根治I型和部分II型糖尿病已成为可能(Shapiro et al.N Engl J Med.2000，27(4)：230～238.)，而胰岛供体短缺的矛盾亦更为突出。体外分离、克隆人类和哺乳动物胰腺干细胞作为种子细胞，并定向诱导其分化为功能性胰岛是解决胰岛供体短缺的有效途径，但目前该研究尚处于起始阶段。如Ramiya等(Nat Med.2000，6(3)：278～282.)报道，采用胶原酶消化NOD小鼠胰腺，手工分离胰导管，由胰导管获得的细胞经无糖、高氨基酸培养可扩增形成单层。用高糖培养液进行诱导，这些细胞能产生小而圆的胰岛祖细胞(isletprogenitor cells，IPCs)，继续培养，这些小细胞扩增形成胰岛(IPC-derived islets)。RT-PCR扩增表明，IPCs和IPC-derived islet转录胰岛素I、II，胰岛素受体，胰高血糖素等因子，也表达与胰岛发育、分化有关的因子胰肠同源域1(pancreatic and duodenalhomeobox factor 1，PDX1)、β-半乳糖苷酶、酪氨酸羟化酶等；葡萄糖刺激IPC-derivedislet释放胰岛素；将300个IPC-derived islet移植在NOD成年小鼠肾囊区，可降低NOD小鼠血糖，抗糖尿病。但是，这类存在于NOD小鼠胰导管，能分化为分泌insulin细胞的干细胞还没有最后证实和定性(Andreas等，Am J Physinol Metab.2003，284：E259-E266.)。Bonner-Weir等(Sci Med.2000，97(14)：7999～8004.)报道采用Ricordi法，V型胶原酶消化成人胰腺，密度梯度离心，获取含胰导管上皮细胞较多的组织碎片，CMRL1066+10％胎牛血清(FBS)贴壁培养。部分上皮样细胞形成单层后，改用无血清DMEM/F12+1g/L ITS(5mg/L胰岛素+5mg/L转铁蛋白+5mg/L硒)+2g/L牛血清白蛋白+10mM烟酰胺+10ng/ml角质细胞生长因子+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素扩增培养上皮细胞。免疫组化染色显示上皮细胞表达角质蛋白19(CK19)，少量散在细胞表达insulin和PDX1蛋白；诱导培养，上皮细胞分化为双硫腙(dithizone，DTZ)染色阳性且分泌胰岛素的胰岛细胞团。但该研究仍属于体外胰腺组织扩增培养，并未纯化出胰腺干细胞(Andreas等，Am J Physinol Metab.2003，284：E259-E266.)。Zulewski等(Diabetes.2001，50：521-533.)采用胶原酶分离大鼠或成人胰岛，手工挑取胰岛，RPMI1640+10％FBS+1mmol/LNaHCO₃+抗霉素+71.5umolβ-巯基乙醇悬浮培养，96h后挑出悬浮胰岛，RPMI1640+10％FBS+1mmol/LNaHCO₃+抗霉素+71.5umolβ-巯基乙醇+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF贴壁培养。单层细胞形成后，免疫染色巢蛋白(nestin)阳性，其中，大鼠来源的nestin阳性表达细胞8.5个月扩增了10倍；人源性nestin阳性表达细胞8个月扩增了7倍。检测nestin阳性细胞，不表达insulin、glucagon、somatostatin及CK19。而添加类胰高血糖素肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)等因子后(Abraham，EJ，et al.Endocrinology.2002，143：3152-3161.)，这类细胞则表达insulin、glucagon及PDX1，且分泌insulin。但是，考虑到神经、肌肉、间充质及成年胰腺卫星细胞也表达nestin，Andreas等认为(Am J Physinol Metab.2003，284：E259-E266.)该类细胞并不是胰腺特有的细胞，来源于胰岛的nestin阳性细胞可能具有转分化为胰腺内分泌细胞的潜能。
综上所述，目前哺乳动物胰腺干细胞还没有完全定性，胰腺干细胞的分离、纯化及扩增方法均处于探索中，获得的胰腺干细胞鉴定结果也不尽一致，世界范围内还没有已建立人胎儿胰腺干细胞系的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法，为研究哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病提供丰富的种子细胞，并为建立人和哺乳动物胰腺干细胞系提供一种有效、可靠的方法。
发明内容具体包括：
1.人胎儿胰腺干细胞系
经多种方法鉴定，本发明分离克隆的人胎儿胰腺干细胞系具有以下特征：
1.1形态特征H.E染色(图1)，人胎儿胰腺干细胞完全贴壁后呈多角形上皮样，核多为圆形。Giemsa染色(图2)，为单核仁、双核仁或多核仁细胞。电镜显示(图3)，细胞核质比大，胞质无分泌颗粒，线粒体、内质网等细胞器均不发达，属发育早期胰腺上皮样细胞。
1.2生长特性细胞数较少时，可见典型的单克隆生长方式；当细胞生长至75％融合时，呈铺路石样。生长曲线表明(图4)，在该培养条件下，细胞接种1～2d生长缓慢，3～5d为细胞数倍增期。从细胞生长曲线及1年以上扩增细胞生长情况看，该细胞为永生化人胎儿胰腺干细胞。
1.3免疫组化特征人胎儿胰腺干细胞表达核增殖抗原(PCNA，图5)、胰肠同源域1(PDX1，图6)、胰高血糖素(glucagon，图7)、胰岛素(Insulin，图8)、角蛋白19(CK19，图9)及巢蛋白(nestin，图10)，而不表达分化抗原CD34、CD44及CD45蛋白。对照(图11)。从蛋白表达水平证实本研究分离克隆的人胎儿胰腺干细胞具有分化为胰岛、上皮及神经细胞的多潜能性。
1.4 RT-PCR检测人胎儿胰腺干细胞转录胰肠同源域1(PDX1)、胰高血糖素(glucagon)及巢蛋白(nestin)(图12)。从基因转录水平证实该细胞确是胰腺干细胞。
1.5定向诱导分化定向诱导人胎儿胰腺干细胞可分化为双硫腙(DTZ)染色阳性的细胞团(图13)，且分泌胰岛素和胰高血糖素。
1.6染色体核型分析传至47代的人胎儿胰腺干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对。染色体核型正常(图14A、14B)。
1.7线粒体DNA序列测定及分析提取人胎儿胰腺干细胞总DNA，进行线粒体DNA(mtDNA)D-loop的PCR扩增、测序，结果见图15。采用Clustal W(1.82)软件对所测的人胎儿胰腺干细胞与正常人细胞的mtDNA D-loop区序列进行同源序列比对分析，同源性为98％。证明人胎儿胰腺干细胞是人源性胰腺干细胞。
2.建立人胎儿胰腺干细胞系的方法
2.1分离培养原代人胎儿胰腺干细胞
无菌采取4～6月龄正常流产胎儿胰腺组织，剪碎组织块，采用0.1％IV型胶原酶消化分离胰腺组织；DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素--0.1mg/ml链霉素为基础培养液培养，获得原代呈单克隆性生长的上皮样人胎儿胰腺干细胞及成纤维细胞(图16)。
2.2纯化人胎儿胰腺干细胞
0.25％胰酶+0.04％EDTA消化传代，传代中逐渐消除成纤维细胞，获得纯化的呈克隆性生长的上皮样人胎儿胰腺干细胞(图17)。
2.3快速克隆人胎儿胰腺干细胞
采用DMEM+10％NBS+10ng/mlEGF+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素培养液，快速扩增已纯化的人胎儿胰腺干细胞，获得呈铺路石样生长的大量人胎儿胰腺上皮样干细胞(图18)。通常，细胞接种1～2d后，即进入倍增期。
2.4冷冻保存人胎儿胰腺干细胞
冷冻：以80％DMEM+10％二甲基桠枫(DMSO)+10％犊牛血清(NBS)为细胞基础冷冻液，稀释细胞至1×10⁵，分装于冷冻管。4℃平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮冷冻保存。
解冻：取出冷冻细胞管，迅速投入36～38℃水浴中解冻。用培养液清洗解冻细胞2～3遍，脱去冷冻液，进行培养。取少量细胞，经胎盘蓝染色检测，细胞成活率达95％以上。
采用以上分离、纯化、快速克隆及冷冻保存的方法，已获得大量纯化的人胎儿胰腺干细胞。其中，1例男性胎儿来源的胰腺干细胞已稳定扩增1年以上，传50代，冷冻保存细胞数为1×10⁹。
附图说明
本说明书共有18幅附图，其中：
图1人胎儿胰腺干细胞H.E染色形态特征(×100)
图2人胎儿胰腺干细胞Giemsa染色形态特征(×400)
图3人胎儿胰腺干细胞电镜形态特征(×4000×1.45)
图4人胎儿胰腺干细胞生长曲线
图5人胎儿胰腺干细胞核增殖抗原(PCNA)免疫染色阳性(×50)
图6人胎儿胰腺干细胞胰肠同源域1(PDX1)免疫染色阳性(×200)
图7人胎儿胰腺干细胞胰高血糖素(glucagon)免疫染色阳性(×200)
图8人胎儿胰腺干细胞胰岛素(insulin)免疫染色阳性(×100)
图9人胎儿胰腺干细胞角蛋白19(CK19)免疫染色阳性(×100)
图10人胎儿胰腺干细胞巢蛋白(nestin)免疫染色阳性(×200)
图11人胎儿胰腺干细胞免疫染色对照(×50)
图12 RT-PCR，人胎儿胰腺干细胞转录胰肠同源域1(PDX1)、胰高血糖素(glucagon)和巢蛋白(nestin)
图13定向诱导人胎儿胰腺干细胞分化为双硫腙(DTZ)染色阳性的胰岛细胞团(×200)
图14A 47代人胎儿胰腺干细胞染色体(×400)
图14B 47代人胎儿胰腺干细胞染色体核型
图15人胎儿胰腺干细胞线粒体DNA序列
图16原代人胎儿胰腺干细胞单克隆性扩增(×50)
图17纯化的人胎儿胰腺干细胞克隆性扩增(×50)
图18人胎儿胰腺干细胞呈铺路石样生长(×100)
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人依上述技术方案完成的具体实例对本发明作进一步的详细描述。
1.建立人胎儿胰腺干细胞系
1.1分离、克隆原代人胎儿胰腺干细胞
无菌采取4～6月龄正常流产胎儿胰腺组织，用含双抗(青霉素8万U/ml，10万U/ml)0.1M PBS(-)反复清洗5～6遍，剪碎组织块至1mm³。0.1％IV型胶原酶(collegenIV，sigma)消化15～40min，镜下见大量单个细胞时，终止消化。消化悬液经0.2mm孔径滤纱过滤，离心(1000r.p.m，5min)。弃上清，离心管内细胞稀释后接种于培养皿，加DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素(DMEM，Sigma；NBS，自制；青霉素，链霉素，国产)基础培养液，CO₂培养箱(5％CO₂，饱和湿度，37℃)中培养，每二天换液一次。24h后，细胞贴壁生长，3～5d，见克隆性生长的上皮样细胞及成纤维细胞(图16)。
1.2纯化人胎儿胰腺干细胞
当上皮样细胞贴壁生长成片后，0.1M PBS(-)清洗，0.25％胰酶+0.04％EDTA(tripsin、EDTA，Sigma)消化原代贴壁生长细胞传代，以DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素为基础培养液培养，在传代中逐渐消除成纤维样细胞及其它杂细胞，获得纯化的呈克隆性生长的上皮样人胎儿胰腺干细胞(图17)。
1.3快速克隆人胎儿胰腺干细胞
0.25％胰酶+0.04％EDTA消化细胞，DMEM+10％NBS+10ng/ml表皮生长因子(EGF)+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素(EGF，Sigma)贴壁培养人胎儿胰腺干细胞。以1×10⁵的细胞密度接种7.5cm培养皿，通常3～4d纯化的细胞生长至75％融合，呈铺路石样(图18)。
1.4冷冻保存人胎儿胰腺干细胞
冷冻：待纯化胰腺干细胞生长至75％融合时，0.1M PBS(-)清洗，以0.25％胰酶+0.04％EDTA消化细胞，加含有血清的培养液终止消化，离心，收集细胞。以80％DMEM+10％DMSO+10％NBS(DMSO，sigma)为基础冷冻液，稀释细胞至1×10⁵，并分装于冷冻管(0.5毫升/管)。4℃平衡30min，液氮面上悬浮2h，投入液氮保存。
解冻：取出冷冻细胞管，迅速投入36～38℃水域中解冻。用培养液清洗解冻细胞2～3遍，脱去冷冻液，进行培养。取少量细胞，经胎盘蓝染色检测成活率。
采取以上分离、纯化、快速扩增及冷冻保存方法，已获得大量纯化的人胎儿胰腺干细胞。其中，1例男性胎儿来源的胰腺干细胞已稳定扩增1年以上，传50代，冷冻保存细胞数达1×10⁹。
2.人胎儿胰腺干细胞系的鉴定
经多种方法鉴定，本发明分离克隆的人胎儿胰腺干细胞系具有以下特征：
2.1形态特征
H.E染色：人胎儿胰腺干细胞完全贴壁后呈多角形上皮样，核多为圆形(图1)。染色方法参照司徒振强，吴军正.细胞培养[M].世界图书出版公司，1996。略。
Giemsa染色：人胎儿胰腺干细胞为单核仁、双核仁或多核仁细胞(图2)。染色方法参照司徒振强，吴军正.细胞培养[M].世界图书出版公司，1996。略。
电镜：细胞核质比大，胞质无分泌颗粒，线粒体、内质网等细胞器均不发达，属于发育早期胰腺细胞(图3)。
电镜制片方法：当胰腺干细胞生长至75％融合时，0.1M PBS(-)清洗，用细胞刮刮下贴壁生长上皮样细胞，离心(1000r.p.m，10min)，弃上清，加2.5％戊二醛电镜固定液，4℃过夜。0.1M PBS(-)淋洗，酒精脱水，环氧丙烷淋洗，环氧树脂(Sigma)包埋，60℃聚合过夜。2μm切片，甲苯胺蓝染色。80nm超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，PhilipsCM10电镜观察。
2.2生长曲线
生长曲线(图4)测定结果表明，人胎儿胰腺干细胞接种1～2d生长缓慢，3～5d为细胞数倍增期。从细胞生长曲线及1年以上细胞扩增生长情况看，该细胞为永生化人胎儿胰腺干细胞。
生长曲线测定方法参照司徒振强，吴军正.细胞培养[M].世界图书出版公司，1996。略。
2.3免疫组化染色
免疫组化染色显示人胎儿胰腺干细胞表达核增殖抗原(PCNA)(图5)、胰肠同源域1(PDX1)(图6)、胰高血糖素(glucagon)(图7)、胰岛素(Insulin)(图8)、角蛋白19(CK19)(图9)及巢蛋白(nestin)(图10)，不表达分化抗原CD34、CD44、CD45蛋白。对照(图11)。
采用SP(Streptavidin/Peroxidase，免疫组化染色试剂盒，北京中山生物技术有限公司)法检测。人胎儿胰腺干细胞生长至75％融合时，弃培养液，0.1M PBS(-)冲洗3遍，4％多聚甲醛固定10min。0.1M PBS(-)冲洗3遍，3％H₂O₂作用10min以消除内源性过氧化物酶。蒸馏水冲洗1遍，0.1M PBS(-)浸泡5min，滴加正常山羊血清工作液(SP-9000)，室温孵育15min封闭。加一抗(1∶500稀释的兔多抗PDX1抗体，1∶2000稀释的小鼠单抗glucagon抗体，1∶100稀释的豚鼠抗牛insulin抗体，以及1∶50稀释的小鼠抗人CK19抗体，Sigma；小鼠单抗PCNA抗体工作液，1∶100稀释的兔抗小鼠nestin抗体，小鼠抗人CD34抗体工作液，小鼠抗人CD44抗体工作液，以及小鼠抗人CD45抗体工作液，武汉博士德生物工程有限公司)，4℃过夜。0.1M PBS(-)洗涤5min，3次，滴加通用型生物素标记羊抗小鼠IgG(SP-9000)，37℃孵育15min。0.1M PBS(-)洗涤5min，3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃孵育15min。0.1M PBS(-)洗涤5min，3次，滴加显色剂DAB(ZLI-9033)显色，Leica镜下观察，照相。对照组一抗用0.1M PBS(-)代替。
2.4 RT-PCR
RT-PCR法检测，人胎儿胰腺干细胞转录胰肠同源域1(Pd×1)、胰高血糖素(glucagon)及巢蛋白(nestin)(图12)。RT-PCR方法如下：
提取细胞总RNA传23代的人胎儿胰腺干细胞生长至75％融合时，弃培养液，用0.1MPBS(-)洗涤1次，加1ml Trizol分离液(剂量为1ml/10cm²培养皿，Sigma)，吹打混匀，室温下静置5分钟，使核蛋白完全裂解，移入2ml微量离心管。加200ul三氯甲烷(剂量为200ul三氯甲烷/1mlTrizol)，盖好微量离心管，上下混匀15秒，室温静置培养2～3分钟：低温离心(12000g，15min，4℃)，分层。将液层移入另一微量离心管，加0.5ml异丙醇(剂量为0.5ml异丙醇/1mlTrizol)，吹打混匀，室温下静置培养10分钟，形成沉淀颗粒，低温离心(12000g，10min，4℃)。离心管弃液，加75％乙醇1ml(无水乙醇750ul，无核酶水250ul，)，剧烈旋转震荡使沉淀浮起，洗RNA，低温离心(7500g，5min，4℃)。弃液，室温干燥10min。利用电泳仪分离RNA，成相仪上观察其浓度和纯度。
反转录扩增  取1ug(2ul)已测定RNA放入微量离心管，70℃水浴10分钟，短暂旋转振荡，置冰上。
反应体系：
成分                                                剂量
Mgcl₂，25mM                                        4.0ul
Reverse Transcription 10×Buffer                    2.0ul
dNTP，10mM                                          2.0ul
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor           0.5ul
AMV Reverse Transcriptase                           0.3ul
Oligo(dT)₁₅ Primer                                 1.0ul
Total RNA                                           2.0ul
Nuclease-Free Water                                 8.2ul
共计                                        20.0ul
注：所用试剂均为大连宝生物工程有限公司产品。置20ul反应管于42℃培养1小时。95℃加热5分钟，4℃培养5分钟，-20℃贮藏cDNA。
PCR扩增：
(1)设计引物根据基因库中人胰肠同源域1(Pd×l)、胰高血糖素(glucagon)及巢蛋白(nestin)序列设计引物。稀释引物，-20℃贮藏。
胰肠同源域1(PDX1，441bp)引物：正链引物L 5’-TGGCGCACCTTCACCACCAC-3’
                              反链引物H 5’-CCTGCTCAGGCTCCGCGACC-3’
胰高血糖素(glucagon，353bp)引物：正链引物L 5’-AGCATTTACTTTGTGGCTGG-3’
                                 反链引物H 5’-ATGAATTCCTTGGCAGCTTG-3’
巢蛋白(nestin，334bp)引物：正链引物L 5’-TTCTGTGAGTGTCAGTGTCC-3’
                           反链引物H 5’-CTCAGAGACTAGCGGCATTC-3’
(2)PCR反应体系：
成分                                    剂量
first-strand cDNA reaction              5.0ul
dNTP，10mM                              1.0ul
Mgcl₂，25mM                            3.5ul
Reverse Transcription 10×Buffer        5.0ul
正链引物L                               0.5ul
反链引物H                               0.5ul
Taq DNA Polymerase                      1.0ul
双蒸水                                  33.5ul
共计                                    50.0ul
注：所用试剂均为大连宝生物工程有限公司产品。
加好后，每管滴1滴石蜡油(约10ul)，防于燥。稍作离心(1000r.p.m，5min)。
(3)PCR反应条件：
胰肠同源域1(PDX1)，94℃变性2min，然后93℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1min，循环40次，最后，72℃再延伸10min。
胰高血糖素(glucagon)，94℃变性2min，然后93℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，循环40次，最后，72℃再延伸10min。
巢蛋白(nestin)，94℃变性2min，然后93℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，循环40次，最后，72℃再延伸10min。
1.0％琼脂糖凝胶电泳利用电泳仪分离反转录扩增片段，成相仪上观察，照相。
2.5定向诱导分化为功能性胰岛
人胎儿胰腺干细胞可定向诱导分化为双硫腙(DTZ)染色阳性的细胞团(图13)，且分泌glucagon和insulin。
定向诱导方法参照Ramiya等(Nat Med，2000，6(3)：278-282.)的方法并加以改进。人胎儿胰腺干细胞接种后扩增培养2d，换用诱导液DMEM+10％NBS+10mM烟酰胺+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素(烟酰胺，nicotinamide，Sigma)连续诱导培养25d。
双硫腙染色方法参照Shiroi等(Stem Cells，2002：20：284-292)。人胎儿胰腺干细胞诱导培养25d，见大量类胰岛细胞团时，进行DTZ染色。称0.01g DTZ(sigma)溶于1ml DMSO，-15℃保存，作为贮备液。取贮备液按1∶100稀释入培养液作为工作液。诱导细胞弃原培养液，0.1M PBS(-)洗3遍，加入DTZ工作液，37℃，孵育15min。0.1MPBS(-)洗3遍，Leica镜下观察，照相。弃染色液，加原诱导培养液，24h后红色消失。
采用放射免疫法(RIA)测定胰岛素(insulin)和胰高血糖素(glucagon)(胰岛素和胰高血糖素放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所)。
传至19代的人胎儿胰腺干细胞接种6孔板，每孔细胞数为3×10⁴。细胞扩增培养2d后换用诱导液DMEM+10％NBS+10mM烟酰胺+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素连续诱导培养25d。弃诱导液，0.1M PBS(-)洗3遍，每孔加无血清DMEM 1ml，37℃，孵育2h。收集培养液，离心(2000r.p.m，10min)，收集上清液。-20℃保存，用于测定激素。测定结果计算平均数，insulin释放量为7.27uIU/ml，glucagon释放量为49.72pg/ml。
2.6染色体核型分析
传至47代的人胎儿胰腺干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对。染色体核型正常(图14A、14B)。
核型分析方法参照高锦声等编著.人类染色体方法学手册.江苏省医学情报研究所，1982.
27代的人胎儿胰腺干细胞按3×10⁵个/ml的密度接种于Φ6cm培养皿中，贴壁培养72h。用终浓度为0.2μg/ml的秋水仙素(Sigma)处理3h，使多数细胞染色体停于中期分裂相。0.25％胰酶消化细胞，DMEM培养液中和，离心，收集细胞。加1～2ml 0.075M KCl，37℃恒温水浴下低渗处理25min。加1ml甲醇-冰醋酸固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1，现用现配)，用吸管吹打混匀，再加入3ml固定液，静置10min，离心(1000r.p.m，5min)。反复固定2～3次，时间控制在50分钟左右。制片、染色、镜检。40倍镜下选择分散良好的染色体照相。核型分析，求出臂比值、相对长度，并根据所测数据，结合目测，按染色体形态、大小、臂比值、长度是否相等进行同源染色体配对。扫描。
2.7线粒体DNA序列测定及分析
提取人胎儿胰腺干细胞总DNA，进行线粒体DNA(mtDNA)D-loop的PCR扩增、测序，结果见图15。采用Clustal W(1.82)软件对所测的人胎儿胰腺干细胞与正常人细胞的mtDNA D-loop区序列进行同源序列比对分析，同源性为98％。证明本研究分离克隆的人胎儿胰腺干细胞是人源性胎儿胰腺干细胞。具体方法如下：
提取人胎儿胰腺干细胞总DNA按照酚-氯仿法进行DNA提取。传26代地人胎儿胰腺干细胞生长至75％融合时，0.25％胰酶+0.04％EDTA消化，收集细胞，加PBS(-)悬浮细胞于50ml离心管。室温，3500g，离心15min。弃上清液。沉淀物中加入3.5ml提取液使其悬浮，37℃水浴1h。加入25μl 20mg/ml的蛋白酶K(Sigma)并混匀，60～65℃恒温箱中温育3h。加入1倍体积酚(pH 8.0)，置旋转摇床口底晃动10～30min。5000g，4℃，离心20min。移上面水相于另一离心管中，加0.5倍体积酚和0.5倍体积氯仿，口底摇动10min。5000g，4℃，离心15min。移上面水相至另一离心管中，加1倍体积氯仿，口底摇动10min。5000g，4℃，离心15min。移上面水相至另一离心管中。加0.2倍体积醋酸铵，置冰上。加2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻口底上下晃动多次，直到DNA析出。然后冰上放置10～30min。用一玻璃钩将白色DNA团钩出，放进一个1.5ml的离心管中，加入500μl 70％乙醇并晃动。5000g，离心3～5min。倾倒出乙醇，空气干燥4～5h。根据DNA的量，加入500～1000μl TE-缓冲液，保存于4℃过夜，使其完全溶解，-80℃保存。
琼脂糖检测总DNA取10μl总DNA，在含有EB(终浓度为0.5μg/ml)的1.0％琼脂糖凝胶溶液中，55V，电泳1h，并经荧光扫描仪检测。
线粒体DNA(mtDNA)D-loop的PCR扩增(1)引物设计：扩增引物为人的特异性引物，引物设计参考(Vigilant L，et al.Proc Natl Acad Sci，USA.1989，86：9350-9354)。引物序列为：
正链引物L15996：5’-CTCCACCATTATCACCCAAAGC-3’
反链引物H16401：5’-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3’
(2)PCR反应体系：
成分                                 剂量
10×Buffer                           5.0μl
dNTPs，2.5mM                         5.0μl
Mgcl₂，25mM                         5.0μl
Taq酶(5U/μl)                        0.5μl
引物L15996(100ng/μl)                2.0μl
引物H16401(100ng/μl)                2.0μl
DNA(50ng/μl)                        4.0μl
纯水                                 26.5μl
总体积                               50.0μl
注：所用试剂均为上海生工生物工程公司产品。
(3)PCR扩增反应条件：94℃变性2min，然后93℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环7次，93℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸1min，循环25次，最后，72℃再延伸10min。
纯化与回收PCR产物1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小、纯度及亮度。用Omega公司(美国)回收试剂盒纯化与回收PCR产物。
线粒体DNA的测序及分析纯化与回收后的PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。引物序列为：引物1，L15996：5’-CTCCACCATTATCACCCAAAGC-3’；引物2，H16401：5’-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3’。结果见图15。
利用Clustal W(1.82)软件对所测的mtDNA D-loop区序列进行同源序列比对分析，人胎儿胰腺干细胞与正常人细胞的mtDNA D-loop区序列同源性为98％。
>人胎儿胰腺干细胞D-loop
CAGATTTGGGTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACAACCGCTATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCA
TGAATATCGTACGGTACCATAAATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCCCCTCCCC
ATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCTTCAACTATCACACATCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCAC
TAGGATATCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGT
CAAATCCCTTCTCGCCCCCATGGATGACCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCTCCG
>正常人D-loop
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gccaccatga atattgtacg gtaccataaa tacttgacca cctgtagtac ataaaaaccc aacccacatc
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gggtcccttg accaccatcc tccg
Sequence 1：人胎儿胰腺干细胞  373bp；
Sequence 2：正常人            374bp；
Sequences(1∶2)Aligned.Score：98