用于调节平滑肌张力的基因转移.pdf

本发明提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含向被试者的平滑肌细胞中引入编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列并使其在被试者足够数目的平滑肌细胞中表达以在被试者中调节平滑肌张力。本发明提供了用于治疗勃起机能障碍、膀胱机能障碍和其他平滑肌病症的基因转移方法。

1.  一种在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包括在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列包含可操作地与编码调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的序列连接的平滑肌特异性启动子，即平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。

2.  一种在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包括在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列编码调节平滑肌张力的电压依赖性钾通道蛋白质。

3.  一种在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包括在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列编码调节平滑肌张力的非大电导的钙敏感性钾通道蛋白质。

4.  权利要求1、2或3的方法，其中该平滑肌细胞为动脉平滑肌细胞、静脉平滑肌细胞或内脏平滑肌细胞。

5.  权利要求4的方法，其中该平滑肌细胞位于被试者的膀胱、血管壁、胃肠道、肺支气管、盆内筋膜、阴茎、前列腺、输尿管、尿道、子宫或输精管。

6.  权利要求4的方法，其中该内脏平滑肌细胞为膀胱平滑肌细胞、corporal smooth muscle细胞、胃肠平滑肌细胞、前列腺平滑肌细胞或尿道平滑肌细胞。

7.  权利要求1、2或3的方法，其中该DNA序列为基因组DNA或cDNA。

8.  权利要求1、2或3的方法，其中该钾通道蛋白质调节平滑肌的松弛。

9.  权利要求8的方法，其中该钾通道蛋白质调节corporalsmooth muscle的松弛。

10.  权利要求1的方法，其中该钾通道蛋白质是maxi-K、K_ATP、Kv1.5或SK3。

11.  权利要求1的方法，其中该平滑肌细胞是corporal smoothmuscle细胞且钾通道蛋白质是maxi-K。

12.  权利要求2的方法，其中该电压依赖性钾通道蛋白质是Kv1.5。

13.  权利要求3的方法，其中该非大电导的钙敏感性钾通道是中等电导的钙敏感性钾通道。

14.  权利要求3的方法，其中该非大电导的钙敏感性钾通道是小电导的钙敏感性钾通道。

15.  权利要求14的方法，其中该小电导的钙敏感性钾通道是SK3。

16.  权利要求2或3的方法，其中该DNA序列进一步包含可操作地与编码钾通道蛋白质的序列连接的启动子。

17.  权利要求16的方法，其中该启动子是平滑肌特异性启动子。

18.  权利要求17的方法，其中该平滑肌特异性启动子是平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。

19.  权利要求1、2或3的方法，其中该DNA序列是通过选自如下的方法引入的：滴注治疗法、电穿孔、DEAE葡聚糖、阳离子脂质体融合、原生质体融合、体内电场的创建、DNA包被的微粒轰击、重组复制缺陷型病毒的注射、同源重组、雾化、裸露DNA转移。

20.  权利要求19的方法，其中该DNA序列是通过裸露DNA转移引入的。

21.  权利要求1、2或3的方法，其中该DNA序列是用EYFP载体引入的。

22.  权利要求1、2或3的方法，其中该DNA序列是通过直接注射入平滑肌壁中而引入的。

23.  权利要求22的方法，其中该平滑肌是膀胱。

24.  权利要求1、2或3的方法，该方法进一步包括转染离体细胞及将转染的细胞移植入被试者中。

25.  权利要求1、2或3的方法，其中该被试者具有升高的平滑肌收缩性，且对平滑肌张力的调节降低了被试者中平滑肌的收缩性。

26.  权利要求25的方法，其中该平滑肌细胞是阴茎平滑肌细胞或膀胱平滑肌细胞。

27.  权利要求1、2或3的方法，其中该被试者患有选自如下的功能障碍：哮喘；前列腺良性增生(BPH)；冠状动脉疾病；勃起机能障碍；盆内筋膜、前列腺、输尿管、尿道、泌尿道或输精管的泌尿生殖功能障碍；胃肠动力紊乱；便秘；腹泻；过敏性肠综合征；偏头痛；早产；Raynaud氏综合征；尿失禁；膀胱机能障碍；静脉曲张和血栓闭塞性脉管炎。

28.  权利要求27的方法，其中该功能障碍是勃起机能障碍。

29.  权利要求11的方法，其中该被试者具有勃起机能障碍。

30.  权利要求28或29的方法，其中该勃起机能障碍由平滑肌不完全松弛引起，该平滑肌不完全松弛归因于神经原性功能障碍、动脉原性功能障碍和/或静脉闭塞性功能障碍。

31.  权利要求27的方法，其中该功能障碍是膀胱机能障碍。

32.  权利要求31的方法，其中该膀胱机能障碍由膀胱过度活动导致。

33.  权利要求27-32中任何一项的方法，其中对该功能障碍进行治疗。

34.  权利要求1、2或3的方法，其中该钾通道蛋白质通常不表达于平滑肌细胞中。

35.  一种在被试者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包括在被试者足够数目的corporal smooth muscle细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的corporal smooth muscle张力，从而治疗被试者的勃起机能障碍，该DNA序列包含可操作地与编码调节corporal smoothmuscle张力的钾通道蛋白质的序列连接的平滑肌特异性启动子，即平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。

36.  权利要求35的方法，其中该钾通道蛋白质是maxi-K、K_ATP、Kv1.5或SK3。

37.  一种在被试者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包括在被试者足够数目的corporal smooth muscle细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的corporal smooth muscle张力，从而治疗被试者的勃起机能障碍，该DNA序列编码调节corporal smooth muscle张力的电压依赖性钾通道蛋白质。

38.  权利要求37的方法，其中该电压依赖性钾通道蛋白质是Kv1.5

39.  一种在被试者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包括在被试者足够数目的corporal smooth muscle细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的corporal smooth muscle张力，从而治疗被试者的勃起机能障碍，该DNA序列编码调节corporal smooth muscle张力的非大电导的钙敏感性钾通道蛋白质。

40.  权利要求39的方法，其中该非大电导的钙敏感性钾通道是中等电导的钙敏感性钾通道。

41.  权利要求39的方法，其中该非大电导的钙敏感性钾通道是小电导的钙敏感性钾通道。

42.  权利要求41的方法，其中该小电导的钙敏感性钾通道是SK3。

43.  权利要求1的方法，其中应用可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA序列连接的平滑肌特异性启动子SMAA在被试者中调节平滑肌张力至少与应用可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA序列连接的病毒启动子是同样有效的。

44.  权利要求35的方法，其中应用可操作地与编码调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列连接的平滑肌特异性启动子SMAA在被试者中治疗勃起机能障碍至少与应用可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA序列连接的病毒启动子是同样有效的。

用于调节平滑肌张力的基因转移
发明背景
[0001]许多生理学功能障碍或病症是由平滑肌张力失调引起的。其中包括哮喘；前列腺良性增生(BPH)；冠状动脉疾病；勃起机能障碍；膀胱、盆内筋膜、前列腺、输尿管、尿道、泌尿道和输精管的泌尿生殖功能障碍；过敏性肠综合征；偏头痛；早产；Raynaud氏综合征；静脉曲张；和血栓闭塞性脉管炎。
[0002]在这些功能障碍中，勃起机能障碍是常见的疾病，在美国估计可影响1000～3000万男性(Feldman等人，Journal of ClinicalEpidemiology，47(5)：457-67，1994；和Anonymous，InternationalJournal of Impotence Research，5(4)：181-284，1993)。勃起机能障碍的主要疾病相关性原因中有衰老、动脉粥状硬化、慢性肾病、糖尿病、高血压和抗高血压药物治疗、骨盆手术和放射治疗及心理焦虑(Feldman等人，Journal of Clinical Epidemiology，47(5)：457-67，1994)。对这许多和多面性疾病状态的血管创伤的直接治愈在不久的将来不可能发生。
[0003]在过去的十年中发展了几种治疗形式来直接恢复减少的勃起能力。然而，大多数目前可用的治疗或者是非特异性的(如激素治疗)、具有有限的总成功率(如真空勃起设备)、侵袭性的(如体内注射治疗)，或者是不可逆且昂贵的(如阴茎假器官植入手术)。尽管有这些治疗限制，但美国食品药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)(FDA)批准CAVERJECT^用于勃起机能障碍的海绵窦内治疗(1995年7月6日)、批准MUSE^用于治疗勃起机能障碍中的尿道内给药(1996年11月19日)及批准VIAGRA^(1998年3月27日)和LEVITRA^(2003年8月19日)用作治疗勃起机能障碍的口服治疗剂，这些代表了主要的进步。勃起机能障碍问题的重要性和对更有效治疗的渴望通过开具VIAGRA^的处方数目而突显。本质上，美国联邦政府的这些举动已导致对勃起机能障碍问题医学特性的正式认识，且此外已使其临床治疗合法化了。
[0004]研究已证明改变的corporal smooth muscle张力是大部分阳萎男性中勃起机能障碍的最直接的原因，该改变的corporal smoothmuscle张力导致升高的收缩性或消弱的舒张。这些研究进一步显示corporal smooth muscle的完全舒张是恢复勃起能力的必要和充分条件，除非存在严重动脉疾病或先天性结构异常，而这只在极少数患者中出现。目前批准的治疗勃起机能障碍疗法的功效证实了该推测的正确性，这些疗法包含直接或间接致使平滑肌舒张的试剂，包括PGE1(CAVERJECT^、EDEX^和MUSE^)、Sildenafil(VIAGRA^)和Vardenafil(LEVITRA^)。
[0005]corporal smooth muscle细胞在勃起功能中发挥的重要作用使其成为在治疗勃起机能障碍中进行分子干预的极好目标。前面的努力已集中于向血管平滑肌细胞进行基因转移的技术上，该技术是潜在的几种心血管疾病疗法的基础。其中有动脉粥状硬化、脉管炎、气囊血管成形术后的再狭窄(restenosis)和肺动脉高压。这些初始的研究已提供了关于平滑肌细胞中基因转移方法效率和持续性的重要信息(Finkel等人，FASEB Journal，9：843-51，1995；Pozeg等人，Circulation 107：2037-44，2003)。因为勃起机能障碍主要由改变的平滑肌张力引起，所以以参与平滑肌张力改变的基因为目标的基因转移方法是极其想要的。用于减轻勃起机能障碍的基因转移的成功方法是非常需要的，这是因为它是目前采用的方法的优选的替代方法。
[0006]异常的膀胱功能是显著影响美国数百万男性和女性生活质量的另一个常见问题。许多常见疾病(如BPH、糖尿病、多发性硬化和中风)可改变正常的膀胱功能。膀胱功能中显著困难的变化也是逐渐衰老的结果。
[0007]改变的膀胱生理学有两种主要的临床表现：张力缺乏的膀胱和过度活动的膀胱(Abrams P等人，Neurourol.Urodyn.21(2)：167-78，2002)。张力缺乏的膀胱由于逼尿平滑肌(膀胱壁的平滑肌)低效的收缩性而具有降低的排空其尿内容物的能力。在张力缺乏状态时，降低的平滑肌收缩性包含于膀胱机能障碍的病因学中。因而，对平滑肌张力的药理学调节不足以矫正潜在的问题是不令人惊讶的。事实上，治疗该病症的主要方法采用了未污染间歇性插管术；这是防止慢性泌尿道感染、肾盂肾炎和最终的肾衰竭的成功方法。这样，对张力缺乏地膀胱的治疗减轻了疾病的症状，但未矫正潜在的原因。
[0008]相反地，过度活动的膀胱自发地收缩；这将导致欲望性失禁，其中个体不能控制尿的通过。过度活动的膀胱是比张力缺乏的膀胱更难治疗的临床问题。已用于治疗该病症的药物治疗通常仅是部分有效的，且具有显著的副作用，该副作用限制了患者的药物应用和继续用药的积极性。目前可接受的治疗选择(如奥昔布宁和托特罗定)主要是非特异性的，且大多数常涉及膀胱肌细胞上毒蝇碱受体通路和/或钙通道的阻塞。鉴于这两个通路在体内许多器官系统的细胞功能中的重要性，这种非特异性的治疗策略不仅是调节膀胱平滑肌张力的粗略方法；而且由于其作用机制，它们事实上也保证具有显著且不想要的全身性作用。因此，非常需要有对膀胱机能障碍的改善的治疗选择。
[0009]在进行比较的阴茎生理学和膀胱生理学之间有一些生理学相关的相似之处。例如，逼尿平滑肌张力在膀胱机能障碍中起作用，这与勃起机能障碍中corporal smooth muscle张力充分表征的作用相似。特别地，过度活动的膀胱特征在于升高的收缩性，而张力缺乏的膀胱特征在于消弱的收缩性。治疗过度活动的膀胱的药物学疗法一般涉及频繁的膀胱内滴注，即一种患者常发现是不方便或不想要的治疗。简言之，频繁进行膀胱内滴注以恢复膀胱肌细胞功能是不想要的，且全身性药物治疗仍然缺乏可耐受的特异性。然而，逼尿平滑肌细胞在膀胱功能中发挥的重要作用及其通过膀胱内滴注跨过尿道上皮的可接近性使得它成为膀胱机能障碍治疗中分子干预的极好目标。
[0010]因为勃起机能障碍和膀胱机能障碍主要是由改变的平滑肌张力引起的，所以以参与平滑肌张力调节的基因为目标的基因转移方法是极其想要的，这是因为该方法可提供减轻膀胱机能障碍和勃起机能障碍的新方法。类似地，以参与平滑肌张力调节的基因为目标的基因转移方法非常适于用作减轻其他平滑肌功能障碍的方法，该其他平滑肌功能障碍包括但不局限于哮喘；BPH；冠状动脉疾病(在血管造影术中灌注)；盆内筋膜、前列腺、输尿管、尿道、泌尿道和输精管的泌尿生殖功能障碍；过敏性肠综合征；偏头痛；早产；Raynaud氏综合征；静脉曲张和血栓闭塞性脉管炎。
[0011]在人平滑肌相关病症的病因学中猜测有离子通道活性的改变，该病症诸如哮喘、膀胱机能障碍、勃起机能障碍和高血压。在所有这些组织中，肌细胞钾(K⁺)通道在介导各种内源物质对平滑肌张力的作用中起重要的作用。已经鉴定了超过30个K⁺通道的基因，其中许多是在平滑肌中表达的(Lawson，K，Clinical Science，91：651-63，1996；Lawson，K，Pharmacol.Ther.，70(1)：39-63，1996；和Ashcroft，F.M.，ed.，Ion Channels and Disease：Channelpathies，New York：Academic Press，2000)。在人身体(阴茎)平滑肌中至少已鉴定了4个K⁺通道亚型。这包括(1)代谢门控K⁺通道(即K_ATP)，(2)大电导(large-conductance)的钙敏感性K⁺通道(即K_Ca或maxi-K通道)，(3)延迟整流通道和(4)电压依赖性快速瞬时“A”电流通道(Christ等人，Int.J.Impotence Res.5：77-96，1993；J.Androl.14：319-28，1993)。
[0012]Christ等人(美国专利No.6,271,211 B1)讲授了治疗由升高的阴茎平滑肌收缩性导致的阴茎松弛的方法，该方法包含直接向被试者的阴茎平滑肌细胞中引入编码K_ATP通道亚基蛋白质Kir6.2的DNA序列。类似地，Geliebter等人(美国专利No.6,150,338)讲授了诱导阴茎勃起的方法，该方法包含将编码maxi-K通道蛋白质的DNA引入到被试者的阴茎平滑肌细胞中。Christ等人(美国专利No.6,239,117 B1)讲授了治疗由升高的膀胱平滑肌收缩性导致的膀胱机能障碍的方法，该方法包含向被试者的膀胱平滑肌细胞中引入编码maxi-K通道蛋白质的DNA。然而，美国专利No.6,150,338、6,239,117和6,271,211均未讲授通过应用电压依赖性钾通道蛋白质、非大电导(non-large conductance)的钙敏感性钾通道蛋白质或可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA连接的平滑肌特异性启动子平滑肌α肌动蛋白(SMAA)来调节平滑肌张力。
发明概述
[0013]本发明提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列包含可操作地与编码调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的序列连接的平滑肌特异性启动子平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。
[0014]本发明也提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列编码调节平滑肌张力的电压依赖性钾通道蛋白质。
[0015]本发明进一步提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列编码调节平滑肌张力的非大电导的钙敏感性钾通道蛋白质。
[0016]本发明的额外目的从随后的描述中是显而易见的。
附图概述
[0017]图1.多个钾通道亚型的治疗功效。在年老的(retired)种畜大鼠中显示了不同海绵体神经刺激强度时海绵体内压力(ICP)与血压(BP)的比例，在该大鼠中向corporal smooth muscle细胞引入了编码钾通道蛋白质Kv1.5或SK3的核酸。也显示了不接受钾通道蛋白质基因转移的年龄匹配对照(AMC)中的结果。在用SK3或Kv1.5转染的实验动物中获得了与阴茎勃起相当的超过0.6的ICP/BP比例(水平的虚线)，但在对照动物中未获得。mA＝毫安。
[0018]图2.平滑肌特异性启动子的功效。在年老的种畜大鼠中显示了不同海绵体神经刺激强度时海绵体内压力(ICP)与血压(BP)的比例，在该大鼠中向corporal smooth muscle细胞引入了编码钾通道蛋白质maxi-K的核酸(hSlo)与通用病毒(巨细胞病毒)启动子(pVAC/hSlo)或平滑肌特异性启动子(平滑肌α肌动蛋白，SMAA/hSlo)的组合。也显示了用含有20％蔗糖的磷酸缓冲盐溶液(PBS)注射的年龄匹配对照(AMC)中的结果。在两个实验动物组中均获得了与阴茎勃起相当的超过0.6的ICP/BP比例(水平的虚线)，但在对照动物中未获得。mA＝毫安。
发明详述
[0019]本发明提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列包含可操作地与编码调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的序列连接的平滑肌特异性启动子，即平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。优选的钾通道蛋白质是大电导的钙敏感性钾通道蛋白质maxi-K、代谢门控的和内向整流的钾通道蛋白质K_ATP、电压依赖性钾通道蛋白质Kv1.5和小电导的钙敏感性钾通道蛋白质SK3。在优选的实施方案中，平滑肌是corporal smooth muscle细胞或膀胱平滑肌细胞，且钾通道蛋白质是maxi-K。优选地，在被试者中应用可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA序列连接的平滑肌特异性启动子SMAA调节平滑肌张力至少与应用可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA序列连接的病毒启动子是同样有效的。
[0020]本发明也提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列编码调节平滑肌张力的电压依赖性钾通道蛋白质。电压依赖性钾通道蛋白质包括Kv1.1、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1、Kv3.1b、延迟整流通道(delayed rectifierchannel)和快速瞬时“A”电流通道(fast transient“A”current channeD。在一个优选的实施方案中，电压依赖性钾通道蛋白质是Kv1.5。优选地，该DNA序列进一步包含可操作地与编码电压依赖性钾通道蛋白质的序列连接的启动子。优选地，该启动子是平滑肌特异性启动子。更优选地，该平滑肌特异性启动子是平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。
[0021]本发明进一步提供了在被试者中调节平滑肌张力的方法，该方法包含在被试者足够数目的平滑肌细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的平滑肌张力，该DNA序列编码调节平滑肌张力的非大电导的钙敏感性钾通道蛋白质。如在此处所用的，“非大电导的钙敏感性钾通道”指中等电导的钙敏感性钾通道或小电导的钙敏感性钾通道。小电导的钙敏感性钾通道包括SK1、SK2和SK3。优选地，小电导的钙敏感性钾通道是SK3。优选地，该DNA序列进一步包含可操作地与编码钾通道蛋白质的序列连接的启动子。优选地，该启动子是平滑肌特异性启动子。更优选地，该平滑肌特异性启动子是平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。
[0022]如在此处所用的，“调节”指对松弛的调节或对收缩的调节。
[0023]可应用基因转移方法的平滑肌细胞的例子包括但不局限于膀胱、胃肠道、肺支气管、阴茎(海绵体)、前列腺、输尿管、尿道(海绵体)、泌尿道和输精管的内脏平滑肌细胞；以及盆内筋膜的平滑肌和/或骨骼肌细胞。本发明的基因转移方法可用于膀胱平滑肌细胞、corporal smooth muscle细胞、胃肠平滑肌细胞、前列腺平滑肌细胞和尿道平滑肌细胞。鉴于在调节平滑肌组织和其他血管组织张力的因素中有许多总体的组织学和生理学相似性，那么相似的原则将允许将基因转移方法应用于膀胱、胃肠道、肺支气管、阴茎(海绵体)、前列腺、输尿管、尿道(海绵体)、泌尿道和输精管的动脉平滑肌细胞。本发明的基因转移方法也可应用于静脉平滑肌细胞。
[0024]在平滑肌细胞中引入并表达的钾通道蛋白质不必是在平滑肌细胞中正常表达的钾通道蛋白质。
[0025]本发明特定地提供了基因转移的方法，其中参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质调节平滑肌的松弛。这些钾通道蛋白质将增强平滑肌的松弛也将降低平滑肌的张力。特别地，当在阴茎平滑肌中增强了松弛时将更易于达到勃起。类似地，当膀胱中自发的平滑肌张力降低时，膀胱的机能亢进将降低。在本发明的该实施方案中，基因转移方法特别适用于治疗具有过度活动膀胱的个体而不影响膀胱排空的能力。如在此处所用的，“过度活动的膀胱”是自发收缩从而个体不能控制尿的通过的膀胱。该泌尿病症更普遍地称为欲望性失禁，且也包括与压迫性尿失禁组合的欲望性失禁。
[0026]在本发明一个优选的实施方案中，被试者具有升高的平滑肌收缩，且通过基因转移对平滑肌张力的调节导致被试者中平滑肌较少升高的收缩性。优选地，该平滑肌细胞为阴茎平滑肌细胞或膀胱平滑肌细胞。
[0027]本发明特定地提供了在被试者中调节阴茎平滑肌张力的方法，该方法包含向被试者的阴茎平滑肌细胞中引入编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列，并使其在被试者足够数目的阴茎平滑肌细胞中表达以在被试者中诱导勃起。在该实施方案中，本发明的方法可用于减轻勃起机能障碍。
[0028]本发明提供了在被试者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包含在被试者足够数目的corporal smooth muscle细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的corporal smooth muscle张力，从而治疗被试者的勃起机能障碍，该DNA序列包含可操作地与编码调节corporal smooth muscle张力的钾通道蛋白质的序列连接的平滑肌特异性启动子，即平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。优选地，该钾通道蛋白质是maxi-K、K_ATP、Kv1.5或SK3。更优选地，该钾通道蛋白质是maxi-K。优选地，在被试者中应用可操作地与编码调节corporalsmooth mnscle张力的钾通道蛋白质的DNA序列连接的平滑肌特异性启动子SMAA治疗勃起机能障碍至少与应用可操作地与编码钾通道蛋白质的DNA序列连接的病毒启动子是同样有效的。
[0029]本发明也提供了在被试者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包含在被试者足够数目的corporal smooth muscle细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的corporal smooth muscle张力，从而治疗被试者的勃起机能障碍，该DNA序列编码调节corporal smoothmuscle张力的电压依赖性钾通道蛋白质。优选地，电压依赖性钾通道蛋白质是Kv1.5。
[0030]本发明进一步提供了在被试者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包含在被试者足够数目的corporal smooth muscle细胞中引入并表达DNA序列以调节被试者中的corporal smooth muscle张力，从而治疗被试者的勃起机能障碍，该DNA序列编码调节corporalsmooth muscle张力的非大电导的钙敏感性钾通道蛋白质。该非大电导的钙敏感性钾通道蛋白质可为中等电导的钙敏感性钾通道蛋白质或小电导的钙敏感性钾通道蛋白质。优选地，该小电导的钙敏感性钾通道蛋白质是SK3。
[0031]勃起机能障碍可由各种病症引起，该病症包括神经原性的、动脉原性的(arteriogenic)和静脉阻塞性(veno-occlusive)功能障碍，以及导致平滑肌不完全松弛的其他病症。
[0032]此外，本发明特定地提供了在被试者中调节膀胱平滑肌张力的方法，该方法包含向被试者的膀胱平滑肌细胞中引入编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列，并使其在波试者足够数目的膀胱平滑肌细胞中表达以增强被试者的膀胱松弛。在该实施方案中，本发明的方法可用于减轻过度活动的膀胱。过度活动的膀胱可由许多原因引起，该原因包括神经原性的、肌性的(即逼尿肌细胞本身产生增加的收缩性的改变)或动脉原性的(即血管闭锁不全或局部缺血)功能障碍，以及其他可促进膀胱平滑肌调节改变的病症(如糖尿病神经病、多发性硬化、帕金森氏病、中风)。神经原性的膀胱机能障碍自身表现为部分或完全的泌尿潴留或溢流性失禁。膀胱神经原性功能障碍的例子包括低张的或松弛的膀胱及痉挛性或收缩的膀胱。这些功能障碍可由脑、脊髓(如脊柱裂)或膀胱及其出口的局部神经供应的异常、损伤或病程而引起。导致神经原性膀胱机能障碍的病程包括前列腺良性增生(BPH)；脑血管意外伤害；脱髓鞘或退行性疾病，如多发性硬化和肌萎缩性侧硬化；糖尿病；破裂的椎间盘；梅毒；和脑或脊髓肿瘤。
[0033]本发明进一步提供的是基因转移的方法，其中参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质可调节平滑肌的收缩。
[0034]此外，本发明提供了在被试者中减少平滑肌的炎症和兴奋作用的方法，该方法包含向被试者的平滑肌细胞中引入编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列，并使其在被试者足够数目的平滑肌细胞中表达以减少炎症和兴奋作用。例如，由本发明提供的该方法可用于减少膀胱炎的症状，如间质膀胱炎或辐射诱导的膀胱炎。间质膀胱炎是具有炎症和兴奋临床表现的膀胱病症。间质膀胱炎可由如变态反应、自身免疫疾病或胶原疾病引起。此外，在此处提供的基因转移方法可用于如减少被试者输尿管、尿道或泌尿道中平滑肌细胞的炎症和兴奋作用，该作用可由细菌、真菌或寄生物感染引起。
[0035]在本发明的另一个实施方案中，在此处描述的基因转移方法可用于治疗其他与平滑肌表现相关的功能障碍，包括但不局限于哮喘；冠状动脉疾病(在血管造影术中灌注)；输尿管、尿道、泌尿道和输精管的泌尿生殖功能障碍；包括便秘、腹泻或过敏性肠综合征的胃肠动力系乱；偏头痛；早产；Raynaud氏综合征；静脉曲张和血栓闭塞性脉管炎。当用于治疗哮喘时，本发明的基因转移方法可应用本领域中公知的任何方法通过气雾剂送递途径给予被试者。
[0036]在本发明的方法中，被试者可为动物或人，且优选地为人。优选地，被试者所遭受的功能障碍可由本发明的方法治疗。
[0037]目标DNA序列可通过许多本领域技术人员公知的程序引入到平滑肌细胞中，如电穿孔、DEAE葡聚糖、单阳离子脂质体融合、多阳离子脂质体融合、原生质体融合、DNA包被的微粒轰击、体内电场的创建、重组复制缺陷型病毒的注射、同源重组、雾化、应用EYEP载体和通过如膀胱内滴注的裸露DNA转移。DNA序列可通过直接注射入平滑肌壁的方法引入。优选的平滑肌壁是膀胱壁。此外，平滑肌细胞可用DNA序列进行离体转染，且转染的细胞可移植入被试者中。离体转染的细胞可来自向其中移植了转染的细胞的相同被试者。本领域技术人员可以理解上述DNA转移的许多方法可进行组合。该DNA序列可为基因组DNA或cDNA。
[0038]在本发明优选的实施方案中，DNA是用哺乳动物载体通过裸露的DNA转移而转移到平滑肌细胞中的。“裸露的DNA”在此处指在非病毒载体中含有的DNA。该DNA序列可与无菌水溶液组合，该溶液优选地与受体的血液是等渗的。这种溶液可通过将DNA悬浮于含有生理学相容物质(如氯化钠、甘氨酸等)的水中、维持与生理学条件相容的缓冲的pH并使该溶液灭菌而制备的。在本发明一个优选的实施方案中，在引入到平滑肌细胞中的制剂中，该DNA是与20-25％的蔗糖的盐溶液组合的。
[0039]当将DNA转移到膀胱的平滑肌细胞中时，它可通过经由尿道的膀胱内滴注引入到膀胱中，这是治疗膀胱肿瘤的充分确立的疗法。然后该DNA溶液可由患者在膀胱中自主地保留规定的时间段。在另一个实施方案中，该DNA可通过滴注法或注射转移引入到盆内筋膜、前列腺、输尿管、尿道、上部泌尿道或输精管中，并将输尿管、尿道或上部泌尿道阻塞从而使该DNA溶液与内上皮层接触规定的时间段。用于表达的DNA序列也可整合入阳离子脂质体中并直接注射入被试者的平滑肌细胞中。
[0040]本方法可应用病毒和/或非病毒重组载体。基于病毒的载体包含：(1)病毒基因组或至少相应于其部分的核酸，该部分能够指导DNA序列的表达；和(2)编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列，该DNA序列可操作地与病毒核酸连接并能够表达为目标细胞中的功能基因产物。本发明的重组病毒载体可源自本领域中技术人员公知的各种病毒核酸，如腺病毒(adenovirus)、腺伴随病毒(adeno-associated virus)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)、慢病毒属(lentivirus)、Semiliki Forest病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)和其他病毒(包括RNA和DNA病毒)的基因组。
[0041]本发明的重组载体也可含有编码适当的调节元件的核苷酸序列，从而可影响适当宿主细胞中载体构建体的表达。如在此处所用的，“表达”指载体将插入的DNA序列转录为mRNA的能力，从而可发生由插入的核酸编码的蛋白质的合成。本领域的技术人员可理解如下几点：(1)许多增强子和启动子适用于本发明的构建体；和(2)当将重组载体构建体引入到宿主细胞中时，该构建体将含有编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列的正确转录和加工所必需的起始、终止和控制序列。
[0042]由本发明提供的用于在平滑肌细胞中表达编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列的非病毒载体包含本领域技术人员公知的任何下述载体中的全部或部分：pCMVβ(Invitrogen)、pcDNA3(Invitrogen)、pET-3d(Novagen)、pProEx-1(LifeTechnologies)、pFastBac1(Life Technologies)、pSFV(LifeTechnologies)、pcDNA2(Invitrogen)、pSL301(Invitrogen)、pSE280(Invitrogen)、pSE380(Invitrogen)、pSE420(Invitrogen)、pTrcHisA、B、C(Invitrogen)、pRSET A、B、C(Invitrogen)、pYES2(Invitrogen)、pAC360(Invitrogen)、pVL1392和pVl1392(Invitrogen)、pCDM8(Invitrogen)、pcDNAI(Invitrogen)、pcDNAI(amp)(Invitrogen)、pZeoSV(Invitrogen)、pRc/CMV(Invitrogen)、pRc/RSV(Invitrogen)、pREP4(Invitrogen)、pREP7(Invitrogen)、pREP8(Invitrogen)、pREP9(Invitrogen)、pREP10(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pEBVHis(Invitrogen)、λPop6、EYFP(Clontech)和pBF。其他载体对于本领域技术人员也是显而易见的。
[0043]适用于本发明的启动子包括但不局限于组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。在本发明的一个实施方案中，编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质的DNA序列的表达是由向其中引入了该DNA序列的特定载体控制和影响的。对一些真核载体已进行了加工，从而它们能够在宿主细胞中高水平表达插入的核酸。这种载体利用许多有力的启动子之一来指导高水平的表达。真核载体应用病毒基因的启动子-增强子序列，尤其是肿瘤病毒的。本发明的特定实施方案提供了通过应用诱导型启动子对编码蛋白质的DNA序列表达的调节。诱导型启动子的非限制性例子包括金属硫蛋白启动子和小鼠乳癌病毒(mammary tumor virus)启动子。依赖于载体，平滑肌细胞中DNA序列的表达可通过在细胞生长周期的某些点上添加特定的化合物而诱导。可有效用于本发明的重组载体中的启动子和增强子的其他例子包括但不局限于CMV(巨细胞病毒)、SV40(猿猴病毒40)、HSV(单纯疱疹病毒)、EBV(EB病毒)、反转录病毒、腺病毒启动子和增强子，且优选地为平滑肌特异性启动子和增强子。平滑肌特异性启动子的一个例子是SM22α。优选的平滑肌特异性启动子是平滑肌α肌动蛋白(SMAA)。
[0044]本发明进一步提供了表达外源DNA序列的平滑肌细胞，该外源DNA序列编码参与调节平滑肌张力的钾通道蛋白质。如在此处所用的，“外源”指引入到生物或细胞中的任何DNA。含有外源DNA序列的重组载体向平滑肌细胞中的引入可通过本领域技术人员公知的方法来实现，如电穿孔、DEAE葡聚糖、阳离子脂质体融合、原生质体融合、DNA包被的微粒轰击、重组复制缺陷型病毒的注射、同源重组和通过如膀胱内滴注的裸露DNA转移。
[0045]在此处描述的DNA转移方法的任何一个均可进行组合。此外，在此处描述的方法可与其他策略进行组合以增加治疗功效同时降低剂量需要和减少副作用。例如，勃起机能障碍可用在此处公开的编码钾通道蛋白质的DNA转移方法与应用如VIAGRA^的口服疗法组合进行治疗。
[0046]本发明在下面实验细节部分的实施例中进行描述。该部分是为了有助于对本发明的理解，而不应该理解为以任何方式限制如在其后伴随的权利要求中限定的本发明。
实验细节
应用不同钾通道亚型和平滑肌特异性启动子的勃起机能障碍基因转移
[0047]不同钾通道亚型恢复勃起能力的功效是在年老的种畜大鼠中证明的，该大鼠用电压依赖性钾通道蛋白质Kv1.5、小电导的钙敏感性钾通道蛋白质SK3和大电导的钙敏感性钾通道蛋白质maxi-K与平滑肌特异性启动子组合转染的。
[0048]之所以选择大鼠用于基因转移研究，是因为大鼠阴茎在功能上、组织学上和药理学上显示与人类阴茎相似(Lesson等人，Investigative Urology，3(2)：144-45，1965)。在许多公知的模型中，大鼠对于研究阴茎勃起(Lesson等人，Investigative Urology，3(2)：144-45，1965；Quinlan等人，J.Urol.，141(3)：656-61，1989；Chen等人，J.Urol.，147：1124-28，1992；Martinez-Pineiro等人，EuropeanUrology，25：62-70，1994)以及神经原性和糖尿病性阳萎(Rehman等人，Am.J.Physiol.，41：H1960-71，1997)是极好的。
[0049]下面描述的研究应用由海绵体神经(CN)的电刺激引起的体内压力(ICP)作为勃起能力的量度。CN刺激模型的有效性已在如下研究中得到证明，该研究显示转染maxi-K后用电CN刺激或对脑的视前内侧区的电刺激获得了相似的结果(Sato等人，J.Urol.，163(4)：增刊，第198页，2000)，或者在对化学药品(脱水吗啡)引起的觉醒的动物中ICP的变化的反应中得到证明(Sato等人，J.Urol.，165(5)：增刊，第220页，2001)。
1.一般实验程序
[0050]应用年老的种畜Sprague-Dawley大鼠(体重500-700g)。所有大鼠均随意饲喂Purina实验室鼠类食品，并以07:00-19:00的光照周期在单独的棚舍中饲养。
[0051]如下所述将编码钾通道蛋白质的DNA注射入麻醉的大鼠海绵体中。注射后1周，将大鼠再次麻醉，并进行实验规程以调查是否可获得与阴茎勃起相当的海绵体内压力(ICP)的变化。
[0052]大鼠是通过腹膜内注射戊巴比妥钠(AnproPharmaceuticals)而麻醉的。如果需要可通过随后每45-60分钟注射戊巴比妥(5-10mg/kg)而在实验过程中(2-3小时)维持麻醉。
[0053]实验规程的手术准备和压力监控插管的放置：麻醉的动物是以仰卧姿式放置的。通过中线腹部切口暴露膀胱和前列腺。在左侧的颈动脉中插入动脉线以连续地监控血压(BP)。将右侧外颈静脉线用于静脉内流体转输或血液采样。海绵体神经位于前列腺的后侧面，源自由胃下区和骨盆神经结合形成的骨盆神经节。将神经刺激探针置于海绵体神经周围以进行电流刺激。两个原体(corpora)通过两侧的腹股沟阴囊切口和阴茎显露法而暴露。为了监控体内压力(ICP)，将充满250U/ml肝素溶液的23-规格套管与PE-50管(Intramedic，BectonDickinson)连接并插入到右侧海绵体中。
[0054]两个压力线BP和ICP均与压力传导器连接，该传导器依次通过传导器放大器(ETH 400 CB Sciences，Inc.)与数据获取板(MacLab/8e，ADI Instruments，MA)连接。对压力测量的实时显示和记录是在Macintosh计算机上进行的(MacLab软件v3.4)。压力传导器和数据获取板是用厘米H₂O柱校正的。
[0055]对海绵体神经进行的神经刺激和体内压力的记录：对海绵体的直接电刺激是用不锈钢双极钩形电极进行的。每一个探针直径均为0.2mm；两个电极间隔1mm。单相矩形脉冲是由信号生成器(定制的，具有内置的恒流放大器)释放的。刺激参数如下：频率，20Hz；脉冲宽度，0.22msec；持续时间，1分钟。目前的规程涉及以如下间隔增加的电流的应用：0.5、1、2、4和6mA。体内压力和全身血压中的变化是在每一个神经刺激水平上记录的。
[0056]对每一个神经刺激水平的统计学比较进行One WayANOVA，并将Fisher’s Protected Least Significant Difference test用于Post-hoc逐对比较。在P＜0.05时，所有差异均认为是显著的。数据表示为平均数(±S.E.M)。
[0057]通过将体内压力的变化表示为全身平均血压的函数(表示为ICP/BP)，然后将该比例作为神经刺激大小的函数进行绘图来生成刺激-反应曲线以阐明神经刺激对体内压力的作用。所有数据均用Macintosh计算机的Sigma Plot软件进行绘图(Sigma Plot，JandelScientific，San Rafael，CA)。
2.利用Kv1.5和SK3钾通道亚型的实验
[0058]Kv1.5是在许多可兴奋细胞中发现的电压敏感性K通道超家族成员之一的电压依赖性钾通道(Hille，Ion Channels of ExcitableMembranes，Sinauer Associates，Inc，Sunderland，MA，2002)。Kv1.5已显示存在于大鼠身体组织中(Archer，Vascul.Pharmacol.38：61-71，2002)。钾通道SK3是在可兴奋细胞中发现的小电导的钙敏感性钾通道家族的一个同种型(Hille，见上文；Herrera & Nelson，J.Physiol.541(Pt 2)：483-92，2002)，该可兴奋细胞包括平滑肌(Ro等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281(4)：G964-73，2001)。SK3未显示存在于大鼠或人身体组织中。
[0059]材料与方法：克隆入质粒pBF中的编码大鼠SK3的DNA从Dr.John Adelman获得(Kohler M.等人，Science 273(5282)：1709-14，1996)。编码人Kv1.5的DNA是由本发明者克隆的。将克隆的编码Kv1.5的DNA插入到pVAX表达载体(Invitrogen)中，该载体为3.0-kb的质粒载体。pVAX1是通过对pcDNA3.1进行修饰以使其应用卡那霉素代替氨苄青霉素进行选择而构建的，从而避免了当注射入人体中时对青霉素敏感性的潜在缺陷。也去除了对于在大肠杆菌(E.coli)中复制或重组蛋白质表达非必需的序列。基因Kv1.5是应用特定引物通过PCR分离的。它首先克隆入pCR2.1-TOPO中以进行测序，然后用HindIII X BamH I限制位点亚克隆入pVAX(Invitrogen)中，对该pVAX用碱性磷酸酶进行处理以减少背景。将100μg pVAX/Kv1.5(n＝5)或pBF/SK3(n＝6)注射入麻醉的大鼠的海绵体中。注射后1周，在所有大鼠上进行尿道海绵体测量法(cavernosometry)。将在处理的大鼠中获得的反应与仅用载体(即具有20％蔗糖的磷酸缓冲盐溶液)注射的年龄匹配对照(AMC)大鼠中获得的反应进行比较。
[0060]结果：实验结果在图1中显示。如图所示，在应用Kv1.5或SK3通道亚型的基因转移实验中海绵体神经刺激的海绵体内压力(ICP)反应在大多数神经刺激水平上显著地大于年龄匹配对照(AMC)中的(即≥1.0mA)。应用Kv1.5或SK3通道亚型的基因转移产生了与阴茎平滑肌足够的松弛相当的海绵体内压力(ICP)对血压(BP)的比例，从而确保足以进行交媾(性交)的阴茎勃起。＞0.6的ICP/BP比例(图1中水平的虚线)足以确保勃起(Melman等人，J.Urol.170(1)：285-90，2003年7月)。
3.应用maxi-K钾通道与平滑肌特异性启动子的实验
[0061]材料与方法：该实验是为了当maxi-K与高效病毒启动子或平滑肌特异性启动子偶联时对钾通道蛋白质maxi-K在恢复勃起能力中的功效进行比较而进行的。用于这些实验中的平滑肌特异性启动子是平滑肌α肌动蛋白(SMAA)(Cogan等人，J.Biol.Chem.270：11310-21，1995)。所用的一般病毒启动子为巨细胞病毒(CMV)。pCMVβ和pcDNA3质粒购自Invitrogen(San Diego，CA)。人hSlo(maxi-K的α-或孔形成性亚基)的cDNA从Dr.Salkoff获得(Washington University School of Medicine，St.Louis，MO)(McCobb等人，American Journal of Physiology，269：H767-H777，1995)。hSlo cDNA的核苷酸序列也可从GenBank Accession No.U23767获得。将人maxi-K通道cDNA(长度约3,900核苷酸，或3.9kb)(McCobb等人，American Journal of Physiology，269：H767-H777，1995)插入到pcDNA3载体的Xho I-Xba I克隆位点，在该位点表达是由巨细胞病毒CMVβ启动子(Invitrogen)驱动的。在载体SMAA/EYFP(来自John Szucsik，Medical Center of Cincinnati，美国)中，将EYFP去除并将hSlo插入到其位置以得到质粒SMAA/hslo。pSMAA/EYFP本身是通过将SMAA启动子序列插入到商业上从Clontech购得的EYFP载体中而源自pSMP8的(由Cogan等人，J.Biol.Chem.270：11310-21，1999描述)。质粒SMAA/hslo从SMAA启动子表达hslo且具有与在pVAX中发现的相同的卡那霉素抗性基因。将100μg pVAX/hslo(n＝7)或SMAA/hslo(n＝5)注射入麻醉的大鼠的海绵体中。同样在体外用不同的细胞类型进行了实验以证明SMAA/hslo的特异性。
[0062]结果：SMAA/hSlo特异性地在体外培养的人corporalsmooth muscle细胞中表达，但不在非平滑肌细胞类型即常用的细胞表达系统人胚肾(HEK)细胞中表达。这些数据证明了人平滑肌细胞中SMAA/hSlo表达的选择性。
[0063]如图2所示，体内用两类启动子向海绵体中的基因转移均产生了与勃起相当的ICP/BP比例；即ICP/BP比例＞0.6。因而，在两种情况下该变化不仅是统计学显著的，而且它们是生理学相关的。平滑肌特异性载体的应用可产生与应用高效病毒启动子等价的作用。
4.一般讨论
[0064]本发明提供的基因转移方法是利用如下事实设计的，即收缩和松弛刺激之间的平衡中相对微小的改变可导致平滑肌张力和功能中的巨大变化(Christ等人，British Journal of Pharmacology，101(2)：375-81，1990；Azadzoi等人，J.Urol.，148(5)：1587-91，1992；Lerner等人J.Urol.，149(5.2)：1246-55，1993；Taub等人，J.Urol.，42：698，1993；和Christ，G.J.，Urological Clinics op North America，22(4)：727-45，1995)。基因转移的目的是在外源基因表达后恢复收缩和松弛刺激之间的正常平衡，该外源基因编码平滑肌中生理学相关的钾通道蛋白质。根据人类中勃起和膀胱机能障碍的多因素特性，事实上在恢复勃起能力或膀胱功能中多种不同的遗传治疗策略均将是有效的。转染的钾通道蛋白质的表达如检验所示可维持6个月长的时期(Melman等人，J.Urol.170(1)：285-90，2003年7月)。因而，患者在该时间段内在不存在任何其他外源操作时可获得“正常的”勃起或“正常的”膀胱功能。这很明显的是比所有其他目前可用的策略更大的进步。事实上，尿殖器官的可接近性和平滑肌张力中微小的改变可引起许多方面的人类尿殖疾病的事实均提供了应用基因转移治疗尿殖病症的清楚的优点。
[0065]研究已显示来自主要钾通道家族的钾通道亚型在增强阴茎平滑肌的松弛中是有效的。特定地，检验的钾通道是小电导的钙敏感性SK3(图1)、大电导的钙敏感性maxi-K(美国专利No.6,150,338)、电压依赖性Kv1.5(图1)和内向整流K_ATP(美国专利No.6,271,211 B1)钾通道。总之，前述数据与如下推测一致，即在单独体内注射编码钾通道蛋白质的DNA后，在corporal smooth muscle细胞的一些部分由于更大数目K⁺通道的存在而可导致增加的钾通道活性。反过来，这将导致对于任何给定水平的内源或外源刺激的更大的超极化，并可能改变细胞内的钙转移/稳态，从而促进更大的corporal smooth muscle松弛。可以合理地认为，应用人K⁺通道cDNA对平滑肌细胞的相对稳定的转染代表了在治疗平滑肌病症中对平滑肌张力的分子操作的重要和生理学相关的策略，该病症如勃起机能障碍和膀胱机能障碍。
[0066]本申请也证明应用平滑肌特异性启动子的钾通道蛋白质基因转移能够以基本上与用更普遍的病毒启动子观察到的相同的方式恢复勃起能力。然而，与非组织特异性的启动子相反，含有平滑肌特异性启动子的载体的应用可对平滑肌病症治疗的基因转移方法赋予额外的安全优点，这对于人的治疗显然是有利的。
[0067]在上文中引用的所有出版物和参考文献均在此处整体引入到本说明书中作为参考。