利用FCA基因RNA结构域转基因改良作物经济性状的方法.pdf

本发明属于基因技术领域，具体为一种利用控制开花基因FCA的RNA结构域转基因改良作物经济性状的方法。具体是将FCA全长基因所编码的蛋白质中一个或几个完整结构域的编码顺序转化目标植物。本发明将rFCA－1全长基因覆盖的RRM2结构域区段，采用PCR方法将扩增，合成插入组成型表达载体pB1/520，并转化粳稻品系中花11。转基因的To植株及T1子代均表现出涉及株型、叶型、籽粒大小及重量的明显改变。本发明可广泛应用于双子叶和单子叶作物的经济性状的改良。

1、  一种改良作物经济性状的转基因方法，其特征在于将全长基因所编码的蛋白质中一个或几个结构域顺序进行克隆，并将其插入到植物转基因表达载体的调控顺序下游用于转化目标作物，以获得可利用的改良的经济性状.

2、  根据权利要求1所述的改良作物经济性状的转基因方法，其特征在于用于转基因的DNA顺序为水稻开花控制基因rFCA表达产物全长cDNA中一个或几个完整结构域编码序列。

3、  根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述开花控制基因rFC4全长cDNA中结构域为rFCA-1全长cDNA的RRM2结构域，其序列为SEQ.NO.3。

4、  根据权利要求3所述的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)选择rFCA全长cDNA中覆盖RRM2结构域的区段SEQ.NO3，合成含有与表达载体多克隆位点EcoRI/BamHI匹配的接头及RRM2两侧序列的引物，采用PCR方法将其扩增，并连接到表达载体pBI/520中，获得rFCA-RRM表达载体pBI/520/rFCA-RRM2；
(2)水稻愈伤组织诱导与处理；
(3)基因枪转化；
(4)转化愈伤组织筛选；
(5)水稻rFCA基因RRM2结构域转化植株筛选与分子检测。

利用FCA基因RNA结构域转基因改良作物经济性状的方法
技术领域
本发明属转基因技术领域，具体涉及一种利用控制开花基因(FCA)的RNA结构域转基因改良作物经济性状的方法。
背景技术
目前国内外利用转基因改良作物经济性状的技术与方法，主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良。这一方法利用的基因都是来自天然的具有完整结构的基因序列或具有完整编码顺序的cDNA。采用天然基因的某一结构成分改良作物的经济性状目前尚无报道，对其所具有的潜力也未进行探讨和评价。
本发明尝试采用功能基因的某一结构域的编码顺序，利用转基因方法将其克隆到表达载体，然后导入农作物细胞，以期获得重要经济性状发生改良的转基因再生植株。希望通过这一方法扩大功能基因转基因的利用范围，达到常规转基因方法难以产生的在生产上可以利用的效果。
参考文献：
(1)王关林，方宏筠：植物基因工程的目的基因，in：植物基因工程原理与技术，pp：1-20，科学出版社，1998.
(2)Macknight，R.，Bancroft，I.，Page，T.，et al.(1997)FCA，a gene controlling floweringtime in Arabidopsis，encodes a protein containing RNA-binding domains.Cell.89：737-745。
(3)Macknight，R.，Duroux，M.，Laurie，R.，et al.(2002)Functional significance of thealternative transcript processing of the Arabidopsis floral promoter FCA.Plant Cell.14：877-888。
发明内容
本发明的目的在于提出一种利用基因片段或功能域转化改良作物经济性状的转基因方法。
本发明提出的改良作物经济性状的转基因方法，是将全长基因所编码的蛋白质中一个或几个完整结构域的编码顺序进行克隆，并将其插入到植物转基因表达载体的调控顺序下游，用于转化目标植物。其中，基因片段转化的程序与一般常用的方法相同，可以采用农杆菌介导转化或基因枪微弹轰击法转化宿主细胞，在构建表达载体时需要保证结构域的翻译读框的正确，使其编码的多肽链与天然的相对应的氨基酸顺序相同。
本方法与经典的转基因改良作物经济性状的不同之处在于，利用功能基因的某一结构域转化目标植物，在组成型启动子的控制下，基因功能域的表达也可以干扰细胞内其它基因的表达模式，引起宏观性状的改变，可产生全长基因转化所不能产生的大量表型变化，包括重要的经济性状。
本发明在对FCA基因功能的研究中，已证实该基因的突变和过表达仅与双子叶拟南芥(Arabidopsis)的开花时期有关，尚无关于FCA三个结构域(RRM1，RRM2和WW)的独立功能的报道。本发明实验证实，FCA的RRM2功能域在独立表达时具有除延迟开花以外的功能，可对植物形态发生特别是对籽粒形成与发育产生重要影响。RRM2所表现出来的这种功能可以用来改良农作物或经济作物的许多重要经济性状。由于在双子叶和单子叶植物中均存在FCA基因，并且该基因在双子叶和单子叶植物中具有很高的保守性。因此这一方法对双子叶和单子叶作物均有效果，即可以改良其它双子叶和单子叶作物的经济性状，如增加果实重量，提高谷类作物如小麦，玉米，高粱，大麦的籽粒千粒重，提高棉花的纤维长度等，也可用于改变花卉的叶型和花朵形状，提高观赏价值，以及改变植物纤维的品质和产量。
本发明选择水稻等的FCA进行了研究。发明人曾从水稻分化愈伤组织和未分化愈伤组织差减杂交库(SSH)中分离到一个与双子植物拟南芥控制开花的基因FCA(flowering controlactivator)同源的cDNA片段，然后根据搜寻到的水稻基因组顺序进行基因注解。根据注解的全长cDNA设计PCR引物，从籼稻珍汕97三叶期幼苗叶组织mRNA提取物中分离与克隆到全长的cDNA，将其命名为rFCA(水稻开花控制基因)。
RT-PCR分析发现rFCA在水稻叶片组织中存在4种可变剪接cDNA序列，分别命名为rFCA-1、rFCA-2、rFCA-3和rFCA-4。rFCA的四个不同的可变剪接cDNA序列已在GenBank登录，登录号分别为：AY274928，AY311343，AY311344，AY331574，并将它们依次命名为rFCA-1，rFCA-2，rFCA-3，和rFCA-4。
其中，rFCA-1的cDNA长度为2517bp，编码738个氨基酸。它与拟南芥FCA-gamma具有很高地同源性。图3表示的是rFCA-1基因结构及其蛋白质结构域，它具有与拟南芥FCA同样的保守区段，它在氨基酸残基122-207和214-302是RRM(RNA结合区)，分别记为RRM1和RRM2；氨基酸残基610-642是WW-domain。通常情况下，RNA结合区周围具有一些富含某些特殊氨基酸的区域，如Proline、Glycine、Glutamine、Serine等，这些区域有助于蛋白与目标RNA的互作。
本发明选择水稻rFCA-1基因全长cDNA中覆盖RRM2结构域的编码顺序，采用PCR方法将其扩增，然后按正确的翻译读框插入到植物转基因表达载体pBI/520的EcoRI和BamHI位点之间。RRM2为RNA结合域，涉及到基因的转录后调控。在植物的不同种属中，RRM2顺序有很高的保守性，同一些基本的生物学过程的调控有关。由于插入的RRM2结构域处于组成型启动子Act-1下游，可在转化细胞中过量表达，可干扰或促进转化植株的生长与发育。本发明采用的受体植株为粳稻品系中花11，这是国内水稻转基因研究普遍使用的材料。经RRM2结构域转化再生的中花11，经DNA分子检测确定为阳性植株后，将其移载到田间。转化的T0代植株成株后表现出茎杆粗硬，叶片厚实，颜色深绿，小穗(籽粒)增大等明显的性状改变。转基因T1代的二叶期幼苗出现小苗粗壮，叶片增宽等特征。
本发明中，所选用的rFCA-1基因的RRM2结构域长330bp，其DNA序列见SEQ.ID.NO3，其预期RRM2结构域翻译产物为102个氨基酸多肽，其序列见SEQ.ID.NO4。
采用组成型启动子和组织专一性启动子控制水稻rFCA的RRM2区段的表达，可以达到有针对性提高产量的目的。
水稻rFCA结构域RRM与双子叶植物拟南芥FCA结构域的对比见下表所示。显示两者之间存在很高的相似性。
Sequence 0：拟南芥FCA结构域RRM1和RRM2
Sequence 0：水稻rFCA结构域RRM1(124-184 a.a)和RRM2(220-280 a.a)
Sequence 0 121182
Sequence 1 123184
Sequence 0 183244
Sequence 1 185246
Sequence 0 245306
Sequence 1 247307
水稻rFCA结构域RRM编码顺序转基因再生株和对照植株在相同培养和栽培条件下均可正常结实.转基因植株的抽穗期较对照晚5-7天。在转基因再生株和对照植株籽粒灌浆成熟后分别收集种子，在自然干燥后称重。RRM转基因植株种子千粒重为38克，对照为22克，增重73％。转基因T0代和对照种子的实物照片见图1所示。
水稻rFCA结构域RRM编码顺序转基因再生株和对照植株除了种子大小不同之外，株型和叶型及叶片质地也存在很大差异，主要表现在：：
(1)叶片变宽缩短增厚；
(2)叶色变为深绿色；
(3)植株的茎杆变粗；
(4)转化株有效穗提高，无效分蘖减少。
对比见图3所示。
附图说明
图1为本发明的转基因To代和对照种子的实物照片。
图2为RRM2转基因再生植株(图左)和对照中花11(图右)株型照片比较。
图3为rFCA结构域组图示。
图4为rFCA的RRM2结构域转基因表达载体的物理图。图中除RRM2顺序外，其它顺序均与原载体pBI/520相同。其中：载体名称，pB1/520；ActI-5’，植物肌动蛋白基因启动子顺序；rFCA-RRM，水稻rFCA基因RRM结构域编码顺序；Pin2-3’，3’结尾顺序；35S-5’，花揶菜病毒CMV启动子；Bar，抗除草剂基因；Nos-3’，3’结尾顺序。
具体实施方式
下面以水稻为例，进一步描述本发明。
水稻rFCA基因RRM2结构域转基因的方法与程序：
1、选择rFCA全长cDNA中覆盖RRM2结构域的区段SEQ.NO3，合成含有与表达载体多克隆位点EcoRI/BamHI匹配的接头及RRM2两侧序列的引物，采用PCR方法将其扩增，并连接到表达载体pBI/520中(表达载体pBI/520由澳大利亚CAMBIA(Center of theApplication of Molecular Biology to International Agiculture)中心提供)。获得rFCA-RRM表达载体pB1/520/rFCA-RRM。其物理图谱见图4所示。Act1为水稻肌动蛋白启动子，控制基因组成型表达。Pin2-3为基因转录终止区，含转录终止信号。35S为来自花椰菜病毒的启动子，Bar为抗除草剂基因。Nos为来自农杆菌Ti质粒的转录终止信号。XhoI、HindIII、EcoRI、BamHI、XbaI、PstI为限制性内切酶位点。rFCA-RRM2为插入的转基因编码顺序，其两侧位点为EcoRI和BamHI。
2、诱导水稻愈上组织培养基
(1)诱导及继代培养基：MS+2mg/L 2，4-D。
(2)高渗培养基：MS+2mg/L 2，4-D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇。
(3)第一轮筛选培养基：MS+2mg/L 2，4-D+30mg/L潮霉素。
(4)第二轮筛选培养基：MS+2mg/L 2，4-D+50mg/L潮霉素。
(5)分化培养基：MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+50mg/L潮霉素。
(6)生根壮苗培养基：1/2 MS+0.1mg/L NAA
说明：
(1)以上培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/L agar，pH5.8
(2)愈伤诱导、继代、筛选培养条件为26-28℃暗培养，分化、生根壮苗为26-28℃及16小时光周期
3、愈伤组织诱导与处理
(1)取授粉后12-15天的未成熟种子，在无菌条件下，先用70％乙醇浸洗10min，转入0.1％升汞浸泡20min，无菌水清洗3次。
(2)在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上，26-28℃暗培养约20天后切芽，继代一次。
(3)在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤约30-50块(每块3mm左右)，置于高渗培养基上中央，排成直径约2.5cm的圆圈内，培养约4-5h后用于转化。
4、基因枪转化
(1)基因枪：从宁波新芝科技有限公司购置的高压气体基因枪，型号：GJ-1000。
(2)微粒子弹制备
①称取60mg钨粉(直径约1um)，加入到1.5ml灭菌离心管中，再加入1ml无水乙醇，振荡1min，于10000rpm离心10s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮于1ml无菌水中现用或-20℃保存。
②吸取50ul钨粉悬浮液于1.5ml离心管，依次加入5ug DNA、50ul 2.5M CaCl₂、20ul 0.1M亚精胺，振荡5分钟，10000rpm离心20s，弃上清，以140ul无水乙醇漂洗两次，加入60ul无水乙醇，悬浮待用。
(3)轰击受体材料
①将基因枪放于超净工作台上，用70％酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、金属挡网(均由宁波新芝科技有限公司供货)于70％酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸吸干或吹净残余酒精。
②打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀。
③将可裂膜装入固定、旋紧。
④取10ul包被DNA的钨粉无水乙醇悬浮液，均匀涂布于载粒膜中心，放在超净台上吹干。
⑤将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下。
⑥将培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央。
⑦打开气瓶，调节压力1100Psi。
⑧抽真空，当真空度达到需要值时，将VAC键转到Hold位置。
⑨轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90度后进行第二次轰击)，按放气键使真空表读数回零，取出样品，轰击后于高渗培养基上继续培养12-16h。
5、转化愈伤组织筛选
(1)将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天。
(2)将愈伤转到含30mg/L潮霉素的筛选培养基上，均匀摆放，暗培养14-17天进行第一次抗性筛选。
(3)将抗性愈伤转入含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，暗培养8-12天进行第二次抗性筛选。
6、水稻rFCA基因RRM2结构域转化植株筛选与检测
(1)转化试管苗分子检测
①将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天。
②待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室。
7、转化植株的分子检测
分别采用PCR扩增和基因组Southern杂交杂法检测后选的转化植株，共获得两株含有转化的rFCA-RRM片段的阳性植株
序列表：
SEQ.ID.NO1，rFCA-1的cDNA全序列如下：
  1  gtgctctcgc aaaaccctag cccacctccc cctccaccca catgcaccgc ggcggcgacc
 61  gctccaccga cccctcctcc ggccccgcgc ccggttctcg cggcggcggg gacggccgat
121  tcggccgcgg cccttctcgc tggtcgtccg gcggtggcgg cggcggtagc ggcagcccac
181  cccaccgctt ctcccgtggt gggggtgggg gcggcggcga cggtggcgga ggcggaggtg
241  gaggcgggag gttccacccg taccgtggcc cttcggacca ctccggcggc ggaggctaca
301  gaagcggcgg cggcggcgag tacggggagc cgggtagcgg gccgagacac cgctacggca
361  gtggccgtgg tgaccactca gatcatgata acagaaacaa ctatgttaaa ctttttattg
421  ggtcagttcc aaggacagcg actgaggatg atgtacgtcc tttatttgag gagcatggag
481  atgttgttga agttgctttg atcaaggata ggaagactgg tgaacagcaa ggttgttgtt
541  ttgttaaata tgctacttct gaagaggctg agcgagccat cagagctctt cacaaccagt
601  acactttacc tggggcaatg ggccctattc aagtcagata tgctgatggt gaaagggaac
661  gccatggggc tattgagcac aagctgtttg tcgcatcact caataagcaa gctactgcga
721  aggagattga agagattttt gcgccgtatg gtcatgtgga agatgtctac attatgaaag
781  atggcatgag gcagagccga ggttgtggct ttgtcaaatt ctcatcacga gaaccggcgc
841  tggcagccat gagtgctctg agtgggaatt atgtaatgag ggggtgcgag caaccattaa
901  taattcggtt cgctgatcct aagagaccta gacctggaga atcaaggggt ggtcctgcat
 961  ttggaggtcc tggtttcagt ccacgatctg atgcagctct tgttatcagg ccgaccgcca
1021  accttgatga accaaggggt cggcatatgc ctcctgactc ttggcatcca tcaagcccaa
1081  ggtcagcacc tcatcagttt aataactttg gatctgacaa tcctatggct ccgaaaggga
1141  gtactgttac atcaacaaca gatacggcca cttttcgacc tcagatgttc agcggaaatg
1201  gctctttgtc aagccaaaca gctgtgccaa gttcgtcaca tatgggcatg aaccctcctc
1261  ccatggcaca aggccatcat ctgggaggcc agcagatccc acctttgcaa aagctaccag
1321  ggttgcctca gaatttccct gttcaattgc agaataatca gctgggacaa cccttgcagg
1381  gtcctgctca acagattggt cagcttcaag ttccacaatc tatgggtcct ggttcttttg
1441  gccagaatag gttatctggt cagcttcctg tgtcacagcc gttgatgcaa caaaatgctt
1501  ccgtcagcgc tgtgcaggtg ccttcagccg tgtccaattc catgcaagct attcccgggc
1561  aacagcatct tccctcaaat gttgcaccac aaatgcttca gcagccagtg cagcagatgc
1621  catcgcaagc accacaattg ctactccaac agcaagctgc tttgcaatcc agttatcaat
1681  cttcacagca ggcaatttat cagcttcaac aacagctgca actaatgcag cagcagcagc
1741  aatcgaatct aaaccatcaa caacccacac agggtcagcc agtgcaatct agtaaccctg
1801  gtgccccaaa tgccattatt ccatcaaaca ttaatacaat tccccagcag gctacttcac
1861  ctgcagttcc tttaacctgc aattggactg aacatacgtc tcctgaaggt tttaaatact
1921  actacaatag cataactcga gagagtaagt gggataagcc tgaagagtat gtgctgtatg
1981  agcaacagca acagcagcag caacagcaga aactactttt gcttcaacag caccaacaaa
2041  aacttgccat gcagcaactt cagtcaccac ctcaggctca gacacatcca gcaatgcaac
2101  ctgtccaaca aattcctcag gcacaacaag gacagcaaca aatgcagatg aaacagcagg
2161  aattgaatta tactcagcta cagactcctg gtgctattga tcccagtagg atacaacagg
2221  gcatccaatc tgcacaagaa cgtgcttgga aaagttgaga ctgaaggtga atgataaatt
2281  ggtaagctgt tactcggaaa tgagctccac tcaacctgct gcctccatca aatgccttga
2341  cggtgcctga tgcctgagtg gtggccaagc ggccatgccg atcgttgtaa ctctggatat
2401  agcttagatt gatgtctaaa aagttgtagc tccaatccgt gtaaaatgtt tgcagtctag
2461  gccttgtacc gctgtaacat ttctgctgat tagaatgttc gctttccttg cataggcaaa
2521  aaaaaaaaaa aaaaaaaa
SEQ.ID.NO.2，rFCA-1蛋白质顺序如下：
MHRGGDRSTDPSSGPAPGSRGGGDGRFGRGPSRWSSGGGGGGSGSPPHRFSRGGGGGGGDGGGGGGGGGRFHPYRGPSDHSGGGGYRS
GGGGEYGEPGSGPRHRYGSGRGDHSDHDNRNNYVKLFIGSVPRTATEDDVRPLFEEHGDVVEVALIKDRKTGEQQGCCFVKYATSEEA
ERAIRALHNQYTLPGAMGPIQVRYADGERERHGAIEHKLFVASLNKQATAKEIEEIFAPYGHVEDVYIMKDGMRQSRGCGFVKFSSRE
PALAAMSALSGNYVMRGCEQPLIIRFADPKRPRPGESRGGPAFGGPGFSPRSDAALVIRPTANLDEPRGRHMPPDSWHPSSPRSAPHQ
FNNFGSDNPMAPKGSTVTSTTDTATFRPQMFSGNGSLSSQTAVPSSSHMGMNPPPMAQGHHLGGQQIPPLQKLPGLPQNFPVQLQNNQ
LGQPLQGPAQQIGQLQVPQSMGPGSFGQNRLSGQLPVSQPLMQQNASVSAVQVPSAVSNSMQAIPGQQHLPSNVAPQMLQQPVQQMPS
QAPQLLLQQQAALQSSYQSSQQAIYQLQQQLQLMQQQQQSNLNHQQPTQGQPVQSSNPGAPNAIIPSNINTIPQQATSPAVPLTCNWT
EHTSPEGFKYYYNSITRESKWDKPEEYVLYEQQQQQQQQQKLLLLQQHQQKLAMQQLQSPPQAQTHPAMQPVQQIPQAQQGQQQMQMK
QQELNYTQLQTPGAIDPSRIQQGIQSAQERAWKS
SEQ.ID.NO.3：
水稻rFCA基因RRM2结构域长330bp，顺序如下：
acactttacc tggggcaatg ggccctattc aagtcagata tgctgatggt gaaagggaac
gccatggggc tattgagcac aagctgtttg tcgcatcact caataagcaa gctactgcga
aggagattga agagattttt gcgccgtatg gtcatgtgga agatgtctac attatgaaag
atggcatgag gcagagccga ggttgtggct ttgtcaaatt ctcatcacga gaaccggcgc
tggcagccat gagtgctctg agtgggaatt atgtaatgag ggggtgcgag caaccattaa
taattcggtt cgctgatcct aagagaccta
SEQ.ID.NO.4：预期RRM2结构域翻译产物为102个氨基酸多肽：
MGPIQVRYADGERERHGAIEHKLFVASLNKQATAKEIEEIFAPYGHVEDVYIMKDGMRQSRGCGFVKFSSREPALAAMSAL
SGNYVMRGCEQPLIIRFADPKRP