持续释放的药学活性肽盐及其生产 【发明背景】
【发明领域】
本发明涉及药学活性多肽的药物组合物，它可提供多肽的长时间持续释放。
现有技术的描述
根据现有技术(WO98/25642)，要求专利保护的药物制剂包含肽化合物及载体大分子的稳定的水不溶性复合体，其中肽化合物(例如肽、多肽、蛋白质、模拟肽及其类似物)优选药学活性肽化合物，所述载体大分子允许体内施用复合体后可使肽化合物持续释放。根据现有技术，复合体可使药学活性肽化合物在受试者体内长时间(例如一个月)持续释放。而且，在紧密稳定的复合体中肽化合物及载体大分子的结合可使制剂中负荷有高浓度的肽化合物。
根据现有技术发明的复合体是通过将肽化合物与载体大分子在一定条件下组合而形成，以形成基本上水不溶性复合物，例如，将载体大分子与肽化合物的水溶液混合直至复合体沉淀。
复合体可为固体形式(例如，膏、颗粒、粉末或冻干物)或者复合体的粉末形式可以很细地粉碎，以足可形成稳定的悬浮液或半固体分散体。
在一个优选的实施方案中，水不溶性复合体的肽化合物是LHRH类似物，更优选地是LHRH拮抗物，载体大分子是阴离子聚合物，优选地羧甲基纤维素钠。所发明的复合体适于在体内施用前进行灭菌处理，如通过γ照射或电子束照射。通过给受试者施用所发明的含有LHRH类似物的组合物，提供了用LHRH类似物可治疗的病症之受试者的治疗方法。
现有技术存在的问题
生产要求专利保护的复合体必须制备相当高浓度的肽化合物水溶液(5-25mg/ml)。由于许多肽化合物固有地聚集倾向，使用要求专利保护的生产程序不能确保在纯水中可制备无聚集的溶液。取决于特定肽化合物的水溶性及用于制备该溶液的技术，水中浓缩的肽溶液可以是不聚集的，或者掺杂有多种浓度及不同类型的肽聚集体和沉淀。由于这种高浓度的肽溶液是制备要求专利保护的复合体的起始物质，肽化合物在水中的溶解显然是一个关键步骤。
通过将羧甲基纤维素钠的水溶液以不同比例(0.1∶1至0.5∶1w/w)加入至这种未充分定义及表征的高浓度肽溶液，可自发地以非限定及不受控制的方式形成复合体或沉淀。通过过滤或离心收集沉淀，用水漂洗并干燥。然后将固态物质用研钵及研棒研磨成粉状。再通过分析确定肽化合物的含量。因为生产过程，故不能保证能以可再重复的及充分定义的方式形成化学计量的复合体。
此外，加入羧甲基纤维素钠溶液(根据USP，其中含有6.5-9.5％的钠)会引起显著量的金属离子，即钠离子与肽化合物接触。肽及蛋白质在盐存在时可能会沉淀。因此现有技术描述的复合体或沉淀是由于通过肽化合物与羧甲基纤维素自身的官能团之间的相互作用而形成的，或仅仅是由于钠离子的肽沉淀作用而形成的，或这两个过程中未知的、不可控制的混合因素而形成的，对此尚不清楚。
将现有技术描述的肽制剂干燥及磨碎后悬浮于盐水中，此步骤也可导致进一步不合需要的、不受控制的相互作用过程。
发明概述
本发明提供的药物组合物包含稳定的、充分定义的、化学计量的盐，其中所述盐分别由酸性或碱性肽化合物(像肽、多肽蛋白质、模拟肽等)与离子型的、碱性的或酸性的载体大分子组成。体内施用特定肽化合物的盐后，可使肽化合物持续释放。
离子载体大分子可以是阴离子聚合物，例如阴离子多元醇、其衍生物或其片段。
此外，离子载体大分子可以是阴离子多糖、其衍生物或其片段。优选地，载体大分子是羧甲基纤维素。药物组合物中的载体大分子可进一步选自藻胶、藻酸、藻酸钠、阴离子乙酸聚合物类、离子型丙烯酸聚合物或异丁烯酸聚合物类及共聚物、果胶、西黄蓍胶、黄原胶、阴离子carageenan衍生物、阴离子多聚半乳糖醛酸衍生物、硫酸化及磺酸化聚苯乙烯、淀粉乙醇酸钠、其片段或其衍生物。
离子载体大分子也可以是白蛋白、明胶(A型或B型)、其片段或其衍生物。
阳离子聚合物也可以是多聚L-赖氨酸及其它碱性氨基酸的聚合物。
化合物中的肽是药学活性肽化合物，可以是单价、二价或多价阳离子或阴离子多肽，其中多肽长为5至100个氨基酸，优选地多肽长为5至20个氨基酸，更优选地多肽长为8至12个氨基酸。更详细地讲，肽化合物是LHRH类似物，并且LHRH类似物是LHRH拮抗剂。例如LHRH类似物有：西曲瑞利克斯(Cetrorelix)，Teverelix(Antarelix，Deghenghi等人，生物医学及药物疗法(Biomed &Pharmacother)，1993，47，107)，Abarelix(Molineaux等人，分子泌尿科学(Molecular Urology)，1998，2，265)，Ganirelix(Nestor等人，医学化学杂志(J.Med.Chem.)，1992，35，3942)，Azaline B，Antide，A-75998(Cannon等人，药学科学杂志(J.Pharm.Sc.)，1995，84，953)，Detirelix(Andreyko等人，临床内分泌代谢杂志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)，1992，74，399)，RS-68439，Ramorelix(Stoeckemann和Sandow，肿瘤研究与临床肿瘤杂志(J.Cancer Res.Clin.Oncol.)，1993.119，457)，Nal-Glu。上面提及的LHRH类似物的结构例如可在上面所引用的文献及下列综述中可查到：Behre等人，GnRH拮抗物：总览，诱导排卵第二届世界会议论文集，The Parthenon PublishingGroup Ltd，UK；Kutscher等人，Angew.Chem.1997，109，2240。
此外，进一步描述了制备此类盐的方法。
根据本发明，肽化合物的游离碱或游离酸是通过使用离子交换剂去掉反离子而制备的。同样载体大分子的游离碱或游离酸也是通过使用离子交换剂去掉反离子而制备的。随后，将新鲜制备的肽碱溶液或肽酸溶液的等价量分别与不含反离子的大分子载体溶液的等价量结合。例如，肽化合物与载体大分子之比(w/w)可以是1∶0.1，1∶0.213，1∶0.5，1∶2.13。在实施例1至4中描述了制备本发明的水不溶性复合体的条件及步骤的非限制性实例。
本方法可获得充分定义的、化学计量的肽化合物与反离子大分子的纯盐。这些纯盐不掺杂有其它离子，既没有阴离子(例如乙酸根)，也没有阳离子(例如钠离子)。
向受试者施用本发明的药物组合物后，可使肽化合物在受试者体内持续释放。持续释放的持续时间及程度取决于形成盐的肽化合物及载体大分子的浓度。
实施例1
按以下步骤制备西曲瑞利克斯∶CMC质量比为1∶0.1，相当于西曲瑞利克斯∶CMC之羧基的摩尔比为1∶0.48的西曲瑞利克斯-CMC-盐冷冻干燥物。在40g水中溶解0.22gNa-CMC(低粘度级羧甲基纤维素，Hercules)，加入3g离子交换剂(Amberlite)。搅拌20分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。在23.4g水中溶解2.21g乙酸西曲瑞利克斯，加入74.6g 96％的乙醇(v/v)。加入20g离子交换剂(Amberlite)。搅拌20分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。将过滤后的西曲瑞利克斯碱溶液边搅拌边加入不含钠的CMC溶液，产生澄清溶液。搅拌1小时后，该溶液在真空下挥发去掉乙醇，产生分散体。最后将分散体冷冻及冷冻干燥。
实施例2
按以下步骤制备西曲瑞利克斯∶CMC质量比为1∶0.213，相当于西曲瑞利克斯∶CMC之羧基的摩尔比为1∶1的西曲瑞利克斯-CMC-盐冷冻干燥物。在40g水中溶解0.426gNa-CMC(低粘度级羧甲基纤维素，Hercules)，加入5g离子交换剂(Amberlite)。搅拌25分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。在23.4g水中溶解2.21g乙酸西曲瑞利克斯，加入74.6g 96％的乙醇(v/v)。加入20g离子交换剂(Amberlite)。搅拌20分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。将过滤后的西曲瑞利克斯碱溶液边搅拌边加入不含钠的CMC溶液，产生澄清溶液。搅拌1小时后，该溶液在真空下挥发去掉乙醇，产生分散体。最后将分散体冷冻及冷冻干燥。
实施例3
按以下步骤制备西曲瑞利克斯∶CMC质量比为1∶0.5，相当于西曲瑞利克斯∶CMC之羧基的摩尔比为1∶2.41的西曲瑞利克斯-CMC-盐冷冻干燥物。在200g水中溶解1.1gNa-CMC(低粘度级羧甲基纤维素，Hercules)，加入15g离子交换剂(Amberlite)。搅拌20分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。在23.4g水中溶解2.21g乙酸西曲瑞利克斯，加入74.6g 96％的乙醇(v/v)。加入20g离子交换剂(Amberlite)。搅拌20分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。将过滤后的西曲瑞利克斯碱溶液边搅拌边加入不含钠的CMC溶液，形成溶液。搅拌1小时后，该溶液在真空下挥发去掉乙醇，产生分散体。最后将分散体冷冻及冷冻干燥。
实施例4
按以下步骤制备西曲瑞利克斯∶CMC质量比为1∶2.13，相当于西曲瑞利克斯∶CMC之羧基的摩尔比为1∶10的西曲瑞利克斯-CMC-盐冷冻干燥物。在400g水中溶解4.26gNa-CMC(低粘度级羧甲基纤维素，Hercules)，加入50g离子交换剂(Amberlite)。搅拌25分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。在23.4g水中溶解2.21g乙酸西曲瑞利克斯，加入74.6g 96％的乙醇(v/v)。加入20g离子交换剂(Amberlite)。搅拌20分钟后，用玻璃纤维滤器过滤除去离子交换剂。将过滤后的西曲瑞利克斯碱溶液边搅拌边加入不含钠的CMC溶液，产生混浊的分散体。该分散体搅拌1小时后，在真空下挥发去掉乙醇。最后将分散体冷冻及冷冻干燥。
实施例5
用等渗的林格溶液确定不同组成的肽碱∶CMC酸形成的不含钠的纯CMC-盐的溶解度。按照实施例1-4的步骤制备西曲瑞利克斯-CMC-盐。此外，使用无逆流(flow-through)系统对西曲瑞利克斯从这些不含钠的CMC-盐体外释放至林格溶液进行168小时监测。168小时后西曲瑞利克斯的释放量用该体外监测方法所用的西曲瑞利克斯剂量百分数来表示。 肽碱∶CMC (w/w)在林格溶液中的溶解度(μg/ml)168小时后在林格溶液中的体外释放量(％) 1∶0.1 3.5 23 1∶0.213 2.7 30 1∶0.5 17.5 63 1∶2.13 54 76
根据本发明的不含钠的CMC-盐的这些体外数据与根据现有技术(WO/98/25642)将同样质量比的肽与CMC用Na-CMC生产的西曲瑞利克斯复合体进行比较。肽碱∶Na-CMC (m/m) 在林格溶液中的溶解度(μg/ml)168小时后在林格溶液中的体外释放量(％) 1∶0.1 2.5 46 1∶0.253 1.5 48 1∶0.5 2 45 1∶2.13 2 17
肽CMC-盐中去掉钠及乙酸根离子导致这类制剂的体外行为(即溶解度和体外释放特性)明显改善。
根据现有技术的Na-CMC复合体在林格溶液中的溶解度很低，并且不能通过改变肽与Na-CMC的组分比而修饰。因此不能改善这类制剂中肽化合物的释放动力学。
相反，根据本发明制备的肽化合物的不含钠CMC-盐中，盐组分的质量比与它们的体外行为具有明确的依赖关系。在制剂中，增加不含钠CMC酸的百分比导致肽化合物在林格溶液中的溶解度明显增加。这样，可改善及控制从这些不含钠CMC-盐制剂中释放的肽化合物的释放动力学。因此，根据特定临床应用所希望的释放动力学，可制备具有适当释放模式的CMC-盐制剂。实施例6
制备根据实施例的1-4西曲瑞利克斯的不含钠CMC-盐，和根据现有技术的西曲瑞利克斯∶CMC具等价质量比的西曲瑞利克斯的Na-CMC-复合体。分别制备西曲瑞利克斯的不含钠CMC-盐悬液及西曲瑞利克斯的Na-CMC-复合体悬液，用单剂量的1.5mg/kg肌肉注射大鼠。在不同时间点检测血浆睾酮水平及血浆西曲瑞利克斯水平。此外，在睾酮抑制的末期处死大鼠。取剂量注射部位的肌肉，分析注射位点施用的西曲瑞利克斯剂量的残积物。
结果如图1所示。
西曲瑞利克斯-CMC-盐的绝对生物利用度在78％-111％的范围内，西曲瑞利克斯-Na-CMC复合体的生物利用度只有32％，这表明钠离子对依现有技术制备的制剂的特性存在负面影响。实施例7
根据本发明的西曲瑞利克斯的不含钠CMC-盐如前实施例所述均制备为冷冻燥物。将冷冻干燥物于含水介质中分散，以1.0mg/kg的剂量单剂皮下注射狗。在不同时间点检测血浆睾酮水平及血浆西曲瑞利克斯水平。结果如图2所示。